嘉宝果myb转录因子McMYB与李bHLH转录因子PsbHLH及其应用

摘要

本发明涉及一种嘉宝果myb转录因子McMYB、蛋白及其应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了一种嘉宝果myb转录因子McMYB，所述McMYB的核苷酸序列具有如序列表SEQ ID No.1所示。所述嘉宝果myb转录因子McMYB调控参与嘉宝果花色苷生物合成的myb基因的表达，研究发现McMYB基因表达与不同发育阶段嘉宝果果皮花色苷含量呈正相关，可强烈诱导烟草叶片积累花色苷。这表明本发明提供的McMYB能有效调控植物花色苷生物合成。嘉宝果myb转录因子McMYB对花色苷生物合成具有转录调控作用，可应用到植物花色苷生物合成中。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种嘉宝果myb转录因子McMYB、蛋白及其应用。

背景技术

嘉宝果(Myrciaria cauliflora)原产巴西，果皮中富含花色苷等生物活性物质。花色苷对人体有很好的保健作用，具有预防心血管疾病、神经疾病、癌症、糖尿病和阿兹海默症等疾病以及增强视力敏锐性等功能。

植物花色苷生物合成途径是类黄酮合成途径的一个分支，是目前研究较为清楚的次生代谢途径。花色苷合成受转录因子MYB、bHLH和WD40重复蛋白协同调控，MYB、bHLH和WD40重复蛋白形成MBW复合体并结合到花色苷合成途径的结构基因启动子的顺势作用元件上，激活这些结构基因的转录。鉴定出参与嘉宝果花色苷生物合成调控的MYB转录因子，对于阐明嘉宝果果皮积累大量花色苷的转录调控机制具有重要意义，且可应用于其他植物的基因工程改良，提高食物中的花色苷含量，增加食物的保健功能，具有重要的应用价值。但是现有技术中调控嘉宝果花色苷生物合成途径研究较少，还没有报道的有效调控嘉宝果花色苷生物合成的转录因子。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的调控花色苷的转录因子，嘉宝果myb转录因子McMYB、蛋白及其应用，所述McMYB的表达量与花色苷的含量呈正相关，利用基因工程技术实现提高植物中花色苷生物合成的含量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种嘉宝果myb转录因子McMYB，所述McMYB的核苷酸序列具有如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明提供了一种用于扩增所述McMYB的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列具有如序列表SEQ ID No.2所示；所述下游引物的核苷酸序列具有如序列表SEQ ID No.3所示。

本发明提供了一种所述McMYB的扩增方法，包括以下步骤：

(1)以嘉宝果果皮为材料提取总RNA，以提取的总RNA为模板进行逆转录，得到cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，用所述的引物进行PCR扩增，得到的PCR产物为McMYB。

优选的，所述PCR扩增的反应体系为50μl，所述反应体系如下：Mix液25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L上游引物2μl，cDNA 1μl，ddH₂O>

优选的，所述PCR扩增的反应程序如下：90℃预变性3min；98℃15s，56℃15s和72℃20s，35个循环；72℃5min。

本发明提供了一种包含所述McMYB的重组载体。

本发明提供了一种包含所述McMYB或所述重组载体的重组菌。

本发明提供了一种由所述McMYB表达的蛋白，所述蛋白的氨基酸具有如序列表SEQID No.4所示。

本发明提供的所述McMYB、所述引物、所述方法扩增得到McMYB、所述重组载体、所述重组菌或所述的蛋白在植物花色苷生物合成中的应用。

本发明提供的嘉宝果myb转录因子McMYB，参与嘉宝果花色苷生物合成调控的myb基因，研究发现McMYB基因表达与不同发育阶段嘉宝果果皮花色苷含量呈正相关。这表明本发明提供的McMYB能有效调控植物花色苷生物合成。

本发明提供的所述McMYB、所述引物、所述方法扩增得到McMYB、所述重组载体、所述重组菌或所述的蛋白在植物花色苷生物合成中的应用。诱导花色苷积累分析研究表明，在烟草叶片中瞬时过量表达McMYB，可使叶片中积累花色苷，着紫红色。本发明提供的嘉宝果McMYB对花色苷生物合成具有转录调控作用，可应用到植物花色苷生物合成的基因工程中。

附图说明

图1为不同发育阶段嘉宝果果皮中花色苷含量及McMYB基因表达模式分析；

图2为不同处理组的烟草瞬时过表达McMYB情况。

具体实施方式

本发明提供了一种嘉宝果myb转录因子McMYB，所述McMYB的核苷酸序列具有如序列表SEQ ID No.1所示。所述myb转录因子McMYB的生物来源为嘉宝果。所述McMYB的核苷酸序列长度为732bp。

本发明提供了一种用于扩增所述McMYB的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列具有如序列表SEQ ID No.2所示；所述下游引物的核苷酸序列具有如序列表SEQ ID No.3所示。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，委托本领域所熟知的引物合成公司即可。在本发明实施例中，所述引物委托尚亚生物公司合成。

本发明提供了一种所述McMYB的扩增方法，包括以下步骤：

(1)以嘉宝果果皮为材料提取总RNA，以提取的总RNA为模板进行逆转录，得到cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，用所述的引物进行PCR扩增，得到的PCR产物为McMYB。

在本发明中，所述嘉宝果果皮优选为黑色果皮。所述提取总RNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的总RNA提取试剂盒法即可。本发明对所述总RNA提取试剂盒的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的试剂盒即可。在本发明实施例中，所述总RNA提取试剂盒购自Omega Bio-tek的EZNA Plant RNA Kit。

在本发明中，所述逆转录的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的逆转录试剂盒即可。本发明对所述逆转录试剂盒的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的逆转录试剂盒即可。在本发明实施例中，所述逆转录试剂盒购自Fermentas公司生产的First-StrandcDNA Synthesis Kit。

在本发明中，所述PCR扩增的反应体系优选为50μl，所述反应体系优选如下：Mix液25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L上游引物2μl，cDNA 1μl，ddH₂O>

在本发明中，将得到的PCR产物进行测序，得到McMYB的核苷酸序列。本发明对测序的方法没有特殊限制，委托本领域所熟知的测序公司即可。在本发明实施例中，所述测序委托尚亚生物公司进行。

为了研究所述McMYB的表达水平，本发明优选提供了采用实时荧光定量法对所述McMYB进行扩增。所述采用实时荧光定量法对所述McMYB进行扩增用引物优选采用荧光定量检测引物。所述荧光定量检测引物包括正向引物和反向引物。所述正向引物的核苷酸序列具有如序列表中CTTCTCGAAGAGCTCGGCAT(SEQ ID No.5)和GGTGTGGAGTCCTTCGTCAG(SEQ IDNo.6)所示。所述反向引物的核苷酸序列具有如序列表中SEQ ID No.6所示。所述荧光定量法对所述McMYB进行扩增的反应程序优选如下：95℃5min；95℃5s，退火15s，72℃30s，40个循环。本发明优选以嘉宝果actin为内参基因，引物为TGCAGACAGGATGAGCAAGG(SEQ IDNo.7)和ACCGGATTCATCGTACTCGC(SEQ ID No.8)。

本发明提供了一种包含所述McMYB的重组载体。所述重组载体中的载体优选为pCAMBIA1302。所述重组载体中，McMYB和载体的连接多克隆位点为NcoI酶和BstEII酶的酶切位点。

在本发明中，所述包含所述McMYB的重组载体的制备方法，优选包括以下步骤：

A.以上述方案得到的PCR产物为模板，用带接头的特异性引物进行扩增，得到带接头的McMYB片段；

B.用NcoI和BstEII酶切的载体和所述带接头的McMYB片段，得到线性的载体和黏性末端的McMYB片段；

C.将得到的线性的载体和黏性末端的McMYB片段进行连接，得到连接产物；

D.将所述连接产物进行筛选，得到的阳性质粒为包含所述McMYB的重组载体。

在本发明中，所述带接头的特异性引物包括带接头的正向引物和带接头的反向引物。所述带接头的正向引物的核苷酸序列如序列表中

本发明提供了一种包含所述McMYB或所述重组载体的重组菌。所述重组菌的菌优选为农杆菌。所述农杆菌的菌株优选为GV3101。本发明对所述GV3101的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的商业购买途径即可。

在本发明中，所述重组菌的制备方法，优选包括以下步骤：

Ⅰ.将上述方案得到的阳性质粒导入农杆菌中，筛选，得到重组菌。

本发明对所述导入农杆菌的方法优选为采用氯化钙法。

本发明对所述筛选的方法是采用菌落PCR法进行。所述菌落PCR法是以导入后的农杆菌为模板按照上述方案所述扩增方法得到。

本发明提供了一种由所述McMYB表达的蛋白，所述蛋白的氨基酸具有如序列表SEQID No.4所示。

本发明提供的所述McMYB、所述引物、所述方法扩增得到McMYB、所述重组载体、所述重组菌或所述的蛋白在植物花色苷生物合成中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的一种嘉宝果myb转录因子McMYB、蛋白及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

嘉宝果McMYB基因克隆

(一)实验方法

以嘉宝果绿色果皮和黑色果皮为材料，构建文库进行转录组测序，通过转录组差异表达分析，筛选出一个可能参与嘉宝果花色苷生物合成调控的MYB转录因子McMYB。根据CDS序列，设计特异引物对ATGGCCACGCCGCCGAGCAG(SEQ ID No.3)和CATGACATCTGATGTAATTAGGAGTC(SEQ ID No.4)，进行PCR扩增获得McMYB编码区序列，并进行测序验证。PCR反应体系为50μl，成分分别为：I-5TM2xHigh-Fidelity Master Mix 25μl，上下游引物(10μM)各2μl，cDNA 1μl，H₂O>

(二)实验结果

经测序验证，获得与嘉宝果转录组数据库相匹配的McMYB序列，见序列表中SEQ IDNo.1。采用软件将所述McMYB序列翻译为蛋白，见序列表SEQ ID No.4。

实施例2

嘉宝果果皮花色苷含量检测以及McMYB基因表达模式分析

(一)实验方法

嘉宝果果实发育时期：绿色阶段和黑色阶段果实。嘉宝果果实每个发育时期设置3个生物学重复，每个重复10个果实。将果皮取下后用液氮冻存后放于-80℃待用。

称取0.5g果皮在液氮中磨成粉末，样品粉末加入5ml含有0.05％HCl的甲醇，4℃浸提24h，然后8,000×g离心20min。分别取上清1mL与4mL缓冲液A(0.4mol/L KCl，pH 1.0)或缓冲液B(1.2N柠檬酸，pH4.5)混合，并测定510和700nm(A510和A700)。花色苷含量参照Romero et al.(2008)的方法进行计算。公式如下：TA＝A×MW×5×100×V/e，TA为总花色苷含量(mg/100g)，V为溶液体积(mL)，A＝[A510(pH 1.0)-A700(pH 1.0)]-[A510(pH4.5)-A700(pH 4.5)]。e为26,900，分子量(MW)为449.2(Wrolstad et al.,1982)。每个生物学重复样品重复3次。

采用EZNA Plant RNA Kit(Omega Bio-tek)进行RNA的提取。按照First-StrandcDNA Synthesis Kit(Fermentas)试剂说明书操作合成cDNA。以嘉宝果actin为内参基因，引物为TGCAGACAGGATGAGCAAGG(SEQ ID No.7)和ACCGGATTCATCGTACTCGC(SEQ ID No.8)，McMYB引物为CTTCTCGAAGAGCTCGGCAT(SEQ ID No.5)和GGTGTGGAGTCCTTCGTCAG(SEQ IDNo.6)。qPCR反应体系为20μl，包含10μL 2×SYBR Premix Ex Taq^TM>2O作反应模版的阴性对照。

(二)实验结果

图1为不同发育阶段嘉宝果果皮中花色苷含量及McMYB基因表达模式分析。花色苷含量分析和基因表达分析结果表明，McMYB基因表达与不同发育阶段嘉宝果果皮花色苷含量呈正相关。

实施例3

含转录因子McMYB基因的重组基因工程菌的制备

利用特异引物对：ACGGGGGACTCTTGACATGGCCACGCCGCCGAGCAG(SEQ ID No.9，含NcoI酶切位点)和ATTCGAGCTGGTCACCCATGACATCTGATGTAATTAGGAGT(SEQ ID No.10，含BstEII酶切位点)，以实施例1中获得的产物为模板进行PCR反应，体系参照上述RACE反应体系和反应条件。将获得的PCR产物回收后，采用Aidlab One Step Seamless Cloning kit将目的片段连接到经NcoI和BstEII酶切的pCAMBIA1302载体中，测序验证。然后将阳性质粒导入农杆菌菌株GV3101中，获得含转录因子McMYB基因的重组基因工程菌，即含有超量表达载体的农杆菌菌株GV3101。

实施例4

诱导花色苷积累分析

(一)实验方法

有关psbhlh的信息如下:(方法和mcmyb一样)

(1)以芙蓉李果肉为材料提取总RNA，以提取的总RNA为模板进行逆转录，得到cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，用引物(ATGGCTGCACCGCCAAGTAGC，SEQ ID No.11和CTAGGAATCAGATTGGGGAATTATTTG，SEQ ID No.12)进行PCR扩增，得到的PCR产物为PsbHLH。

(3)利用特异引物对：

ACGGGGGACTCTTGACCATGATGGCTGCACCGCCAAGTAGC(SEQ ID No.13，含NcoI酶切位点)和GGACTCTTGACCATGCGATGGCTGCACCGCCAAGTAGC(SEQ ID No.14，含BstEII酶切位点)，以获得的产物为模板进行PCR反应。PCR反应的程序：90℃预变性3min，35个循环的98℃15s，56℃15s和72℃20s，72℃5min。

(4)将获得的PCR产物回收后，将目的片段连接到经NcoI和BstEII酶切的pCAMBIA1302载体中，测序验证。然后将阳性质粒导入农杆菌菌株GV3101中，获得含转录因子PsbHLH基因的重组基因工程菌，即含有超量表达载体的农杆菌菌株GV3101。

选取长势优良本氏烟草，用实施例3制备的含有超量表达载体的农杆菌菌株GV3101以叶片中心叶脉为分界线，用无针头注射器在不同叶片中分别注射含有pCAMBIA1302、pCAMBIA1302-McMYB、pCAMBIA1302-PsbHLH和pCAMBIA1302-McMYB+pCAMBIA1302-PsbHLH的农杆菌菌液，烟草于14h:10h光暗周期、24℃和70％空气湿度的条件下培养5天。

(二)实验结果

图2为不同处理的烟草瞬时过表达McMYB的情况。分析结果显示，注射含pCAMBIA1302-McMYB+pCAMBIA1302-PsbHLH农杆菌的烟草叶片积累花色苷，着紫红色，而单独注射pCAMBIA1302-PsbHLH农杆菌的烟草叶片没有积累花色苷，颜色没有发生变化。这说明McMYB和PsbHLH基因同为myb基因的互作因子，两者基因的共同作用myb基因调控花色苷的合成。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院果树研究所

<120> 嘉宝果myb转录因子McMYB与李bHLH转录因子PsbHLH及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 732

<212> DNA

<213> Myrciaria cauliflora

<400> 1

atgaagggag caataggagt gagaaaaggt gcgtggactg aggaagagga cgtgttgctg 60

aagaagtgcg tggaaagata tggcgtagga aactggcacc aagtcccacg cagagcaggg 120

ttgaacaggt gcaggaaaag ttgcaggttg aggtggttga actatctgca gcccaacatc 180

gagagagggg cgttccggga ggacgaggtc gacatgatca tcaggcttca caagcttctt 240

ggcaatcgat ggtcattgat tacggggaga cttccgggaa gaactgcgaa tgacgtcaag 300

aactactgga acactcactt ggccaaaaag gtcatcaatc acaagccgaa ggaagatgac 360

ccgcccgaga agttcgccgc caaagtgaac gtcatacggc ctcgaccttc aaccttctcg 420

aagagctcgg catggttcaa gggaaaagca acgctagtgg ctccaaggac tccactaggc 480

ggaaaccctg gacaaccatc tccaatgttg tctcgtcagg acaaggagag tgcgtggtgg 540

gagaatctat tcgtcgccag cagccctgac gaaggactcc acacctcaag aagcggctcg 600

gaaggacagc cggacgcgag cttgtggccg catgaacttg ccatggaaga gggacgaaat 660

ggttggaacg agcactcttt cgacgcggac atttgggaac ttcttggtgc aaaccctcaa 720

ctcgtgatct ag 732

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggccacgc cgccgagcag 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgacatct gatgtaatta ggagtc 26

<210> 4

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Gly Ala Ile Gly Val Arg Lys Gly Ala Trp Thr Glu Glu Glu

1 5 1015

Asp Val Leu Leu Lys Lys Cys Val Glu Arg Tyr Gly Val Gly Asn Trp

202530

His Gln Val Pro Arg Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser Cys

354045

Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Gln Pro Asn Ile Glu Arg Gly Ala

505560

Phe Arg Glu Asp Glu Val Asp Met Ile Ile Arg Leu His Lys Leu Leu

65707580

Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Thr Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr Ala

859095

Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Ala Lys Lys Val Ile

100 105 110

Asn His Lys Pro Lys Glu Asp Asp Pro Pro Glu Lys Phe Ala Ala Lys

115 120 125

Val Asn Val Ile Arg Pro Arg Pro Ser Thr Phe Ser Lys Ser Ser Ala

130 135 140

Trp Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Val Ala Pro Arg Thr Pro Leu Gly

145 150 155 160

Gly Asn Pro Gly Gln Pro Ser Pro Met Leu Ser Arg Gln Asp Lys Glu

165 170 175

Ser Ala Trp Trp Glu Asn Leu Phe Val Ala Ser Ser Pro Asp Glu Gly

180 185 190

Leu His Thr Ser Arg Ser Gly Ser Glu Gly Gln Pro Asp Ala Ser Leu

195 200 205

Trp Pro His Glu Leu Ala Met Glu Glu Gly Arg Asn Gly Trp Asn Glu

210 215 220

His Ser Phe Asp Ala Asp Ile Trp Glu Leu Leu Gly Ala Asn Pro Gln

225 230 235 240

Leu Val Ile

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttctcgaag agctcggcat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtgtggagt ccttcgtcag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcagacagg atgagcaagg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accggattca tcgtactcgc 20

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acgggggact cttgacatgg ccacgccgcc gagcag 36

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

attcgagctg gtcacccatg acatctgatg taattaggag t 41

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggctgcac cgccaagtag c 21

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctaggaatca gattggggaa ttatttg 27

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgggggact cttgaccatg atggctgcac cgccaagtag c 41

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggactcttga ccatgcgatg gctgcaccgc caagtagc 38