一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片

摘要

本发明公开一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片。基于纸基微流控片易加工、低成本的独特优势，并与灵敏的纳米金修饰电化学生物传感器有机结合，建立了肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）释放多巴胺水平的检测新技术，实现了对PC12细胞以及阿尔兹海默症（AD）模型细胞活性的在线监测。本发明在优化的最佳条件下，采用差示脉冲伏安法，通过对PC12细胞、Aβ

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片，该纸基微流控芯片检测细胞内DA，能够应用于疾病的早期诊治、药物疗效评价等领域。

背景技术

多巴胺是由神经细胞分泌的一种儿茶酚胺类神经递质，在细胞间的信息传递中起到化学信使的作用，能够调控人类的情绪和认知能力，包括思想、感觉、理解、推理等方面。研究表明，神经退行性疾病如帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病等与多巴胺的代谢失常有关。因此，在细胞水平实现对多巴胺分子化合物的含量检测对多巴胺代谢通路的研究具有非常重要的意义。

目前，用于多巴胺检测的常用方法主要有比色法、荧光法、高效液相、化学发光法、电化学法等等。近年来，电化学法因其独特的优势，如经济成本低、灵敏度高、选择性好等特点成为科学家们研究的热点。但是，传统电极存在所需样品量大、操作复杂、难以实现集成化和微型化等缺点，不利于实现细胞水平的在线检测。丝网印刷电极的出现使这个问题迎刃而解。丝网印刷电极制作简单，可进行批量生产，且价格低廉、偏于携带、所需样品量小，极其适宜与纸基微流控芯片结合使用。

在此研究基础上，本课题组自制了一种集成化细胞培养平台-纸基微流控芯片用于细胞活性的在线检测。纸张因其纤维性、多孔性及柔性性能，在细胞培养平台方面具有极大的潜力。研究表明，与组织培养板相比，纸基细胞培养系统能显著改善细胞活力，黏附及迁移性质。另外，纸张在经历化学或物理处理后，其自身性能不易发生巨大改变，这为在不改变纸张本身的性能的前提下，对纸张进行适当修饰以达到一定的实验目的提供了可能性。目前，纸基微流控芯片在临床诊断中的早期治疗发挥着重要的作用，已被广泛用于生化检测和免疫检测，如尿液、唾液以及血液中的葡萄糖、尿酸、乳酸、蛋白质、亚硝酸根、DNA等，纸基微流控芯片的集成化和微型化为临床诊断提供了一个实时监测的平台。

本发明基于纸芯片易加工、低成本、微型化、生物兼容性好的独特优势，自制集成化细胞培养平台--纸基微流控芯片，结合制备的纳米金修饰的丝网印刷电极，通过对PC12细胞释放多巴胺的检测，建立了在线监测PC12细胞释放多巴胺的新技术，实现了对PC12细胞以及AD模型细胞活性的监测。

发明内容

1.本发明的目的是提供一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片。

本发明的目的是这样实现的，所述的一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片，其特征在于，该微流控芯片以滤纸为细胞培养基底，联合纳米金修饰的丝网印刷电极，通过电化学方法能在线检测细胞内的多巴胺。

利用金纳米粒子进行修饰丝网印刷电极，在微流控芯片中采用差示脉冲伏安法对细胞释放的DA进行检测；所述的微流控芯片的设计与制作：微流控芯片为三层结构，上层为带孔的聚二甲基硅氧烷弹性体层，下层为同等大小的不带孔的聚二甲基硅氧烷弹性体层，中间层为经过处理的滤纸，其直径为9 mm且中间有个直径为4 mm的孔，孔的作用是为了让多巴胺与工作电极更好的接触，有利于多巴胺的检测，这三层结构用夹子紧密固定；所述的经过处理的滤纸采用下述方法处理的：将滤纸加热煮沸去除水溶性杂质，然后浸泡于EDTA-Na溶液中以络合纸基中金属离子，再浸泡于乙醇中去除有机杂质，最后用壳聚糖修饰，晾干后备用。

成功构建AD模型，并设置了对照组和姜黄素干预组，三者多巴胺表达水平有差异，分别置于上述制得的微流控芯片结合金纳米粒子修饰丝网印刷电极作为的工作电极，用高钾溶液刺激细胞释放DA，用差示脉冲伏安法在线监测各组细胞释放DA含量差异。

差示脉冲伏安法检测的电流响应值与DA浓度在0.05 - 1 μmol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程：I(μA) = 0.1679 + 0.2718 C_DA(μmol/L)，R^{2>= 0.9949，检测限为0.009 μmol/L。}

本发明所述的一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片中测定细胞内DA的方法，包括如下步骤:（1）纸基微流控芯片模型的设计与制作：微流控芯片为三层结构，上层为带孔的聚二甲基硅氧烷弹性体层，下层为同等大小的不带孔的聚二甲基硅氧烷弹性体层，中间层为经过处理的滤纸，其直径为9 mm且中间有个直径为4 mm的孔，孔的作用是为了让多巴胺与工作电极更好的接触，有利于多巴胺的检测，这三层结构用夹子紧密固定；所述的经过处理的滤纸采用下述方法处理的：将滤纸加热煮沸去除水溶性杂质，然后浸泡于EDTA-Na溶液中以络合纸基中金属离子，再浸泡于乙醇中去除有机杂质，最后用壳聚糖修饰，晾干后备用；（2）纸基微流控芯片上细胞的培养：取细胞悬浮液置于步骤（1）制得的纸基微流控芯片中，将整个装置放在培养皿中，再将培养皿置于5wt%CO₂，37>

2.本发明所述的纸基微流控芯片，以滤纸为细胞培养基底，自制细胞培养装置，通过纳米金修饰的丝网印刷电极联合电化学方法在线检测细胞内的多巴胺。

3.本发明所述的细胞内多巴胺含量检测，包括对照组，Aβ_25-35诱导AD模型组及姜黄素干预组。

4.本发明的一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控芯片测定细胞内DA的方法，依序包括如下步骤 ：

（1）丝网印刷电极的修饰

将丝网印刷碳电极清洗干净后，用计时电流法将金纳米粒子沉积于其表面。

（2）纸基微流控芯片模型的设计与制作

纸基微流控芯片为三层结构，上层为带孔的聚二甲基硅氧烷弹性体（PDMS），下层为同等大小的密闭PDMS，中间层为经过处理的滤纸，其直径为9 mm且中间有个直径为4 mm的孔，孔的作用是为了让多巴胺与工作电极更好的接触，有利于多巴胺的检测，这三层结构用夹子紧密固定。

（3）纸基微流控芯片上细胞的培养

取100 uL细胞悬浮液置于自制的纸基微流控芯片中，将整个装置放在培养皿中，再将培养皿置于5% CO₂，37>

（4）纸基微流控芯片上细胞中DA的测定

将培养有细胞的纸芯片与已修饰的丝网印刷电极固定于自制装置中，使用高钾溶液刺激细胞产生多巴胺（DA），设置电化学工作站参数，采用差示脉冲伏安法检测细胞内DA。

本发明优点:

纸基细胞培养装置（纸基微流控芯片）具有易加工、低成本、微型化、高生物相容性的独特优势。与电化学检测手段联用，在线监测对照组、阿尔兹海默症（AD）模型组及姜黄素干预组中细胞释放多巴胺的含量，为阿尔兹海默症等神经相关疾病的药物疗效评价、新药开发等研究提供新技术。

附图说明

图1为本发明一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片工作原理图。（图中：1：多巴胺检测盒；2：细胞培养池；3：印刷电极链接端口；4：印刷电极；5：电化学工作站；6：参比电极；7：工作电极；8：对电极；9：带孔纸基载体；10：密闭PDMS层；11：带孔PDMS层；12：PC12细胞）。

图2为本发明一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片中裸电极与修饰纳米金的电极的扫描电镜表征图。

图3为本发明一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片细胞培养的荧光成像图。

图4为本发明一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片的线性关系图。

图5为本发明一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片的不同实验组细胞释放多巴胺的电流响应值图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及效果更加清晰，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。

如图1所示， 本发明所述的一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片工作原理图：基于纸芯片具有易加工、低成本、微型化、高生物相容性的独特优势，本发明自制集成化细胞培养平台-纸基微流控芯片，结合制备的纳米金修饰的丝网印刷电极，通过差示脉冲伏安法对不同实验组PC12细胞释放的多巴胺进行检测，建立了在线监测肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）释放多巴胺的新技术，实现了对PC12细胞以及AD模型细胞活性的监测。

实施例1：

（1）将丝网印刷碳电极用去离子水清洗3遍，氮气吹干。滴加2.8 mmol/L 氯金酸溶液及0.5 mol/L 硫酸溶液于丝网印刷碳电极表面，用计时电流法将金纳米粒子沉积于丝网印刷碳电极4上，表面形成有纳米金修饰的工作电极7（如图1所示）。丝网印刷碳电极4有参比电极6、工作电极7和对电极8组成，在丝网印刷碳电极4表面上位于工作电极7一侧集成有参比电极6，位于工作电极7另一侧集成有对电极8。

从图2中A可知，裸丝网印刷碳电极表面较粗糙，这主要是由微米级颗粒状碳粉造成的；当用时间-电流法，在电压为-0.2 V，时间为400 s，电沉积金后，如图2中B所示，丝网印刷碳电极表面变平整，且出现晶体状的金纳米颗粒。

（2）纸基微流控芯片模型的设计与制作

如图1所示，本发明所述的纸基微流控芯片为三层结构，上层为带孔的聚二甲基硅氧烷弹性体层（简称带孔PDMS层11），下层为同等大小的密闭PDMS层（简称密闭PDMS层10），中间层为经过处理的滤纸（简称带孔纸基载体9），其直径为9 mm且中间有个直径为4 mm的孔，孔的作用是为了让多巴胺与工作电极7更好的接触，有利于多巴胺的检测，这三层结构用夹子紧密固定。所述的滤纸采用下述方法处理的：将滤纸加热煮沸去除水溶性杂质，然后浸泡于1 mol/L EDTA-Na溶液中以络合纸基中金属离子，再浸泡于乙醇中去除有机杂质，最后用0.5wt%壳聚糖修饰，晾干后备用。

（3）纸基微流控芯片上细胞的培养

取100 uL细胞悬浮液置于自制的纸基微流控芯片中，将整个装置放在培养皿中，再将培养皿置于5wt% CO₂，37>

（4）纸基微流控芯片上细胞中DA的测定

将培养有细胞的纸芯片与已修饰的丝网印刷电极固定于自制装置，如图1所示，自制装置包括多巴胺检测盒1，多巴胺检测盒1为方盒，其一侧面有氮气入口、另一侧面有氮气出口，中间腔体能放置步骤2制成的纸基微流控芯片，纸基微流控芯片的上层的带孔PDMS层11的孔内有细胞培养池2，细胞培养池2内有PC12细胞12，带有工作电极7、参比电极6和对电极8的丝网印刷碳电极4插入到纸基微流控芯片中的带孔纸基载体9与密闭PDMS层10之间（或还可在带孔PDMS层11与带孔纸基载体9之间，只要能使电极接触到欲检测的细胞——PC12细胞12即可）、并接触到其中的PC12细胞12然后用夹子紧密定位，丝网印刷碳电极4通过印刷电极链接端口3连接电化学工作站5，使用高钾溶液刺激细胞培养池2中的细胞产生DA，设置电化学工作站参数，利用丝网印刷碳电极（带有参比电极6；纳米金修饰的工作电极7和对电极8），采用差示脉冲伏安法检测细胞内DA。

实施例2：

一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片的纸基细胞培养步骤如下：

取100 uL密度为5×10⁴个/mL的细胞悬浮液滴加于实施例1制得的纸基微流控芯片的滤纸表面，将整个纸基微流控芯片放在培养皿中，再将培养皿置于5wt%>

图3中A为无细胞种植的纸芯片，可见明显的纸纤维结构且无杂质；图中3B为培养一天后细胞的生长情况图，PC12细胞均匀分散于纸纤维中，生长状况良好；图3中C为培养两天后细胞的生长情况图，PC12细胞生长状况良好且数目增多，有明显的增殖情况；图3中D为培养三天后细胞的生长情况图，PC12细胞生长状况良好、分布均匀，数目明显增多；培养4天后观察，如图3中E所示，PC12细胞生长状况良好，数目进一步增多，呈现集聚成团现象。

实施例3：

一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片的线性关系检测步骤如下：

待PC12细胞生长状态良好时，倒掉培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗三遍后，用适量PBS溶液（0.1 mol/L，pH 7.4）接触细胞，放置培养箱孵育5 min后，收集接触PC12细胞的PBS缓冲液，用该溶液配制一系列浓度的多巴胺溶液，置于实施例1制得的纸基微流控芯片结合实施例1制得的已修饰纳米金的丝网印刷电极作为工作电极，采用差示脉冲伏安法进行检测，结果如图4。

由图4可知，多巴胺的氧化峰电流响应值随多巴胺浓度增大而增大，电流响应值与多巴胺浓度在0.05 - 1 μmol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程：I(μA) = 0.1679 +0.2718 C_{DA>(μmol/L)，R^{2>= 0.9949，检测限为0.009 μmol/L。}}

实施例4：

一种用于纳米金修饰电极在线监测细胞内多巴胺的微流控芯片的不同实验组细胞释放多巴胺响应值操作步骤如下：

取对数生长期的PC12细胞，消化、离心后用完全培养液重悬，稀释至浓度为5×10⁴个/mL，种植在实施例1制得的纸基微流控芯片中，将实验分成对照组、Aβ_25-35诱导AD模型组、姜黄素干预组并施加相应操作处理，结合实施例1制得的已修饰纳米金的丝网印刷电极作为工作电极，用105>

如图5所示，对照组的电流响应值最大，姜黄素干预组次之，Aβ_25-35诱导AD模型组电流响应值最小。由此可知，姜黄素干预后多巴胺表达量增加，表明姜黄素对神经细胞有保护作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。