异克舒令在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用

摘要

本发明公开了异克舒令在制备预防或治疗流感病毒感染药物中的应用。申请人在人肺上皮细胞系A549和人单核细胞系U937上检测了异克舒令对细胞的毒性，又在完全无毒性的浓度范围内测定了异克舒令在两种细胞系中的抗病毒活性，结果显示这种小分子化合物具有显著的抗病毒活性，且抗病毒作用呈剂量依赖效应。在致死性小鼠流感感染模型中，使用异克舒令治疗感染小鼠，可以有效降低感染小鼠肺洗液中的病毒滴度、延缓小鼠体重下降速度、延长小鼠存活时间并提高小鼠存活率。因此，本发明披露的异克舒令是一种新型抗流感病毒药物，具备安全性好、选择指数高且动物模型实验有效等优点，可以用于开发预防或治疗流感病毒感染的药物，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，主要涉及异克舒令在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用。

背景技术

流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，流感病毒属。根据病毒粒子核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分为A、B、C三型，也称甲、乙、丙三型。A型流感病毒全基因组由8条大小不等的单股负链RNA组成，分别以节段1至节段8命名。病毒基因组全长约13.6kb，编码10种结构蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非结构蛋白(NS1)。根据病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可进一步分为17个H(H1-H17)和10个N(N1-N10)亚型。人流感病毒主要是H1,H2和H3亚型。而目前危害严重的高致病性禽流感多为H5、H7和H9亚型，其中以H5N1亚型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆发，仅在人和海豹中发现。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，可感染人类和猪。

流感病毒自20世纪初发现以来已在全球范围内造成五次大流行，十年左右会产生一次暴发流行，在全球范围内造成了巨大的损失。流感流行每年可导25万～50万例死亡，300万～500万重病例，全球约共有5～15％的人被感染。接种疫苗和使用抗病毒药物是应对流感大流行的重要手段，然而由于流感病毒抗原变异能力强，在大流行前基本上不可能大规模生产疫苗。目前，经美国食品和药物管理局(FDA)批准正式上市的抗流感病流感病毒有预防和治疗作用，研究表明此类药物具有神经毒性等毒副作用，而且由于耐药株的普遍存在，所以CDC建议此类药物不再用于预防流感病毒感染。(2)神经氨酸酶抑制剂，此类药的代表是奥斯他韦和扎拉米韦。此类药物对所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年来关于奥斯他韦的耐药株不断有报道。因此，研究并开发新型抗流感病毒药物有重要意义

异克舒令(Isoxsuprine)，又称苯氧丙酚胺，是一类血管扩张药，用于治疗脑血管和外周血管疾病，也用于防止新生儿早产。其药理作用表现为阻断a胆碱能受体及激动β胆碱能受体的作用，也具有直接舒张血管平滑肌及子宫平滑肌的作用。故可舒张脑血管、骨骼肌血管及皮肤血管，也有正性肌力效应。但到目前为止，并未发现任何关于异克舒令抗流感病毒的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供了异克舒令或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用，从而为临床上流感的治疗提供一种安全有效的小分子化合物。异克舒令在无毒性范围内能够有效地抑制流感病毒的复制，可进一步开发为治疗或预防流感病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。异克舒令的英文名为Isoxsuprine，化学名为苯氧丙酚胺，具有结构式Ⅰ所示的结构：

为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案是：

异克舒令或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用：

1 在体外细胞流感感染模型中评价异克舒令的毒性、抗病毒活性并计算其选择指数，其步骤如下：

(1)将人肺泡巨噬细胞系A549和单核细胞系U937以合适密度铺至96孔板中，若要检测抗病毒效果，则同时感染合适浓度的流感H1N1病毒

(2)同时加入用培养基稀释成不同浓度梯度的异克舒令，培养48h。

(3)检测药物处理组与未处理组的细胞活力，以检测异克舒令的细胞毒性。

(4)检测药物处理组与未处理组上清中流感病毒神经氨酸酶活性，以评估异克舒令抗病毒活性。

(5)计算异克舒令在两种细胞系上的选择指数。

2 在致死性动物流感感染模型中评价异克舒令在动物活体内的抗病毒效果，其步骤如下

(1)建立致死性小鼠流感感染动物模型

(2)通过腹腔给药的方式用异克舒令治疗感染小鼠，连续七天，每天两次

(3)感染后第三天，即病毒复制高峰期，取对照组与药物处理组小鼠肺灌洗液，检测其中流感病毒滴度

(4)每天记录小鼠体重，死亡率，并绘制体重变化曲线和小鼠存活率曲线

(5)以感染后小鼠体重变化、存活率、肺灌洗液中病毒滴度来评价异克舒令效果。

所述的流感病毒包括但不限于：甲型流感病毒H1N1亚型(A/PuertoRico/8/1934)、H3N2亚型(A/Human/Hubei/3/2005)、H7N8亚型(A/Duck/Hubei/216/1983)以及B型流感病毒(B/Human/Hubei/1/2007)。

本发明的保护范围还包括：

异克舒令或其药学上可接受的盐在制备体外抑制流感病毒复制药物中的应用；

异克舒令或其药学上可接受的盐作为唯一有效成分在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用；

异克舒令或其药学上可接受的盐在制备治疗小鼠流感病毒感染药物中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1 异克舒令是小分子化合物，其在A549细胞和U937细胞中CC₅₀(半数致死浓度)均大于1000.0μM。异克舒令在两种细胞系上能够剂量依赖的抑制流感病毒复制，其在U937细胞中的EC₅₀(半数抑制浓度)仅为2.4μM，在A549上的EC₅₀为3.3μM。通过计算，异克舒令的选择指数(SI)在两种细胞系上均大于300，说明其具有安全高效的特点。

2 异克舒令在小鼠致死性流感感染模型中有效果，可以显著降低小鼠体重下降程度，降低小鼠肺洗液中的病毒滴度，提高小鼠的存活时间和最终生存率。这使得异克舒令具有非常大的临床治疗潜力。

3 异克舒令已经上市多年，安全性良好，且具有大量的临床实验数据，若将其作为流感治疗用药，可显著降低临床试验时间，节省大量成本。

附图说明

图1异克舒令在U937中的毒性及抗病毒效果；

图1中A为不同浓度异克舒令处理后U937细胞活力；

图1中B为不同浓度异克舒令在U937上对H1N1流感病毒的抑制率。

图2异克舒令在A549中的毒性及抗病毒效果；

图2中A为不同浓度异克舒令处理后A549细胞活力；

图2中B为不同浓度异克舒令在A549上对H1N1流感病毒的抑制率。

图3异克舒令在小鼠致死性流感感染模型中的效果；

图3中A为小鼠体重变化曲线

图3中B为小鼠存活率曲线

图4小鼠感染后第三天肺洗液中病毒滴度。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术；所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

目前，抗流感病毒药物评价模型主要分为体外模型(in vitro model)和体内模型(in vivo model)。

体外模型主要使用各种流感敏感细胞系或流感病理相关细胞系对药物进行评价，其优点在于可提供大量遗传性状相同的细胞为研究对象，操作方便，可消除其它外界因素的影响，并可以检测药物毒性、有效浓度和选择指数指数，为后期机理研究提供更多基础。体内模型一般使用各种模式动物感染模型，通过药物处理后的各种表型指标来衡量药物在活体动物内的整体效果。其优点是可对候选药物在活体内的效果进行真实、系统的评价。本发明采用与流感病理密切相关的人源肺上皮细胞系A549和人单核细胞系U937对异克舒令的体外抗流感效果进行定量分析，并计算其选择指数。随后，采用致死性小鼠流感感染模型，对异克舒令的体内抗流感效果进行真实系统的评价。

实验材料：

(1)实验所需细胞系、实验动物及病毒

U937和A549细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC)；

SPF级6至8周龄Balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司

所用毒株：

A型流感病毒H1N1亚型(A/PuertoRico/8/1934)H3N2亚型(A/Human/Hubei/3/2005)和H7N8亚型(A/Duck/Hubei/216/1983)

B型流感病毒(B/Human/Hubei/1/2007)

(2)实验所需药物

本发明实施例所用的异克舒令为盐酸异克舒令购自sigma公司；细胞实验时，药物用DMSO溶解；动物实验时采用无菌PBS溶解。

(3)实验所需试剂：

RPMI-1640培养基，胎牛血清(FBS)均购自于GIBCO公司；

4-methylumbelliferyl-α-N-acetyl-neuraminate(MUNANA)购自Sigma。

MTS细胞增殖检测试剂盒购自Promega公司

(4)实验所需仪器：

EnSpire多功能酶标仪购自PerkinElmer公司

CO2细胞培养箱购自Thermo公司

实施例1：异克舒令在U937细胞系中的抗流感病毒活性的评价

1 细胞培养

取冻存复苏后的细胞经过2次传代后，用含10％胎牛血清和双抗(青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml)的RPMI-1640培养基扩培，接种密度不低于5x10⁵cell/ml，传代密度不高于2x10⁶cell/ml。

2 异克舒令的细胞毒性检测

U937细胞按1.5×10⁵细胞/孔(体积100μl)接种于96孔细胞培养板中；用每孔100μl培养基液(RPMI-1640培养基+10％血清+双抗)配制药物，并加入相应细胞孔中混匀。药物设定7个浓度梯度，每个梯度浓度设2个复孔，其终浓度为15.6μM、31.25μM、62.5μM、125.0μM、250.0μM、500.0μM和1000μM。培养48h后，细胞培养板用1500rpm/min离心3min，弃上清。向剩余细胞中加入含有20％MTS试剂的无血清RPMI-1640培养基100μl，37℃育1h，1500rpm/min离心3min后用EnSpire酶标仪检测OD490读数，计算细胞存活率。

细胞存活率(％)＝药物处理组/未处理对照组*100％

结果如图1中A所示，异克舒令以最高浓度1000μM处理U937细胞48h后，细胞活力与对照组相比仍无明显差别，说明异克舒令在此浓度下对细胞没有毒性，其半数毒性浓度CC₅₀大于1000μM。

3 异克舒令对流感病毒株A/PuertoRico/8/34(H1N1)的抗病毒活性

3.1 实验原理：MUNANA(4-methylumbelliferyl-α-N-acetyl-neuraminate)是流感病毒神经氨酸酶的特异性底物，在神经氨酸酶作用下产生的催化产物在355nm激发光照射下，可以产生460nm荧光，荧光强度的强弱代表了病毒神经氨酸酶表达量的多少，反映了培养细胞上清中的病毒量。

3.2 将U937细胞按1.5×10⁵细胞/孔(体积100μl)接种于96孔细胞培养板中，感染组加入0.1MOI的H1N1PR8病毒，同时加入各梯度浓度的药物(以125μM为起始浓度，连续2倍梯度稀释8个梯度，每梯度两个复孔)至总体积为200μl的培养液(RPMI-1640培养基+10％血清+双抗)，于细胞培养箱中37℃培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶表达量的检测。

3.3 在黑底不透明96孔微量板中加入20μl缓冲液(32.5mmol/L MES，pH 6.5，4mmol/L CaCl₂)配制的底物20umol/L>

3.4 计算各检测孔中药物对流感病毒复制的抑制率

抑制率(％)＝100-(药物处理孔-空白对照)/(病毒对照孔-空白对照)*100％

结果如图1中B所示，异克舒令明显抑制了流感病毒复制，并且呈剂量依赖关系，其半数有效浓度EC₅₀约为2.4μM。

3.5 药物选择指数计算

药物选择指数(SI)用于判断药物效果的安全范围，选择指数大于1.00以上为有效，指数越大安全范围越大。其计算公式为：SI＝CC₅₀/EC₅₀

结合上述数据，异克舒令在U937上抗流感病毒的选择指数大于400，属于安全高效的抗流感病毒药物。

实施例2：异克舒令在A549细胞系中的抗流感病毒活性的评价

本实验使用类似实施例1的方法在人源肺上皮细胞A549中，评价异克舒令的效果。

由于A549为贴壁细胞，在检测药物毒性和抗病毒活性时，其在96孔板中所需细胞数为1.5×10⁴细胞/孔，并需要提前24小时铺细胞，在感染前换液，其余操作与实施例1一致。

1 药物毒性

结果如图2中A所示，异克舒令以最高浓度1000μM处理A549细胞48h后，细胞活力与对照组相比仍无明显差别，说明异克舒令在此浓度下对细胞没有毒性，其半数毒性浓度CC₅₀大于1000μM。

2 抗病毒活性

结果如图2中B所示，异克舒令明显抑制了流感病毒复制，并且呈剂量依赖关系，其半数有效浓度EC₅₀约为3.3μM。

3 药物选择指数计算

结合上述数据，异克舒令在U937上抗流感病毒的选择指数大于300，属于安全高效的抗流感病毒药物。

实施例3：异克舒令在U937细胞系中的抗其他流感病毒活性的评价

本实施例用H3N2亚型(A/Human/Hubei/3/2005)和H7N8亚型(A/Duck/Hubei/216/1983)以及B型流感病毒(B/Human/Hubei/1/2007)分别感染U937细胞系，方法同实施例1，结果证实，异克舒令明显抑制了这三种流感病毒复制，并且呈剂量依赖关系，属于广谱的抗流感病毒药物。

实施例4：异克舒令在小鼠致死性流感感染模型中的抗病毒效果评价

1 实验流程：

1)将6-8周龄BALB/c小鼠随机分为药物评价组、阴性对照组(PBS)，每组8只。正式实验前，老鼠适应环境2～3d。

2)正式感染前24h开始给药，一直持续到感染后第6天，共计给药7天。采用腹腔注射给药，剂量为50mg/kg早晚各一次，间隔12小时，每天定时称量每组动物体重，观察小鼠生存状况。

3)染毒当天，小鼠经1％戊巴比妥钠轻度麻醉(每克体重约0.1ml麻醉药)，然后用移液枪采用滴鼻方式感染2LD50的H1N1鼠肺适应株病毒液20μl。

4)染毒后3d，每组小鼠处死3只，解剖取肺，每只肺用0.2ml肺灌洗液(含0.1％BSA的PBS)反复洗3-4次，收集肺洗液，通过TCID₅₀实验测定各组药物处理肺部病毒滴度平均值。

5)给药完成后，继续每天观察记录小鼠的体重和症状，定时更换和添加垫料、饮水和食物，及时取出死亡小鼠，直至实验完成。

6)根据统计结果，绘制出体重变化曲线和存活率曲线。

2 实验结果

体重变化结果如图3中A所示，小鼠给药后，相比病毒对照组，异克舒令组处理小鼠平均体重下降趋势显著减低。

存活率结果如图3中B所示，病毒对照组于小鼠感染后第12天全部死亡，而异克舒令处理组小鼠感染后第18天仍有20％小鼠存活。

肺洗液病毒滴度检测结果如图4所示，感染后第三天肺灌洗液中,对照组病毒滴度为5.3Log₁₀TCID₅₀/mL，而异克舒令处理组为4.5Log₁₀TCID₅₀/mL和对照组相比降低约0.8个Log值。

上述结果说明，异克舒令在小鼠体内有明显的抗病毒效果。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。