一种改善女性孕产妇肠道菌群的益生菌的培养方法和应用

摘要

本发明公开了一种改善女性孕产妇肠道菌群益生菌的培养方法和应用。在含有促进益生菌生长繁殖的促生长因子的培养基中添加多孔材料，培养基与多孔材料的体积比为1：0.001–1：1000，再在培养基中接种益生菌并进行培养，实现益生菌高密度培养；所获得的益生菌可用于制备食品、食品添加剂、医药、饲料或者环保处理等产品。本发明获得高密度益生菌具有良好的耐热性、耐酸性及耐药性等性能，在食品、医药、饲料、环保等领域有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种改善女性孕产妇肠道菌群的益生菌的培养方法和应用，属于微生物制剂培养技术领域。

背景技术

益生菌，英文probiotics一词由希腊语“for live”派生而来，译为“为了生命”，是含有生理活性的活菌，当被机体经过口服或其他给药方式摄入适当的数量后，能够定植于宿主并改善宿主微生态平衡，从而发挥有益作用。近年来的研究表明，人体内的细菌多达1000多种，特别是胃肠道内的细菌最为丰富，占全身微生态菌总数80％左右，是人体细胞的10倍，被誉为人类的“第二基因组”。这些细菌有助于人体消化食物，产生维生素以预防食物中细菌所诱发的疾病，同时刺激免疫系统。随着研究的深入，发现肠道微生物在许多慢性疾病和症状中，如炎症、肥胖、糖尿病、还有癌症等也起了关键作用。微生物的数量和基因数量惊人，强烈影响人类的健康。这些发现为益生菌产品在食品、保健品、医药、养殖、环境、卫生用品等领域的应用带来了巨大的推动力。目前，益生菌被广泛用于酸奶、乳酸菌饮料、益生菌粉剂、动物饲料、环境治理等产品中，形成了相对完整和成熟的益生菌行业。

值得注意的是，益生菌只有达到一定的数量水平时，益生菌才能在宿主体内产生相应的效果。所以，以益生菌为功能成分的食品、保健品或药品需要保证所含活的益生菌数量保持在一定的水平。这一需求对益生菌的生产和制备提出了相应的要求。在益生菌的培养过程中，实现高密度培养，不但可以满足后续益生菌产品的功能需求，还可以提高益生菌生产环节中的生产效率，减少培养体积，缩短生产周期，降低生产成本。因此，益生菌的高密度培养是当前益生菌开发和生产中的关键技术问题。

液体发酵体系中，中国发明专利(公开号：CN 101230323A)在培养过程中添加碱性盐和脱氧剂以消除嗜酸乳杆菌或两歧双歧杆菌发酵时所受到的胁迫物质酸或氧，使最终产品中活菌数量提高2-4倍。中国发明专利(公开号：CN 101418270A)在干酪乳杆菌Zhang的培养过程中，通过加入NaOH、KOH或氨水等中和剂和通氮气的方法，得到1011CFU/mL以上活菌数的干酪乳杆菌的冻干菌粉。Hayakawa K等人(J Ferment Bioeng,1990,70,404)采用膜技术与发酵罐偶联，不断过滤除去乳酸等胁迫成分，实现最高菌体密度高达1011CFU/mL，该方法需耗费大量培养基，且仅限于实验室水平，很难扩大到生产应用规模。

半固体或固体发酵体系中，中国发明专利(公开号：CN 105132321A)采用由麦麸和豆粕等物质组成的培养基，接种屎肠球菌进行固态发酵，干燥产品中的活菌含量最高为3.8×1010CFU/g。

类似的还有中国专利(公开号：CN 101555510B；CN 101555511B；CN 103421710B；CN 102907563B；CN 103289937B；CN 1212391C)均采用豆粕、麸皮、玉米芯、米糠、花生壳、淀粉、玉米粉、草炭等农业废弃物或农产品为主要成分的固体培养基，接种微生物，进行高密度发酵，产品中的活菌数基本为1011CFU/g。这类产品主要用于动物饲料或进行药物等代谢产物生产。

益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌、酵母菌等。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌，其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。

益生菌的益处非常多，如预防或改善腹泻、缓解不耐乳糖症状、预防生殖系统感染、增强人体免疫力、促进肠道消化系统健康、降低血清胆固醇和帮助吸收营养成分。

常见的益生菌如双歧杆菌是人体内存在的一种生理性细菌，它与人体的健康密不可分，如双歧杆菌将糖分解后生成乳酸和醋酸，使肠道呈酸性，其结果能控制由有害菌引起的异常发酵，并且刺激肠蠕动，起到解除便秘的作用，双歧杆菌制剂还可以抑制产生毒素的有害菌数量，从而对肝脏患者起到良好的治疗作用，另外双歧杆菌等有益菌可以影响胆固醇的代谢，将其转化为人体不吸收的类固醇，降低血液中胆固醇的浓度，因而对高血压和动脉硬化有一定的防治作用。

还有常见的乳杆菌是细菌的一科，为革兰氏染色阳性、无芽孢杆菌，乳酸菌在自然界中分布很广，在植物体表、乳制品、肉制品、啤酒、葡萄酒、果汁、麦芽汁、发酵面团、污水以及人畜粪便中，均可分离到。中国传统的食品，如泡菜、榨菜、腌菜和酿酒等的制作保藏技术就是利用了乳酸菌的这一作用，对肠道及吸收好。

人体许多健康问题都是由体内菌群失衡引起，决定因素是微生态的平衡，可通过使体内菌群重新达到生态平衡来实现缓解与治疗的目的。比如腹泻、便秘、阴道感染等综合症状，国内外已经经过多年的研究和实践，证明使用特定的经临床证实的益生菌可有效地进行治疗。

这些发现为益生菌产品在食品、保健品、医药、养殖、环境、卫生用品等领域的应用带来了巨大的推动力。目前，益生菌被广泛用于酸奶、乳酸菌饮料、益生菌粉剂、动物饲料、环境治理等产品中，形成了相对完整和成熟的益生菌行业。

如中国专利201110442521.9公开了一种食物产品，涉及优先用于儿科年龄的人的负载量高且负载量稳定的益生细菌的施用形式，该发明还涉及巧克力味的益生菌补充剂，特别是包含内部部分和外部部分的益生菌片剂，但该发明的口味为巧克力味，限制了消费者人群，虽然该发明的食品深受儿童的喜爱，但大部分成年人并不喜爱食用巧克力味的食品，并且该食品也不适合大量食用。

另外，怀孕和哺乳是妈妈的两个特殊身体时期，这个阶段如果生病，很容易陷入无要可用的窘境，此时补充益生菌，一方面可以提高妈妈的抵抗力，另一方面也能改善妈妈的健康不适症状。另外很多孕产妇都会容易发生便秘，在这个时候益生菌就能发挥很好的作用了，因为益生菌有预防和缓解便秘的作用，益生菌是指通过调节肠道内菌群，改善肠道健康的活菌，益生菌能调节肠道菌群平衡，维持肠道健康的活性微生物。益生菌不但可以预防过敏体质，而且还可以提高孕产妇和宝宝的免疫力，孕产妇适量服用益生菌有利于健康。

如中国专利201110442521.9公开了一种复合益生菌、其在治疗过敏性疾病中的应用及孕产妇防过敏益生菌冲剂，该发明的复合益生菌其由乳双歧杆菌Bi-07、鼠李糖乳杆菌LR22、嗜酸乳杆菌NCFM组成，不仅能刺激动物体内IFN-γ和IL-2的分泌，而且可以抑制免疫球蛋白E(IgE)和IL-4的分泌，从而起到预防和治疗过敏性疾病，且药效试验表明，该药物制剂对提高IL-2和IFN-γ具有显著作用。另外，与对照组性比，试验组的IgE含量也明显降低，但该发明并没有给出如何高密度高活性的培养该复合益生菌的方法，因此该发明中的复合益生菌很可能会随着时间的推移，有益菌的数量迅速减少，从而失去健康价值。

因此，提供一种能够改善孕产妇肠道菌群的益生菌组合物具有很大的现实意义。所以，目前需要一种改善女性孕产妇肠道菌群益生菌的培养方法和应用；需要一种改善女性孕产妇肠道菌群多样性的益生菌组合物。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种改善女性孕产妇肠道菌群益生菌的培养方法和应用，其特征在于包括如下步骤：

本发明采用的技术方案如下：

在含有促进益生菌生长繁殖的促生长因子的培养基中添加多孔材料，培养基与多孔材料的体积比为1：0.001–1：1000，再在培养基中接种益生菌并进行培养，实现益生菌高密度培养。

所述培养为厌氧培养，所接种的益生菌为厌氧或兼性厌氧的微生物。

厌氧培养是在30-42℃下培养12-48h。

培养结束后，所述益生菌聚集到多孔材料的表面或者内部或者表面和内部，得到干燥后的产品中总活菌数可达1011-1015CFU/g以上。活菌数受干燥方法等因素的影响，冷冻干燥的产品中活菌数更高。

所制备得到的益生菌具有良好的耐热性、耐酸性及耐药性等性能。

所述的培养基为液态、半固态或者固态，培养体系可为液体培养、半固体培养和固体培养三种培养方式中的任一种，所述的多孔材料为固态。

本发明公开了一种改善女性孕产妇肠道菌群多样性的益生菌组合物，该益生菌组合物含有抗性糊精、菊粉、低聚果糖、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌等多，该益生菌组合物能够改善女性孕产妇肠道菌群，而且还可以通过添加麦芽糖，和调节低聚果糖和菊粉的重量比，以及抗性糊精和鼠李糖乳杆菌的重量比，显著提高益生菌组合物中益生菌的存活率，延长益生菌组合物的保存期限。本发明涉及一种改善肠道菌群多样性的组合物，具体地，涉及一种改善女性孕产妇肠道菌群多样性的益生菌组合物。

该益生菌组合物中含有多种益生菌，使各种益生菌通过相互作用有效改善了女性孕产妇肠道菌群，而且本发明所制备的益生菌组合物具有高活性的特点，经过长时间的常温存放，依然保持了较高的益生菌活性。

说明：本发明中所有的份数均是指重量份。

一种益生菌组合物，按重量份包括：

抗性糊精40-60份、菊粉5-15份、低聚果糖5-15份、乳双歧杆菌2-8份、鼠李糖乳杆菌2-10份、干酪乳杆菌2-8份、嗜酸乳杆菌2-8份、瑞士乳杆菌2-10份、罗伊氏乳杆菌2-8份、鼠李糖乳杆菌2-10份和发酵乳杆菌2-10份；

优选地，所述的益生菌组合物按重量份包括：抗性糊精40-55份、菊粉5-12份、低聚果糖5-12份、乳双歧杆菌2-6份、鼠李糖乳杆菌2-8份、干酪乳杆菌2-6份、嗜酸乳杆菌2-6份、瑞士乳杆菌2-8份、罗伊氏乳杆菌2-8份、鼠李糖乳杆菌2-8份和发酵乳杆菌2-8份；

进一步优选地，所述的益生菌组合物按重量份包括：抗性糊精45-55份、菊粉8-12份、低聚果糖8-12份、乳双歧杆菌4-6份、鼠李糖乳杆菌5-8份、干酪乳杆菌4-6份、嗜酸乳杆菌4-6份、瑞士乳杆菌5-8份、罗伊氏乳杆菌5-8份、鼠李糖乳杆菌5-8份和发酵乳杆菌5-8份；

所述益生菌组合物中，添加的益生菌是以菌粉的形式进行添加；

所述益生菌组合物中，低聚果糖和菊粉添加的重量比为1-3:1；优选地，低聚果糖和菊粉添加的重量比为1-1.5:1；更优选地，低聚果糖和菊粉添加的重量比为1:1。

所述益生菌组合物中，抗性糊精和鼠李糖乳杆菌添加的重量比为4-30:1；优选地，抗性糊精和鼠李糖乳杆菌添加的重量比为8-20:1；更优选地，抗性糊精和鼠李糖乳杆菌添加的重量比为3:1。

在一些优选的实施例中，所述的益生菌组合物中还含有麦芽糖0.5-3份；在一些更优选的实施例中，所述的益生菌组合物中还含有麦芽糖0.5-2.5份；

在一些更优选的实施例中，所述益生菌组合物中低聚果糖和菊粉的重量比为1:1。

在一些优选的实施例中，所述益生菌组合物中抗性糊精和鼠李糖乳杆菌的重量比为8-10:1；

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所述益生菌组合物，其中各菌株之间能够相互作用更好地促进女性孕产妇胃肠对营养物质的吸收，能够增加有益菌含量，起到促进消化，刺激肠道免疫细胞，增强女性孕产妇肠道免疫力等作用。

(2)本发明通过添加麦芽糖，调节抗性糊精和鼠李糖乳杆菌的重量比，以及低聚果糖和菊粉的重量比，明显提高了组合物中的益生菌在保存过程中的稳定性。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

该实施例的益生菌组合物按重量份包括：抗性糊精40份、菊粉5份、低聚果糖10份、乳双歧杆菌2份、鼠李糖乳杆菌2份、干酪乳杆菌2份、嗜酸乳杆菌8份、瑞士乳杆菌10份、罗伊氏乳杆菌8份、鼠李糖乳杆菌10份和发酵乳杆菌10份；

该实施例的益生菌组合物中，添加的益生菌是以菌粉的形式进行添加；

该实施例的益生菌组合物中，低聚果糖和菊粉的重量比为2:1；

该实施例的益生菌组合物中，抗性糊精和鼠李糖乳杆菌的重量比为9:1。

实施例2

该实施例中益生菌组合物按重量份包括：抗性糊精50份、菊粉10份、低聚果糖10份、乳双歧杆菌5份、鼠李糖乳杆菌6份、干酪乳杆菌4份、嗜酸乳杆菌6份、瑞士乳杆菌6份、罗伊氏乳杆菌6份、鼠李糖乳杆菌6份和发酵乳杆菌6份；

该实施例的益生菌组合物中，添加的益生菌是以菌粉的形式进行添加；

该实施例的益生菌组合物中，低聚果糖和菊粉的重量比为1:1；

该实施例的益生菌组合物中，抗性糊精和鼠李糖乳杆菌的重量比为8.3:1。

实施例3

该实施例中益生菌组合物按重量份包括：抗性糊精60份、菊粉10份、低聚果糖15份、乳双歧杆菌8份、鼠李糖乳杆菌10份、干酪乳杆菌8份、嗜酸乳杆菌2份、瑞士乳杆菌2份、罗伊氏乳杆菌2份、鼠李糖乳杆菌2份和发酵乳杆菌2份；

该实施例的益生菌组合物中，添加的益生菌是以菌粉的形式进行添加；

该实施例的益生菌组合物中，低聚果糖和菊粉的重量比为1.5:1；

该实施例的益生菌组合物中，抗性糊精和鼠李糖乳杆菌的重量比为6:1；

实施例4

该实施例的益生菌组合物的组成和实施例1相同，唯一的区别在于:该实施例在实施例1的益生菌组合物的基础上，增加了麦芽糖1.5份。

对比例1

该实施例中益生菌组合物按重量份包括：抗性糊精35份、菊粉4份、低聚果糖4份、乳双歧杆菌1份、鼠李糖乳杆菌1份、干酪乳杆1份、嗜酸乳杆菌10份、瑞士乳杆菌12份、罗伊氏乳杆菌10份、鼠李糖乳杆菌12份和发酵乳杆菌12份；

该实施例的益生菌组合物中，添加的益生菌是以菌粉的形式进行添加；

该实施例的益生菌组合物中，低聚果糖和菊粉的重量比为1:1；

该实施例的益生菌组合物中，抗性糊精和鼠李糖乳杆菌的重量比为35:1。

对比例2

该实施例中益生菌组合物按重量份包括：抗性糊精66份、菊粉16份、低聚果糖16份、乳双歧杆菌10份、鼠李糖乳杆菌12份、干酪乳杆10份、嗜酸乳杆菌1份、瑞士乳杆菌1份、罗伊氏乳杆菌1份、鼠李糖乳杆菌1份、发酵乳杆菌1份；

该实施例的益生菌组合物中，添加的益生菌是以菌粉的形式进行添加；

该实施例的益生菌组合物中，低聚果糖和菊粉的重量比为1:1；

该实施例的益生菌组合物中，抗性糊精和鼠李糖乳杆菌的重量比为5.5:1。

实验例1菌群丰度的检测

对实施例1-4和对比例1-2中的益生菌组合物进行菌群丰度的检测：菌群丰度的测定方法：取生长状态良好且处于孕期和产期的雌性大鼠各35只，且体重均为250-350g,将70只雌鼠随机分成7组，每组5只孕期雌鼠和5只产期雌鼠，共10只；其中4组为实验组，3组为对照组，在相同的环境下，统一喂养2周，接着对雌鼠进行连续15天的灌胃，按照剂量为20g/kg进行灌胃，实验组采用本发明实施例1-4中的益生菌组合物进行灌胃，对照组采用对比例1-2中的益生菌组合物以及生理盐水作为空白对照进行灌胃，15天灌胃结束后，收集雌鼠的粪便样品，用于全菌群的16S rRNA基因调查分析，检测雌鼠体内菌群的丰度，并求组内平均值，检测结果如表1所示；

说明：(1)本发明中嗜酸乳杆菌的存活率，是指将固体饮料在25℃的条件下放置4个月后嗜酸乳杆菌的存活率；(2)本发明表格中的“-”表示，该项不存在。

将实施例1-4和对比例1-2及空白对照进行比较，可以发现，本发明通过在组合物中添加多种益生菌，能够将大鼠体内菌群的丰度由400提升到450以上。

表1

实验例2益生菌保存期限测试

将实施例1-3和对比例1-2中的益生菌组合物进行保存期限测试：37℃的环境保存192小时，并在0小时、6小时、12小时、18小时、24小时、48小时96小时、144小时和192小时分别对益生菌进行存活量测试并求平均值，结果如表2所示；

可以发现，添加了1.5份麦芽糖的实施例4中的益生菌存活率在经过192小时保存过程中，均明显高于其他实施例和对比例；另外，将实施例2与除实施例4的其他实施例和对比例进行对比时发现，实施例2的益生菌存活率均高于除实施例4的其他实施例和对比例，

即，申请人意外的发现当在益生菌组合物中添加1.5份的麦芽糖后，益生菌组合物的保存期限明显变长；另外，当益生菌组合物中低聚果糖和菊粉的重量比为1:1，且同时抗性糊精和鼠李糖乳杆菌的重量比为8-10:1时，益生菌组合物的保存期限明显较长。

表2