基于限制交替三线性分解算法和HPLC-DAD仪器快速测定手性物质的方法

摘要

本发明公开一种基于限制交替三线性分解算法和HPLC‑DAD仪器测定手性物质的方法：首先分别准备校正集样本、验证集样本和预测集样本，利用HPLC‑DAD仪器对样本进行检测，然后建立校正模型并做回归分析，即先将校正集样本、验证集样本和预测集样本的HPLC‑DAD数据组成三维数据阵X，再利用向量子空间投影结合蒙特卡罗模拟方法确定体系因子数，并利用限制交替三线性分解算法对三维数据阵分解，建立校正模型，并对验证样和预测样品中手性物质的浓度进行回归分析，最后测得体系中手性物质的浓度；本发明可以有效的解决手性物共流出峰的问题，避免浪费大量时间来筛选手性柱柱型和流动相，具有快速、绿色、环保的特点。

说明书

背景技术

手性是自然界物质的本质属性，手性农药对映体间活性毒性差异显著，而这种 差异与所处环境密切相关。中国当前使用的农药中约有40％是手性物质，且随着 复杂结构不断引入，该比例呈逐渐增加的趋势。因此，建立手性农药快速检测方 法，不仅可有效降低农药的生产成本，还可以减少农药向自然生态系统中的投入 量，进而减轻或避免农药对生态环境和动植物的危害。

目前常见的手性物质分析方法，包括化学拆分法、酶或微生物法和色谱拆分法，其中，色谱拆分法具有许多明显的优越性，可以满足各种条件下对映体分离和测 定的要求，能够进行简便快速的定性定量分析，也能进行制备规模的分离和微量 测定。色谱拆分法可以分为手性衍生化法、手性流动相法和手性固定相法。其中， 基于手性固定相法的色谱拆分法最为常见。手性固定相法是基于样品与固定相表 面的手性选择剂形成暂时的非对映体配合物的能量差异或稳定性不同而达到手 性分离，可不经过转变成非对映体的直接拆分。该方法的流动相组成简单，重现 性好，操作方便，应用范围极其广泛。但手性固定相法具有很强的专一性，一种 类型的固定相只能拆分一类或某几类对映体，目前已经开发了很多具有不同功能 的手性柱。因此，利用高效液相色谱-二极管阵列紫外检测器仪器(HPLC-DAD) 方法检测手性农药，既需要花费大量时间来筛选合适的柱型和流动相，使得手性 物在手性柱上有分离效果；而且即使手性物在某一手性柱上有分离效果，还需要 长时间探索合适仪器方法使得手性物质在手性柱上完全分离，并且在色谱流出时 间中不能与未知干扰重叠，才可以准确定量。因此，基于HPLC-DAD仪器开发通 用、快速的手性化合检测方法已成为本领域亟待解决的技术难题。

发明内容

针对上述问题，本发明基于“数学分离”增强“色谱分离”思路，针对手性物 分析的特殊体系，开发了限制交替三线性分解算法(RATLD)，并结合基于手性柱 的HPLC-DAD仪器对复杂样品中的手性物质进行快速定量分析。本发明技术方法 是通过如下方法实现的：

1)校正集样本的准备：购买待测手性物物质标品，并合适的有机溶剂(如己 烷)分别配制手性物的工作液，在浓度线性范围内配制不同梯度浓度的手性物质 混合溶液，作为校正集样本，其中浓度配比可以根据本领域常规正交试验设计和 均匀实验设计等方法进行设定(如参照《分析化学手册(第二版)第十分册-化 学计量学》，化学工业出版社)；

以测定水稻样品中的R-呋虫胺和S-呋虫胺为例，利用正己烷分别溶解R-呋虫 胺和S-呋虫胺标品，均配制成的浓度为10.0mg/L的工作液，然后利用工作液 配制6组不同浓度梯度的手性物混合溶液作为校正样，并用正己烷定容至1mL， 定容后6个校正集样本中，R-呋虫胺浓度依次为4.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.0mg/L， S-呋虫胺浓度依次为0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0mg/L。

2)验证集样本的准备：称取不含手性物质的待测样品，加入一定量的待测手 性物标准品溶液，依据本领域常规样品处理方法(如文献《液相色谱分析技术标 准汇编》，中国标准出版社)对待测样品进行提取，确保待测样品提取液符合色 谱仪器进样标准。其中，验证样品提取液的浓度应该在校正集样本中手性物的浓 度范围内。

以测定水稻样品中的R-呋虫胺和S-呋虫胺为例，取未受呋虫胺污染水稻，并 用食品捣碎浆机粉碎并混匀，准确称1.0g于5mL带盖的一次性塑料管中，分别 加入一定量的手性物标准品溶液，使两手性物添加浓度分别为0.1mg/kg、0.5 mg/kg和1.5mg/kg，加入5.0mL乙腈，振荡30min，加1.0g氯化钠，涡旋1min， 以5000r/min转速离心10min，取上层清液2.5mL于5mL一次性塑料管中，加 入30mg石墨炭黑，100mgN一丙基乙二胺(PSA)，100mg无水硫酸镁，涡旋1min， 以8000r/min转速离心5min，再取上层清液1mL，氮气吹干后，加入1mL正己 烷溶解，0.22μm有机滤膜过滤后，即获得所述待测验证集样本；

3)预测集样本的准备：预测集中待测样品与验证集样品的处理步骤一致，但 不添加手性物标准品。

4)基于HPLC-DAD仪器筛选具有分离效果的手性柱和流动相(手性物在手性柱 上不需要完全分离)，并对校正样、验证样和预测样进行检测。

本发明实施例中使用大赛璐键合型手性色谱柱(IB-3)，其高效液 相色谱参数设置如下：仪器：高效液相色谱仪；色谱柱：大赛璐IB-3；流动相： 正己烷(A)-乙醇(B)；流速：0.6mL/min；进样量：30uL；检测器：二极管阵 列检测器(DAD)，扫描范围230-400nm，间隔2nm。在该条件下，测定R-呋虫 胺和S-呋虫胺存在共流出问题。

5)校正模型建立及回归分析：首先将校正集样品、验证集样品和预测集样品 的HPLC-DAD数据组成三维数据阵X，再利用向量子空间投影结合蒙特卡罗模拟 方法确定体系组分数，并利用的限制交替三线性分解算法对三维数据阵分解，最 后利用校正集建立校正模型，并对验证样和预测样品中手性物质的浓度进行回归 分析。

步骤5)中，所述校正集样品、验证集样品和预测集样品的HPLC-DAD数据均 为二维数据阵，其大小为I×J,其中I为时间维度，其大小为时间维度采集数据 点个数；J为光谱维度，其大小为光谱维度采集数据点个数。把每个样品的二维 数据堆叠起来就构成了三维数据阵X，其大小为I×J×K，其中K为样品维度，K>

步骤5)中，利用向量子空间投影结合蒙特卡罗模拟方法确定体系因子数的过 程如下：

a)在三维数据阵X中，沿着I方向获得一个伪样本阵R₁：

上式中，X_i..为三维数据阵X沿I方向上第i个切片矩阵；

w_i是由蒙特卡罗模拟方法产生的随机数据，其大小介于0到1之间，利用奇异值>..k的前N个主成分来构建样本阵M_..k：

[U,S,V]＝svds(X_..k,N)(2)

M_..k＝USV^T(3)

其中，X_..k为三维数据阵X沿K方向上第k个切片矩阵；

b)构建伪矩阵R2：

其中，w_i与等式(1)中的w_i相同；

然后利用奇异值分解处理两个伪矩阵R₁和R₂：

[U₁,S₁,V₁]＝svd(R₁)(5)

[U₂,S₂,V₂]＝svd(R₂)(6)

依据如下等式计算U₁和U₂中相应向量的投影残差：

上式中，DI_(n)表示投影残差，U_1(n)和U_2(n)分别是U₁和U₂的第n个列向量，I_J表示>+是Moore-Penrose广义逆矩阵，DI为向量其大小>F为矩阵的F范数或称Frobenius模；

c)利用蒙特卡罗模拟方法随机产生至少50组w_i数值进行重复步骤a)-b)，计算>N(DI_N为向量其大小为1×N)，因子数判定标准：当因子>I就是预估计的体系组分数；

d)沿J方向求出投影残差DJ_N并估计另一个组分数N_J；从N_I和N_J中判断最终的>

向量子空间投影结合蒙特卡罗模拟方法的具体步骤可以参阅文献(Yong Li,etal.Estimating the chemical rank of three-way fluorescence data by vectorsubspace projection with Monte Carlo simulation.Chemometrics and IntelligentLaboratory Systems,2014,136:15-23)。

步骤的5)中，限制交替三线性分解新方法(RATLD)基于限制三线性模型开 发的。对于手性物体系，手性物之间虽然有空间位阻差异，但是其紫外光谱基本 一致，存在严重共线性，因此，利用常规二阶校正方法无法解析出正确结果。所 以，需要开发更稳健的方法来处理该类型数据。依据两物质手性体系，依据三线 性模型的思路，可以提出限制三线性模型：

其中，x_ijk是三维数据阵X中的元素，X的大小为I×J×K；a_in、b_jn和c_kn分别是>ijk是三维残差阵E中的元素；N代表因子数，它是有物理>

X_i..＝[B_(:,1),B_(:,1),B_(:,3:N)]diag(A_(i,:))C^T+E_i..(i＝1,2,...,I)(17)

X_.j.＝Cdiag([B_(j,1),B_(j,1),B_(j,3:N)])A^T+E_.j.(j＝1,2,...,J)(18)

X_..k＝Adiag(C_(k,:))[B_(:,1),B_(:,1),B_(:,3:N)]^T+E_..k(k＝1,2,...,K)(19)

其中，X_i..、X_.j.、X_..k分别为X沿i、j、k三个方向的切片矩阵；E_i..、E_.j.、E_..k分别为E沿i、j、k三个方向的切片矩阵；B_(:,n)为B的第n个列向量；B_(:,3:N)为>(:,3:N)为B的第>(i,:)为A第i个列向量；C_(k,:)为C的第k个列向量；diag(A_(i,:))和>(j,1),B_(j,1),B_(j,3:N)])为对角矩阵，其对角元素分别与A_(i,:)和>(j,1),B_(j,1),B_(j,3:N)]相对应；上标^T为矩阵转置运算。基于限制三线性模型，可以>

其中||.||_F矩阵的F范数或称Frobenius模。B_(:,1)为纯手性物质的紫外光谱图，>(:,3:N)和C：

A_(i,:)＝diagm([B_(:,1),B_(:,1),B_(:,3:N)]⁺X_i..(C^T)⁺)(i＝1,2,...,I)(10)

其中diagm(.)提取矩阵对角上的元素，并将其排列成一个列矢量。RATLD算法计算过程如下：

a)测定手性物紫外光谱B_(:,1)，并进行归一化；

b)随机初始化矩阵A和B_(:,3:N)；

c)根据公式(12)计算C，对C进行非负约束

d)根据公式(10)计算A，对A进行非负约束，并对A进行逐列规一化；

e)根据公式(11)计算B_(:,3:N)，对B_(:,3:N)进行非负约束，并对B_(:,3:N)进行逐列规>

f)根据公式(12)计算C，对C进行非负约束；

g)重复步骤d)-f)直到满足收敛标准：

上式中，m为当前迭代次数，SSR为残差平方和，m的最大值为1000。

得到色谱矩阵A、光谱矩阵B和浓度矩阵C后，利用待测手性物质的色谱图和 光谱图来确定待测手性物质在矩阵中的位置，然后对两个手性物质依次进行回归 分析。

如以R-呋虫胺为例进行回归分析：先确定R-呋虫胺在解析矩阵中的位置(比 如是第一列)，在解析浓度矩阵中确定校正集样品的解析浓度C₁，利用C₁与真实>0建立校正模型：

C₀＝C₁*b(15)

其中b为回归系数，可以利用最小二乘方法获得；得到校正模型后，再把验证 集的解析浓度C₂和预测集样本的解析浓度C₃带入校正模型中，即得到验证集和>

与现有技术相比，本发明对手性柱和流动相选择要求较低，只需要存在分离效 果就可以，不需要使手性物质在手性柱上完全分离。本发明可以实现在未知干扰 共存下特定手性物质的快速检测。本发明避免了常规方法浪费大量时间来筛选手 性柱柱型和流动相，具有快速、绿色、环保的特点。

附图说明

图1 R-呋虫胺和S-呋虫胺色谱图。

图2HPLC-DAD测定R-呋虫胺和S-呋虫胺的紫外光谱图。

图3向量子空间投影结合蒙特卡罗模拟方法对HPLC-DAD数据进行组分数估计：(a)为I方向投影残差；(b)为J方向投影残差。

图4在组分数选为3时RATLD解析结果：(a)为色谱图；(b)为光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对发明技术方案做进一步描述：

以下实施例中所涉及的试剂：

S-呋虫胺和R-呋虫胺为分析纯，购买于广州药博化学研究有限公司。氯化钠(A.R.，西陇化工股份有限公司)；乙腈(HPLC，德国Merck公司)；正己烷(HPLC， 德国Merck公司)；乙醇(HPLC，德国Merck公司)；(N一丙基乙二胺(Agela Technologies公司)；无水硫酸镁(A.R.，成都市科龙化工试剂厂)，550℃烘烤 5h，冷却待用；

实施例1S-呋虫胺和R-呋虫胺检测分析

a.准备校正集样本：利用正己烷分别溶解S-呋虫胺和R-呋虫胺标品，配成浓度 为10mg/L工作液，并按表1浓度进行混合，

表1校正集样本中R-呋虫胺和S-呋虫胺浓度

b.准备验证集样本：

取未受呋虫胺污染水稻，并用食品捣碎浆机粉碎并混匀，准确称1.0g于5mL 带盖的一次性塑料管中，分别加入一定量的手性物标准品溶液，使两手性物添加 浓度分别为0.1mg/kg、0.5mg/kg和1.5mg/kg，加入5.0mL乙腈，振荡30min， 加1.0g氯化钠，涡旋1min，以5000r/min转速离心10min，取上层清液2.5mL于 5mL一次性塑料管中，加入30mg石墨炭黑，100mgN一丙基乙二胺(PSA)，100mg 无水硫酸镁，涡旋1min，以8000r/min转速离心5min，再取上层清液1mL，氮 气吹干后，加入1mL正己烷溶解，0.22μm滤膜过滤后，即获得所述待测验证集 样本,每个浓度水平重复3次；

c.准备预测集样本：

取待测水稻植株样品，并用食品捣碎浆机粉碎并混匀，准确称1.0g于5mL带盖 的一次性塑料管中，加入5.0mL乙腈，振荡30min，加1.0g氯化钠，涡旋1min， 以5000r/min转速离心10min，取上层清液2.5mL于5mL一次性塑料管中，加 入30mg石墨炭黑，100mgN一丙基乙二胺(PSA)，100mg无水硫酸镁，涡旋1min， 以8000r/min转速离心5min，再取上层清液1mL，氮气吹干后，加入1mL正己 烷溶解，0.22μm滤膜滤后，即获得所述待测预测样,每个待测样品设置三个平 行样。

d.仪器和色谱条件

基于HPLC-DAD仪器筛选具有分离效果的手性柱和流动相(手性物在手性柱上不需要完全分离)，并对校正样、验证样和预测样进行检测。

高效液相色谱参数设置如下：仪器为高效液相色谱仪(Agilent 1260)；色谱柱选为大赛璐IB-3(耐溶剂型手性柱，硅胶表面共价键合有纤维素-三(3,5-二甲基 苯基氨基甲酸酯)；流动相选为正己烷(A)-乙醇(B)；流速设定为0.6mL/min； 柱温箱温度为40℃；进样量为30uL。

检测器为二极管阵列检测器(DAD)，扫描范围230-400nm，间隔2nm。

进样前，样品先用0.22μm有机滤膜过滤。

色谱检测结果如图1所示，可见S-呋虫胺的色谱流出时间为11.3-11.9min(图 1(a))，R-呋虫胺的色谱流出时间为11.4-12.0min(图1(b))，所以，当两个 手性物同时检测时，存在严重的峰重叠问题，此时，常规的方法是需要再摸索仪 器条件或是尝试其他手性色谱柱及流动相使两个手性物完全分离，但这个过程是 相当费时费力的，而且，当未知干扰物在手性物流出时间出峰也同样也影响其定 量结果。但基于化学计量学二阶校正的“数学分离”增强“色谱分离”思路可 以很好的解决色谱峰重叠问题，而且可以实现在未知干扰共流出峰干扰下感兴趣 物质的快速定量分析。

e.校正模型建立及回归分析：首先将校正集样品、验证集样品和预测集样品的HPLC-DAD数据组成三维数据阵X，再利用向量子空间投影结合蒙特卡罗模拟确定 体系因子数，并利用的限制交替三线性分解算法对三维数据阵解析，最后利用校 正集建立校正模型，并对验证样和预测样品中S-呋虫胺和R-呋虫胺浓度进行回 归分析。

步骤e中，每个样品测定的HPLC-DAD数据为二维数据阵，其大小为I×J,其中I 为时间维度，其大小为时间维度采集数据点个数；J为光谱维度，其大小为光谱 维度采集数据点个数。把每个样品的二维数据堆叠起来就构成了三维数据阵X，>

利用向量子空间投影结合蒙特卡罗模拟方法(VSPMCS)确定体系因子数的过程如下：

a)在三维数据阵X中，沿着I方向获得一个伪样本阵R₁：

上式中，X_i..为三维数据阵X沿I方向上第i个切片矩阵；

w_i是由蒙特卡罗模拟方法产生的随机数据，其大小介于0到1之间，利用奇异值>..k的前N个主成分来构建样本阵M_..k：

[U,S,V]＝svds(X_..k,N)(2)

M_..k＝USV^T(3)

其中，X_..k为三维数据阵X沿K方向上第k个切片矩阵；

b)构建伪矩阵R2：

其中，w_i与等式(1)中的w_i相同；

然后利用奇异值分解处理两个伪矩阵R₁和R₂：

[U₁,S₁,V₁]＝svd(R₁)(5)

[U₂,S₂,V₂]＝svd(R₂)(6)

依据如下等式计算U₁和U₂中相应向量的投影残差：

上式中，DI_(n)表示投影残差，U_1(n)和U_2(n)分别是U₁和U₂的第n个列向量，I_J表示>+是Moore-Penrose广义逆矩阵，DI为向量其大小>

c)利用蒙特卡罗模拟方法随机产生至少50组w_i数值进行重复步骤a)-b)，计算>N(DI_N为向量其大小为1×N)，对DI_N突然由小变大的突>I即为预估计的体系组分数；

d)沿J方向求出投影残差DJ_N并估计另一个组分数N_J；从N_I和N_J中判断最终的体系组分数；

向量子空间投影结合蒙特卡罗模拟方法的具体步骤可以参阅文献(Yong Li,etal.Estimating the chemical rank of three-way fluorescence data by vectorsubspace projection with Monte Carlo simulation.Chemometrics and IntelligentLaboratory Systems,2014,136:15-23)。

图3为向量子空间投影结合蒙特卡罗模拟方法对体系组分数估计结果，可以发现，前三个投影残差都等于0或接近于0，第4个因子的投影残差突然增大，这说明 在体系组分数应该估计为3。

步骤e中，基于限制三线性模型，可以构建限制交替三线性分解方法(RATLD)， 其目标函数构建如下：

其中||.||_F矩阵的F范数或称Frobenius模；

B_(:,1)为纯手性物质的紫外光谱图，可以通过HPLC-DAD对纯物质进行直接测定来获得，可以根据上面目标函数求解出A、B_(:,3:N)和C：

A_(i,:)＝diagm([B_(:,1),B_(:,1),B_(:,3:N)]⁺X_i..(C^T)⁺)(i＝1,2,...,I)(10)

其中diagm(.)提取矩阵对角上的元素将其排列成一个列矢量；

RATLD算法计算过程如下：

a)测定手性物紫外光谱B_(:,1)，并进行归一化；

b)初始化矩阵A和B_(:,3:N)；

c)根据公式(12)计算C，对C进行非负约束

d)根据公式(10)计算A，对A进行非负约束，并对A进行逐列规一化；

e)根据公式(11)计算B_(:,3:N)，对B_(:,3:N)进行非负约束，并对B_(:,3:N)进行逐列规>

f)根据公式(12)计算C，对C进行非负约束；

g)重复步骤d)-f)直到满足收敛标准：

上式中，m为当前迭代次数，SSR为残差平方和，m的最大值为1000；

得到色谱矩阵A、光谱矩阵B和浓度矩阵C后，利用待测组分(R-和S-呋虫胺) 的色谱图和光谱图来确定待测组分在矩阵中的位置，然后对两个组分依次进行回 归分析。以R-呋虫胺为例进行回归分析：先确定R-呋虫胺在解析矩阵中的位置 (比如是第一列)，在解析浓度矩阵中确定校正集样品的解析浓度C₁，利用C₁与>0建立校正模型：

C₀＝C₁*b(15)

其中b为回归系数，可以利用最小二乘方法获得；得到校正模型后，再把验证集 的解析浓度C₂和预测集样本的解析浓度C₃带入校正模型中，即得到验证集和预>C.Goicoechea,Arseniooz delaa,Editors.2015，Chapter 4-Practical Analytical Applications of MultiwayCalibration Methods Based on Alternating Multilinear Decomposition)。

图3为因子为3时，RATLD算法解析出的色谱图和光谱图，由此图可以看出，RATLD解析S-呋虫胺和R-呋虫胺色谱图与真实色谱图基本重叠，定性结果比较满意。 另外RATLD也解析出一个干扰物质，说明RATLD算法可以实现在未知干扰共存 下感兴趣的快速测定。利用校正模型对验证集样本的预测结果如表2所示，S- 和R-呋虫胺的平均回收率结果比较满意,证明开发方法是可行的。预测样品中， 测定S-呋虫胺和R-呋虫胺的手性物浓度为0.7±0.1mg/kg和1.0±0.1mg/kg。

表2预测样本浓度及平均回收率

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下还可以做出若干改进，这些改进也应视为 本发明的保护范围。