监测动物种群中病原体负荷的体外方法

摘要

本发明涉及用于监测禽类种群中至少一种病原体负荷的体外方法，该方法包括以下步骤：收集和合并源自禽类种群的排泄样本材料；将步骤(a)中获得的合并样本材料均质化；用水性缓冲溶液稀释并任选地稳定步骤(b)中获得的合并样本材料；裂解步骤(c)中获得的稀释样本材料中包含的细胞材料；从步骤(d)的裂解的样本材料中分离核酸材料；检测和定量步骤(e)中获得的核酸分离物中包含的至少一种病原体特异性靶基因或其功能片段；在连续的时间点重复步骤(a)至(f)；并且观察至少一种病原体特异性靶基因的量随时间的变化。

说明书

技术领域

本发明涉及用于监测动物种群中至少一种病原体负荷的体外方法。更具体地，本发明涉及用于监测动物种群中至少一种病原体的负荷随时间的变化的非侵入性方法。

背景技术

避免病原体感染或病原体污染对于牲畜的福利和性能至关重要。由于体重增加减少，饲料转化效率差，死亡率增加和更大的药物成本，由病原细菌菌种或病毒毒种或由病原单细胞真核生物引起的疾病导致经济损失巨大。

为了能够及早检测疾病并对疾病的早期迹象甚至症状作出有效反应，迫切需要在屠宰前(ante mortem)用于监测动物种群中的病原体负荷的快速且可靠的方法。

本发明提供了用于监测动物种群中至少一种病原体负荷的体外方法，该方法包括以下步骤：

(a)收集和合并源自动物种群的排泄样本材料；

(b)将步骤(a)中获得的合并样本材料均质化；

(c)用水性缓冲溶液稀释并任选地稳定在步骤(b)中获得的合并样本材料；

(d)裂解在步骤(c)中获得的稀释样本材料中所含的细胞材料；

(e)从步骤(d)的裂解的样本材料中分离核酸材料；

(f)检测和定量在步骤(e)获得的核酸分离物中包含的至少一种病原体特异性靶基因或其功能片段；

(g)在连续的时间点重复步骤(a)至(f)；和

(h)观察至少一种病原体特异性靶基因的量随时间的变化。

本发明的另一方面是根据本发明的方法的用途，所述方法用于确定饲料干预或医学干预的必要性，或者可替代地，所述方法用于控制饲料干预或医学干预的有效性。

另外，本发明提供了用于获得代表动物种群中总病原体负荷的合并排泄样本的方法，该方法包括：

(a1)将动物房或动物种群饲养区划分为均匀细胞的网格图案；

(a2)识别第一单元内的至少一个随机样本采集点，并在所述至少一个样本采集点采集一个第一样本；和

(a3)在每个单元内使用相同的相对样本采集点，依次采集其余单元中的个体排泄样本；

以及任选地

(a4)对至少一个重复样本重复步骤(a2)和(a3)。

本发明的特征在于用于监测动物种群中至少一种病原体负荷的方法。更具体地，本发明涉及用于监测动物种群中至少一种病原体负荷的体外方法，该方法包括以下步骤：

(a)收集和合并源自动物种群的排泄样本材料；

(b)将步骤(a)中获得的合并样本材料均质化；

(c)用水性缓冲溶液稀释并任选地稳定在步骤(b)中获得的合并样本材料；

(d)裂解在步骤(c)中获得的稀释样本材料中所含的细胞材料；

(e)从步骤(d)的裂解的样本材料中分离核酸材料；

(f)检测和定量在步骤(e)获得的核酸分离物中包含的至少一种病原体特异性靶基因或其功能片段；

(g)在连续的时间点重复步骤(a)至(f)；和

(h)观察至少一种病原体特异性靶基因的量随时间的变化。

术语“病原体特异性靶基因”是指病原种或亚种特异性的基因。

根据步骤(g)，将在连续的时间点重复步骤(a)至(f)。例如，在初步确定合并的排泄样本中至少一种病原体特异性标志基因的数量后，在收集和分析的测试样本以每周、每天或每小时的方式监测所述至少一种病原体特异性标志基因。在一个实施方案中，在连续的几天收集合并的排泄样本。可以从出生到屠宰每天都收集并分析排泄样本。

在家禽的一个特定实施方案中，在初始生长阶段(起始阶段，第5天到第10天)收集并分析第一合并的测试样本，在增强生长阶段(第11天到第18天)收集并分析第二合并的测试样本，以及任选地，在以后的阶段收集并分析第三合并的测试样本。

在替代实施方案中，在初始生长阶段收集并分析第一合并的测试样本，在增强生长阶段比如每天、任选地直到屠宰收集并分析进一步合并的测试样本。

“变化”是指所述至少一种病原体特异性靶基因的量的增加或减少。变化可少至1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％或少40％、50％、60％，或者甚至多至75％、80％、90％或100％。

合并的排泄样本中至少一种病原体特异性靶基因的量与动物种群中各个病原体的总负荷相关。所述至少一种病原体特异性靶基因的量随时间的增加指示病原体负荷的传播或进展。相反，至少一种病原体特异性靶基因的量随时间的减少表明病原体负荷消退(恢复/治愈)。

上述方法尤其适用于在野外条件下进行屠宰前诊断。

在本发明的上下文中，至少一种病原体是与通常在畜牧生产期间获得的感染有关的病原体。至少一种病原体可以是病原细菌菌种、病原病毒毒种和/或病原单细胞真核生物。

病原细菌菌种可以是例如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、沙门菌(Salmonella)的种、禽病原大肠杆菌的种、支原体的某些种(Mycoplasma spp.)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)和/或多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)。

病原病毒毒种可以是例如非洲猪瘟病毒、赤羽病病毒、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒、禽流感病毒、禽副粘病毒、禽痘病毒、蓝舌病毒、边界病病毒、牛短暂热病毒、牛副流感病毒、牛细小病毒、牛病毒性腹泻病毒、羊关节炎脑炎病毒、鸡贫血病毒、经典猪瘟病毒、马疱疹病毒、马传染性贫血病毒、马流感病毒、马病毒性动脉炎病毒、口蹄疫病毒、亨德拉病毒、疱疹病毒、传染性法氏囊病病毒、马立克氏病病毒、新城疫病毒、尼帕病毒、瘟疫病毒、狂犬病病毒、裂谷热病毒、牛瘟病毒、鲑鱼贫血病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪水疱病病毒、水疱疹病毒、水疱性口炎病毒和/或白斑病病毒。

病原单细胞真核生物为例如堆型艾美虫(Eimeria acervulina)、巨型艾美虫(E.maxima)、柔嫩艾美虫(E.tenella)、缓艾美虫(E.mitis)、早熟艾美虫(E.praecox)、毒害艾美虫(E.necatrix)、布氏艾美虫(E.brunetti)或鞭毛虫(Fagellates)，例如火鸡组织滴虫(Histomonas meleagridis)、Chochlosoma spp.。

根据本发明，可以单独地或同时地，即通过多重测试，监测上述病原体的负荷。

如本文所用，术语“动物种群”是指属于相同的种的一组动物个体。动物种群可以是例如在动物育种中出现的一组宠物或家畜，在畜牧生产或牲畜育种中出现的一组农场动物，或一组野生动物或动物园动物。

在一个实施方案中，动物种群是在畜牧生产过程中出现的动物群。例如，动物种群或动物群可以是禽类群；一群绵羊、山羊或牛，一群马或一群猪。

在一个特定的实施方案中，动物种群是禽类种群。

动物种群可以是禽类群。根据本发明的禽类群优选是家禽。根据本发明的优选的家禽是鸡、火鸡、鸭和鹅。可以对家禽进行优化以生产幼畜。这种类型的家禽也称为亲本动物和祖代亲本动物。因此，优选的亲本动物和祖代亲本动物是(祖代)亲本肉鸡、(祖代)亲本鸭、(祖代)亲本火鸡和(祖代)鹅。

根据本发明的家禽还可以选自观赏家禽和野禽。优选的观赏家禽或野禽是孔雀、野鸡、鹧鸪、珍珠鸡、鹌鹑、松鸡、鹅、鸽子和天鹅。根据本发明的进一步优选的家禽是鸵鸟和鹦鹉。根据本发明的最优选的家禽是肉鸡。

排泄样本材料可以选自垃圾样本、液体肥料样本或身体排泄物样本及其溶液/悬浮液。通常，术语“垃圾”是指动物排泄物与铺垫材料的混合物。更具体地，在本发明的上下文中，术语“垃圾”是指在围栏、笼或板条中发现的来自排泄物与铺垫材料的混合物。术语“液体肥料样本”是指包含粪便和尿液的混合排泄物样本。

在一个实施方案中，合并的排泄样本材料是粪便。合并的排泄样本材料可以是例如合并的粪便，尤其是源自禽类种群/禽类群的合并的粪便，例如合并的肉鸡粪便。

在一个实施方案中，步骤(a)的合并样本材料是来自随机选择的个体排泄样本的复合样本；特别地，来自禽类种群/禽类群(例如肉鸡群)的个体粪便样本的复合样本。

理想情况下，要从特定种群中采集的排泄物样本是在动物房内的多个离散的点采集的，以便获得代表整个动物种群的合并样本。

必须根据实际的饲养密度(即根据属于待测试的禽类种群的动物的实际数量)确定样本量(即，待采集的排泄样本的数量；在动物房内特定的点采集的每个样本)。

可以使用下式计算样本量：

其中

n

95％置信水平下的Z为1.96

p是具有问题属性q的种群的估计部分，其中q为1-p，并且

e是以小数表示的置信区间。

通常，最少80至100个个体排泄样本就足以满足大多数畜禽种群。肉鸡通常被成群饲养，在一个鸡舍中鸡群可由超过20000只鸡组成。

作为一个实例，对于20000只动物的肉鸡群，95％置信水平需要96个个体样本。

上式特别适用于确定对于大量种群所需的样本量。

对于较小的种群(<＝100)，可以根据下式进一步调整使用上式获得的样本量建议n

其中

N是种群量，并且

n是经调整的样本量。

为了获得步骤(a)中要求的合并的粪便样本材料，可以使用几种采样方法。

在一个实施方案中，可以通过系统网格采样(系统随机采样)来获得合并的粪便样本。对于这种方法，根据所需的个体粪便样本数量(即样本量)，将饲养动物种群的区域划分为均匀单元或子区域的网格图案。然后，在第一网格单元内识别出随机样本采集点，并在所述点采集第一样本。最后，在每个单元内使用相同的相对点，依次从相邻单元中获得其他样本(例如以蛇形、角形或锯齿形的方式)。可以使用骰子或随机数生成器获得随机起点。

对于重复样本，可以任选地重复上述过程。即，为在所有单元中待重复的单个收集点建立了新的随机位置。通过分析重复样本，可以确定原始样本提供的均值估计中的变化。

因此，上述方法可以进一步包括以下子步骤：

(a1)将动物房或动物种群饲养区划分为均匀单元的网格状；

(a2)识别第一单元内的至少一个随机样本采集点，并在所述至少一个样本采集点采集一个第一样本；和

(a3)在每个单元格中使用相同的相对样本采集点，依次采集其余单元格中的单个排泄样本；

以及任选地

(a4)对至少一个重复样本重复步骤(a2)和(a3)。

如果每个单元待获取一个样本，则样本量对应于网格图案中的单元数。通常，如果每个单元待获取x个样本，则样本量除以x是单元数。

系统网格采样方法可以在野外轻松实现。由此，可以避免子区域的代表性过多或不足。图1和图2示出了根据本发明的系统网格采样图案。

另一种采样方法是分层随机采样(即网格内的随机采样)。这里，样本是从相邻的网格单元中依次获得的，但是样本在每个单元内的位置是随机的。

可替代地，可以通过简单的随机采样来获取样本，其中，样本是从动物饲养区域内的随机位置(没有网格)获取的。对于这种方法，必须使用确定随机样本位置的正式方法，例如基于随机数生成器。

可以用刮刀(spatula)或类似装置手动收集样本，然后立即将其转移到样本收集容器或管中。

在替代实施方案中，可以在沿着动物房走动的同时使用套鞋法，使用将会产生动物房的所有部分或各个扇区的代表性样本的路线，获得合并的粪便样本。这样的路线可以例如是形状均匀的蛇形或弯曲的线、角线或锯齿形线。具有充分吸收性以吸收水分的靴子拭子特别适合。但是，管型纱布袜子也是可以接受的。

合适的样本体积为例如0.1至20ml，特别是0.2至10ml，优选0.5至5ml。合适的样本质量为例如0.1至20g，特别是0.2至10g，优选0.5至5g。

步骤(a)中获得的样本材料可包含异质成分，例如用过的饲料或垃圾材料，因此必须进行均质处理。本领域技术人员知晓合适的、常用的均质化技术。

步骤(c)中用于稀释和任选地稳定步骤(b)中获得的合并样本材料的水性缓冲溶液包含缓冲溶液、去污剂、变性剂和/或络合剂。有利地，所述水性缓冲溶液包含离液盐以化学破坏细胞并稳定和保护核酸免受溶液中的核酸酶破坏。任选地，水性缓冲溶液还包含核酸酶抑制剂。

根据本发明的方法的裂解步骤(d)可以通过化学裂解或通过机械裂解进行。化学裂解试剂是例如硫氰酸胍(guanidiniumthiocyanat)。机械裂解可以通过用珠粒、超声波或ultra

有利地，根据本发明的裂解步骤(d)包括机械裂解处理和化学裂解处理两者。

在一个实施方案中，裂解步骤(d)包括加热步骤(d1)、研磨步骤(d2)和离心步骤(d3)。对于加热步骤(d1)，将稀释后的样本材料加热到60℃至80℃或加热到65℃至75℃，时间间隔为10分钟至30分钟，或15分钟至25分钟。作为一个实例，可以将稀释的样本材料加热20分钟至70℃。研磨步骤(d2)涉及根据样本容器或管的体积用3mm至5mm的珠粒处理样本材料。例如，研磨步骤可以在50ml试管中使用4至7个尺寸为4mm的珠粒进行。离心步骤(d3)可以例如通过将样本容器或管以2000×g离心5分钟来进行。

在一个实施方案中，步骤(e)中的核酸分离通过磁珠提取进行。

在一个实施方案中，步骤(f)中至少一种病原体特异性靶基因的检测和定量通过qPCR进行。为了进行定量，使用了外部校准的定量标准。结果表示为拷贝数/μl(拷贝数/g粪便)。qPCR在群中样本采集的不同时间点进行。

根据本发明的基于qPCR的检测方法可以同时包括多个标志物或靶基因的多重扩增。选择PCR引物以产生大小不重叠并且能够同时分析的PCR产物在本领域中是众所周知的。可替代地，可以用差异标记的引物扩增不同的标志物或靶基因，从而能够差异地检测。

前述方法可以用于确定饲料干预或医学干预的必要性，或者可替代地，用于控制饲料干预或医学干预的有效性。动物群中至少一种病原体的负荷增加可表明饲料干预或医学干预的必要性。在进行干预之后，可以通过上述用于监测动物种群中至少一种病原体负荷的方法来验证干预的有效性。如果干预是有效的，则可以预期至少一种病原体的负荷的减少。

针对在生产过程中获得的感染进展而采取的饲料干预或医学干预涉及、尤其是喂养或施用促进健康的物质，例如畜牧学饲料添加剂或治疗剂。

术语“施用”或相关术语包括口服施用。口服施用可以通过饮用水、口服管饲、气雾喷雾或动物饲料进行。术语“畜牧学饲料添加剂”是指用于有利地影响健康状况下动物的性能或有用于有利地影响环境的任何添加剂。畜牧学饲料添加剂的实例是消化率增强剂，即当饲喂动物时可通过作用于目标饲料原料而增加饲料消化率的物质；肠道菌群稳定剂；微生物或其他化学确定的物质(当饲喂动物时，会对肠道菌群产生积极影响)；或有利地影响环境的物质。优选地，促进健康的物质选自益生菌剂、益生元剂(praebiotic agent)、植物性药物、有机/脂肪酸、沸石(zeolithes)、噬菌体和溶菌酶或其任意组合。

治疗剂是例如抗生素或抗炎剂。

本发明的另一方面是提供一种用于获得代表整个动物种群(即代表动物种群中的总病原体负荷)的合并的排泄样本的方法，该方法包括：

(a1)将动物房或饲养动物种群的区域划分为均匀单元的网格图案；

(a2)识别第一单元内的至少一个随机样本采集点，并在所述至少一个样本采集点采集一个第一样本；和

(a3)在每个单元内使用相同的相对样本采集点，依次采集其余单元内的个体排泄样本；

以及任选地

(a4)对至少一个重复样本重复步骤(a2)和(a3)。

可以使用下式确定所需的样本量(即待采集的样本总数)：

其中

n

95％置信水平下的Z为1.96

p是具有问题属性q的种群的估计部分，其中q为1-p，并且

e是以小数表示的置信区间。

通常，最少80至100个个体排泄样本就足以满足大多数畜禽种群。作为一个实例，对于20000只动物的肉鸡群，95％置信水平需要96个个体样本。

如果每个单元待获取一个样本，则样本量对应于网格图案中的单元数。通常，如果每个单元待获取x个样本，则样本量除以x是单元数。

前述样本收集方法可以用于确定动物种群中至少一种特定病原体的存在或监测其负荷的过程或方法中。

根据本发明的方法的应用是例如：(i)帮助在生产过程中获得的感染的诊断和/或预后；(ii)监测这些感染的进展或复发，或(iii)帮助评估正在接受或正在考虑接受治疗的动物种群的治疗功效。

本发明的应用尤其有助于避免动物性能(像增重和饲料转化)的损失。

下文通过非限制性实施例和示例性实施方案举例说明本发明。

实施例

产气荚膜梭菌被用作在禽类种群中待检测的示例性病原体。netB和cpa作为靶基因，在禽坏死性肠炎的进展中起关键作用。

根据美国人道协会认证的计划(该计划将屠宰时的密度限制在6.2磅/平方英尺，包括严格的管理和审核需求)，将大约20,000只肉鸡随机分配到作为公司的正常鸡只放置程序的一部分的肉鸡舍中。所有鸡群均按照公司的标准规程进行管理，所述规程符合饲养员对光照、温度和通风的建议。饲料由基础饲料(玉米和大豆)组成，并根据鸡对开口饲料、育肥饲料和后期饲料的需求进行了调整。每天监测鸡群的一般状况：饲料和水的可获性、温度控制以及任何异常状况。将死鸡移出并进行尸检以确定死亡原因，并扑杀衰弱的鸡以避免进一步的痛苦。

分别从第13至24天和第15至22天每天收集来自几种标准肉鸡现场生产过程的粪便样本和鸡群性能数据。

在每个采集时间点或事件中，用塑料钳从鸡舍的每个象限中采集24个个体样本，以锯齿形的方式行走每个象限。为了避免样本的交叉污染，每个鸡舍都使用了新的无菌钳，并观察到规定的生物安全措施。此外，在将来自4个象限的所有样本复合以在无菌样本收集袋中形成一个合并样本(由96个个体粪便样本组成)之前，从样本中去除诸如刨花、垃圾等碎屑。将样本置于冰上并转移至实验室在-80℃下保存。

将装有合并的96个样本的每个袋子在室温下缓慢融化；然后，将粪便转移到无菌容器中，并用无菌压舌器充分混合。将五(5)克均质化的样本转移到一个专有样本收集管中，其中装有20ml的稳定缓冲液和玻璃珠。样本收集管中的粪便样本在+15℃至+30℃的温度下最多可稳定7天。

将装有粪便样本的试管在水浴中于70℃孵育20分钟。然后将试管转移至Poly MixMill(珠磨器)中，以20Hz均质化15分钟。均质化结束时，将样本以2000g离心5分钟，然后将500μl上清液用于DNA提取。DNA提取是根据Evonik专有粪便提取试剂盒的操作规程，使用King Fisher Flex系统(Thermo Fisher，美国)进行的。

King Fisher仪器是通过上传定义提取过程各个步骤的预定义程序(“Cper_Extraction_01”)而准备的；如下所述制备取样吸头、DNA洗脱板、洗涤板和样本板。

将一个96吸头的梳子插入空的深孔板中，并将其放入仪器中。随后在洗脱板上引入100μl洗脱缓冲液，并将此板也放置在仪器中。此外，将500μl洗涤缓冲液3、2和1分别置于3个不同洗涤板的每个孔中，并将这些板以相同顺序放置在仪器上。最后，将300μl裂解缓冲液、25μl磁珠、20μl增强剂、10μl内对照和500μl粪便样本的上清液添加到样本板的每个孔中。将样本板放在仪器上后，按开始按钮开始提取。

为了定量DNA中的标志物，根据Evonik Nutrition&Care GmbH专有实时PCR检测试剂盒的说明制备了由5μl Master A、15μl Master B和1μl IC(内对照)组成的20μl反应混合物。准备足够的反应混合物，以适应所有样本、非模板对照(NTC)和4个标准品(S1至S4)一式两份的运行。将20μl的反应混合物分配到96孔板的各个孔中。然后，将10μl提取的DNA样本转移到每个孔中。相应地，将10μl的各标准品和1μl的IC转移到每个标准孔中。为了制备NTC，将10μl无菌无核酸酶水和1μl IC各自转移到NTC孔中。用多通道移液器将板的内容物充分混合，并用Clear Weld Seal Mark II箔膜密封板。将板以1000g(约3000rpm)离心30秒。最后，将板在CFX96实时PCR仪(Bio Rad，德国)上以下列PCR条件运行：在95℃下变性15秒，在58℃下退火45秒，在72℃延伸15秒，45个循环。在QPCR运行的扩增阶段获取数据。运行结束时，将从BioRad CFX96接收的数据用BioRad CFX Manager 3.1进行预处理，然后导出到Excel 2013以进行进一步分析。由标准曲线确定样本中标志物的定量，其中由包含相等浓度的两个靶标的标准溶液(S1至S4)建立得到该标准曲线。S1、S2、S3和S4中的netB浓度分别为10

用于定量netB表达水平的qPCR的引物和探针列表：

在第16天通过兽医诊断(尸检)确定了坏死性肠炎的暴发。用于定量cpa表达水平的qPCR的引物和探针列表：

序列表

<110> 赢创运营有限公司

<120> 监测动物种群中病原体负荷的体外方法

<130> 201800008

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物(正向)

<400> 1

tatacttcta gtgataccgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物(反向)

<400> 2

atcagaatga ggatcttcaa 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 3

tcacataaag gttggaaggc aac 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

tacatatcaa ctagtggtga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

attcttgagt ttttccatcc 20

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 6

tggaacagat gactacatgt attttgg 27

201800008 Ausland 9