一种能完全分离(-)-石杉碱甲与(+)-石杉碱甲的分析方法

摘要

本发明涉及一种能完全分离(‑)‑石杉碱甲与(+)‑石杉碱甲的分析方法，包括以下内容：将配制的(‑)‑石杉碱甲和(+)‑石杉碱甲的混合溶液注入以多聚糖衍生物为固定相的高效液相色谱仪中，用乙酸铵溶液与乙腈或醇类组成的流动相体系进行冲洗分离。本发明的检测方法，通过检测产品中的(+)‑石杉碱甲的含量，不仅可以直观的反映出产品的质量且为拆分工艺提供帮助；而且本方法虽然使用手性色谱柱，但采用反相色谱条件，液相设备无需进行正反相的切换，省时省力省事；本发明的分析方法，也可将色谱柱调整为制备柱，用于拆分制备(‑)‑石杉碱甲。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种能完全分离(-)-石杉碱甲与(+)-石杉碱甲的分析方法。

背景技术

石杉碱甲：化学名称为(1R,9S,13E)-1-氨基-13-亚乙基-11-甲基-6-氮杂三环[7.3.1.0]十三-2(7),3,10-三烯-5-酮，分子量为242。

本品为一种可逆性胆碱酯酶抑制剂，对真性胆碱酯酶具有选择性抑制作用。生物活性高，有较高的脂溶性，分子小，易透过血脑屏障，进入中枢后较多地分布于大脑的额叶、颞叶、海马等与学习和记忆有密切联系的脑区，在低剂量下对乙酰胆碱酯酶(AChE)有强大的抑制作用，使分布区内神经突触间隙的乙酰胆碱(ACh)含量明显升高，从而增强神经元兴奋传导，强化学习与记忆脑区的兴奋作用，起到提高认知功能、增强记忆保持和促进记忆再现的作用。目前发现(+)-石杉碱甲与乙酰胆碱的结合度较差，远低于(-)-石杉碱甲。人工合成的方法得到的为(±)-石杉碱甲的外消旋混合物，要得到高纯度的(-)-石杉碱甲则需要对混合物进行分离。

现有技术中对(±)-石杉碱甲异构体的分离均使用正相分离条件，首先需切换反相体系，将其转换为正相体系，需要消耗人力及时间，经常切换对设备有损耗；其次，正相条件下的色谱峰峰形较差，理论塔板数偏低。目前暂无文献报道能完全分离(-)-石杉碱甲和(+)-石杉碱甲的反相分离条件。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能完全分离(-)-石杉碱甲与(+)-石杉碱甲的分析方法，此方法的理论塔板数、分离度、拖尾因子等均满足药物分析检测的要求，检测便捷，适合于(-)-石杉碱甲和(+)-石杉碱甲的分离与检测，解决了现有技术中存在的频繁切换正反相体系造成对液相设备的损耗，消耗大量人力及时间；以及正相条件下的色谱峰峰形较差，理论塔板数偏低的问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下的技术方案，一种能完全分离(-)-石杉碱甲与(+)-石杉碱甲的分析方法，所述方法包括：通过反相高效液相色谱法从含有(-)-石杉碱甲与(+)-石杉碱甲的混合溶液中分离出(-)-石杉碱甲；所述(-)-石杉碱甲和(+)-石杉碱甲用水和有机溶剂的混合溶液溶解得到；所述高效液相色谱法所用的流动相由流动相A与流动相B组成：所述流动相A为乙酸铵水溶液，所述流动相B为乙腈或醇类；所述高效液相色谱所用的固定相包含多聚糖衍生物。

作为本发明的进一步改进，所述(-)-石杉碱甲和(+)-石杉碱甲的浓度为0.005～2mg/mL，更优选为0.01mg/mL。

作为本发明的进一步改进，所述流动相A中乙酸铵水溶液的浓度范围为15～25mmol/L，更优选为20mmol/L。

作为本发明的进一步改进，所述流动相A中乙酸铵水溶液的pH范围为5.5～6.5，优选为6.0。

作为本发明的进一步改进，所述流动相B优选为乙腈，因为乙腈的粘度低，系统压力小；截止波长低有利于基线稳定。

作为本发明的进一步改进，所述水和有机溶剂的混合溶液中有机溶剂选自乙腈或醇类有机溶剂，所述醇类有机溶剂包括甲醇、乙醇或异丙醇；因流动相组成一般含乙腈，为减小溶剂效应，有机溶剂优选乙腈。

作为本发明的更进一步改进，所述水和有机溶剂的混合溶液，为减小溶剂效应并结合样品溶解度考虑，优选50％乙腈水溶液作为溶剂来配制。

作为本发明的进一步改进，当流动相B为乙腈时，为得到更好的峰形，梯度洗脱，在0～20分钟内，流动相A与流动相B的体积比为4～1:1。

作为本发明的进一步改进，使用的流速为0.5～1.0mL/min，优选0.7mL/min。

作为本发明的进一步改进，所述固定相包含多聚糖衍生物，包括三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)直链淀粉、三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)纤维素、三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)纤维素、三(3,5-二氯-苯基氨基甲酸酯)纤维素或其混合物，优选表面涂覆有三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)纤维素的硅胶。

作为本发明的进一步改进，所述反相高效液相色谱法所用的手性柱的柱温范围为30～40℃，温度低影响峰形，温度高对色谱柱的损耗大，优选柱温为35℃。

作为本发明的进一步改进，所述反相高效液相色谱法利用紫外灯检测器进行检测，所述检测波长为230～330nm，排除低波段，选石杉碱甲的最大吸收为检测波长，优选310nm。

与现有技术相比，本发明分析检测方法的优点在于：不仅能彻底分离(-)-石杉碱甲和(+)-石杉碱甲，并且液相设备无需进行正反相的切换，比正相体系使用更便捷，且流动相组成常见、配制简单，省事省力，且所用试剂相对于正相试剂价格更低，可节省成本；分析时间短，省时；分离度、拖尾因子、理论塔板数均有较满意的结果。本发明为分析方法，也可将色谱柱调整为制备柱用于拆分制备(-)-石杉碱甲。

附图说明

图1是根据实施例1得到的HPLC图谱。

图2是根据实施例2得到的HPLC图谱。

图3是根据实施例3得到的HPLC图谱。

具体实施方式

为便于本领域技术人员理解本发明内容，下面将结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案，但以下内容不应以任何方式限制本发明权利要求书请求保护的范围。

实施例中“保留时间”、“分离度”、“拖尾因子”、“理论塔板数”的释义与公式如下所示：

保留时间(t_R)：指样品自进样至经洗脱的样品出现最大色谱峰响应所需的时间。

分离度(R_s)：指某混合物中两组分的分离情况。可通过以下公式计算：

Rs＝2(t_R2-t_R1)(W₁+W₂)

式中，t_R2和t_R1分别为两物质的保留时间，W₁和W₂分别为在其基部相应的峰宽，由该峰延长相对直的两边至基线相交获得。

拖尾因子(As)：即对称因子，可通过以下公式计算：

As＝W_0.05/2f

式中，W_0.05是峰高5％处的峰宽，f为峰顶点至峰前沿间的距离，这个距离应从基线以上峰高的5％处测得。

理论塔板数(N)：是柱效的衡量方法。可通过以下公式计算：

N＝16(t_R/W)²

式中，t_R是该物质的保留时间；W是此峰在其基部的峰宽，由该峰延长相对直的两边至基线相交获得。

实施例1

实验条件：

设备：Agilent 1260高效液相色谱仪。

色谱柱：以硅胶表面涂覆有三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)纤维素为固定相，大赛璐CHIRALCEL OZ-RH 5μm 4.6mm×250mm。

流动相A为20mmol/L乙酸铵水溶液，pH 6.0，流动相B为乙腈，梯度洗脱，在0～20分钟内，流动相A与流动相B的体积比为4～1:1；流速为0.7mL/min，检测波长为310nm，柱温35℃，进样量5μL。

系统适应性溶液的制备：取(-)-石杉碱甲和(+)-石杉碱甲用50％乙腈水溶液配制成浓度各为0.01mg/mL的混合溶液。取上述溶液注入液相色谱仪中，记录色谱图，考察分离度、拖尾因子、理论塔板数。

HPLC分析图见图1所示，各项参数见下表：

实施例2

实验条件：

设备：Agilent 1260高效液相色谱仪。

色谱柱：以硅胶表面涂覆有三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)纤维素为固定相，大赛璐CHIRALCEL OZ-RH 5μm 4.6mm×250mm。

流动相A为15mmol/L乙酸铵水溶液，pH 5.5，流动相B为乙腈，梯度洗脱，在0～20分钟内，流动相A与流动相B的体积比为4～1:1；流速为1.0mL/min，检测波长为310nm，柱温40℃，进样量5μL。

系统适应性溶液的制备：取(-)-石杉碱甲和(+)-石杉碱甲用50％乙腈水溶液配制成浓度各为0.01mg/mL的混合溶液。取上述溶液注入液相色谱仪中，记录色谱图，考察分离度、拖尾因子、理论塔板数。

HPLC分析图见图2所示，各项参数见下表：

实施例3

实验条件：

设备：Agilent 1260高效液相色谱仪。

色谱柱：以硅胶表面涂覆有三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)纤维素为固定相，大赛璐CHIRALCEL OZ-RH 5μm 4.6mm×250mm。

流动相A为25mmol/L乙酸铵水溶液，pH 6.5，流动相B为乙腈，梯度洗脱，在0～20分钟内，流动相A与流动相B的体积比为4～1:1；流速为0.5mL/min，检测波长为310nm，柱温30℃，进样量5μL。

系统适应性溶液的制备：取(-)-石杉碱甲和(+)-石杉碱甲用50％乙腈水溶液配制成浓度各为0.01mg/mL的混合溶液。取上述溶液注入液相色谱仪中，记录色谱图，考察分离度、拖尾因子、理论塔板数。

HPLC分析图见附图3所示，各项参数见下表：