一种葱属植物鳞茎组织培养方法

摘要

本发明公开一种葱属植物鳞茎组织培养方法，包括如下步骤：选取葱属植物地下鳞茎为外植体，消毒处理；将外植体接种于含有浓度为0.1‑0.5mg/L的2,4‑二氯苯氧乙酸、0.1‑1.0mg/L的噻苯隆和0.5‑1.5mg/L的维生素B6的MS培养基中，依次进行热激处理、避光培养和光照培养；将外植体移植到含有浓度为0.1‑0.5mg/L的吲哚丁酸、0.1‑1.0mg/L的噻苯隆和8‑10mg/L的维生素B1的White培养基中生根培养。本发明根据不同培育阶段的营养需要，使用不同的培养基，同时辅助相应的培育手段，协同作用，有效提高不定芽诱导效率和生根率，提高增殖率，增殖时间短，繁育速度快。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及到一种葱属植物鳞茎组织培养方法。

背景技术

葱属植物是我国的重要蔬菜和调味品，在日本、韩国及东南亚国家也应用较多。传统的繁殖方式多通过分球或种子繁殖，但种球或种子的产生需要3-4年，播种生产受季节或气候限制，繁殖数量有限，且葱属植物多为异花授粉作物，多代自交衰退严重，不能保证繁殖品质。另外，葱属植物的部分植株长期处于地下，易受病毒感染，一旦种球或种子感染病毒，无法根除，导致繁殖后代品质大幅度下降。

植物组织培养技术是在无菌条件下，将性状优良的植物的器官、组织、细胞等在人工配制的培养基上，给予适宜的条件进行培养，诱导产生不定芽和不定根，从而培育获得完整的植株。例如，中国专利文献CN105265316B公开的一种葱属植物鳞茎盘快速繁殖方法，该方法是将葱属植物中心部位清洗、消毒后，在中心部位距底端3-5mm处横切以去除上部鳞片，再沿主生长点垂直切线纵向分割成4份，去除主生长点及主生长点所在的鳞茎盘，利用剩余部分诱导丛生芽，并培养成苗。上述技术采用的是pH5.8，MS+6-BA 0.1-2.0mg/L、NAA 0.05-1.0mg/L的培养基进行诱导培养，虽然在培养4周后鳞茎盘的最大增殖系数可达20，但该技术依然存诱导效率低，增殖率低的缺陷。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中利用植物组织培养技术培育葱属植物的诱导效率较低，增殖率低的缺陷，从而提供一种高效的葱属植物鳞茎组织培养方法。

为此，本发明提供了一种葱属植物鳞茎组织培养方法，包括如下步骤：

(1)选取葱属植物的地下鳞茎作为外植体，除去外部鳞茎后，进行消毒处理；

(2)将消毒处理后的所述外植体接种于含有浓度为0.1-0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.1-1.0mg/L的噻苯隆和浓度为0.5-1.5mg/L的维生素B₆的MS培养基中，而后对所述外植体依次进行热激处理、避光培养和光照培养；

(3)将步骤(2)中得到的所述外植体移植到含有浓度为0.1-0.5mg/L的吲哚丁酸、浓度为0.1-1.0mg/L的噻苯隆和浓度为8-10mg/L的维生素B₁的White培养基中进行生根培养。

优选地，当不定根长至3-5cm时，移植到育苗基质中培养成苗。

所述的葱属植物鳞茎组织培养方法，所述步骤(1)中，所述消毒处理的方法为：将所述外植体用自来水冲洗10-20min后，用体积百分比浓度为70-75％的酒精冲洗10-20min，再浸泡于质量分数为0.1％的HgCl₂溶液中消毒8-12min后，取出后用无菌水冲洗4-6次，每次20-40s。

所述的葱属植物鳞茎组织培养方法，所述步骤(2)中所述MS培养基中含有质量分数为2-3％的蔗糖，所述MS培养基的pH值为5.8-6.5。

所述的葱属植物鳞茎组织培养方法，所述步骤(2)中所述热激处理的方法为，在30-40℃温度下避光培养3-5天。

所述的葱属植物鳞茎组织培养方法，所述步骤(2)中所述避光培养的方法为，在22-28℃下避光培养10-20天。

所述的葱属植物鳞茎组织培养方法，所述步骤(2)中所述光照培养的条件为，光照强度1000-1500Lx，光照时间14-20h/天，温度22-28℃，所述光照培养的时间为10-20天。

所述的葱属植物鳞茎组织培养方法，所述White培养基中含有质量分数为2-3％的蔗糖，所述White培养基的pH值为5.8-6.5。

所述的葱属植物鳞茎组织培养方法，所述步骤(3)中所述培养条件为光照强度1500-3000Lx，光照时间14-20h/天，温度22-28℃。

所述的葱属植物鳞茎组织培养方法，所述葱属植物包括但不限于葱、韭菜、蒜或洋葱中的至少一种。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供的葱属植物鳞茎组织培养方法，包括如下步骤：(1)选取葱属植物的地下鳞茎作为外植体，除去外部鳞茎后，进行消毒处理；(2)将消毒处理后的外植体接种于含有浓度为0.1-0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.1-1.0mg/L的噻苯隆和浓度为0.5-1.5mg/L的维生素B₆的MS培养基中，而后对外植体依次进行热激处理、避光培养和光照培养；(3)将步骤(2)得到的外植体移植到含有浓度为0.1-0.5mg/L的吲哚丁酸、浓度为0.1-1.0mg/L的噻苯隆和浓度为8-10mg/L的维生素B₁的White培养基中进行生根培养。本发明根据不同培育阶段的营养需要，使用不同的培养基，同时辅助相应的培育手段，协同作用，有效提高不定芽诱导效率和生根率，提高增殖率，增殖时间短，繁育速度快。

2、本发明提供的葱属植物鳞茎组织培养方法，诱导不定芽生长的MS培养基富含氮和钾，营养丰富，有加速愈伤组织和培养物生长的作用，其含有的2,4-二氯苯氧乙酸和噻苯隆配合作用，可促进外植体细胞生长分化，维生素B₆参与植物的氮代谢，提高组织分化能力，促进生长分化。

3、本发明提供的葱属植物鳞茎组织培养方法，诱导不定根生长的White培养基中无机盐浓度较低，适于用于生根培育，其含有的吲哚丁酸和噻苯隆配合作用，促进不定根生长，维生素B₁参与有机物的转化，促进吲哚丁酸诱导不定根的发育。

4、本发明提供的葱属植物鳞茎组织培养方法，通过热激处理、避光培养和光照培养诱导不定芽生长，热激处理可有效避免培育过程中褐变的发生，避光培养可防止迅速分裂的愈伤细胞老化，避光培养后再进行光照培养可诱导分化，提高不定芽的诱导效率。

5、本发明提供的葱属植物鳞茎组织培养方法，通过组织培养技术对葱属植物进行快速繁殖，不受季节、气候的影响，增殖率高，育苗时间短，获得的脱毒苗遗传稳定性好，品质高，操作简单，成本较低，适用于工厂化育苗。

具体实施方式

以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。

本发明所用MS培养基的制备方法如下：

1)母液配置

对照表1-4，分别称取各组分。

表1 MS大量元素母液配方

称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解后混合，最后定容到1L。

表2 MS微量元素母液配方

称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解后混合，最后定容到1L。

表3 MS肌醇母液配方

称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解后混合，最后定容到1L。

表4 MS铁盐母液配方

称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解后混合，最后定容到1L。

2)MS培养基配置

将步骤1)中的MS微量元素母液、MS肌醇母液、MS铁盐母液分别稀释100倍后与稀释了40倍的MS大量元素母液按等比例混合，即得。

本发明所用White培养基制备方法如下：

1)母液配置

对照表5-7，分别称取各组分。

表5 White大量元素母液配方

称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解后混合，最后定容到1L。

表6 White微量元素母液配方

称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解后混合，最后定容到1L。

表7 White有机物母液配方

称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解后混合，最后定容到1L。

2)White培养基配置

将步骤1)中的White微量元素母液、White有机物母液分别稀释100倍后与稀释了40倍的White大量元素母液按等比例混合，即得。

实施例1

本实施例提供了一种葱鳞茎组织培养方法，包括如下步骤：

(1)选取葱的地下鳞茎作为外植体，除去外部2层鳞茎后，用自来水冲洗15min后，用体积百分比浓度为75％的酒精冲洗15min，再浸泡于质量分数为0.1％的HgCl₂溶液中消毒10min后，取出后用无菌水冲洗5次，每次30s，然后用无菌纸除去表面水分；

(2)将消毒处理后的外植体接种于pH为6.2的MS培养基中，所用MS培养基含有浓度为0.3mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆和浓度为1.0mg/L的维生素B₆，以及3％的蔗糖，在35℃温度下避光培养4天后，在25℃下避光培养15天，然后在光照强度为1300Lx，温度为25℃的条件下，每天光照16h，培养15天；

(3)将步骤(2)得到的外植体移植到pH为6.2的White培养基中，所用White培养基含有浓度为0.3mg/L的吲哚丁酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆和浓度为9mg/L的维生素B₁，以及3％的蔗糖，在光照强度为2500Lx，温度为25℃的条件下，每天光照15h；

当不定根长至4cm时，移植到育苗基质中培养成苗。

实施例2

本实施例提供了一种韭菜鳞茎组织培养方法，包括如下步骤：

(1)选取韭菜的地下鳞茎作为外植体，除去外部1层鳞茎后，用自来水冲洗10min后，用体积百分比浓度为70％的酒精冲洗20min，再浸泡于质量分数为0.1％的HgCl₂溶液中消毒8min后，取出后用无菌水冲洗4次，每次40s，然后用无菌纸除去表面水分；

(2)将消毒处理后的外植体接种于pH为6.5的MS培养基中，所用MS培养基含有浓度为0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.1mg/L的噻苯隆和浓度为1.5mg/L的维生素B₆，以及2％的蔗糖，在30℃温度下避光培养5天后，在28℃下避光培养10天，然后在光照强度为1500Lx，温度为22℃的条件下，每天光照14h，培养20天；

(3)将步骤(2)得到的外植体移植到pH为5.8的White培养基中进行生根培养，所用White培养基含有浓度为0.5mg/L的吲哚丁酸、浓度为0.1mg/L的噻苯隆和浓度为10mg/L的维生素B₁，以及3％的蔗糖，在光照强度为1500Lx，温度为28℃的条件下，每天光照20h；

当不定根长至3cm时，移植到育苗基质中培养成苗。

实施例3

本实施例提供了一种蒜鳞茎组织培养方法，包括如下步骤：

(1)选取蒜的地下鳞茎作为外植体，除去外部2层鳞茎后，用自来水冲洗20min后，用体积百分比浓度为75％的酒精冲洗10min，再浸泡于质量分数为0.1％的HgCl₂溶液中消毒12min后，取出后用无菌水冲洗6次，每次20s，然后用无菌纸除去表面水分；

(2)将消毒处理过的外植体接种于pH为5.8的MS培养基中，所用MS培养基含有浓度为0.1mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为1.0mg/L的噻苯隆和浓度为0.5mg/L的维生素B₆，以及2.5％的蔗糖，在40℃温度下避光培养3天后，在22℃下避光培养20天，然后在光照强度为1000Lx，温度为28℃的条件下，每天光照20h，培养10天；

(3)将步骤(2)得到的外植体移植到pH为6.5的White培养基中进行生根培养，所用White培养基含有浓度为0.1mg/L的吲哚丁酸、浓度为1.0mg/L的噻苯隆和浓度为8mg/L的维生素B₁，以及2％的蔗糖，在光照强度为3000Lx，温度为22℃的条件下，每天光照10h；

当不定根长至5cm时，移植到育苗基质中培养成苗。

实施例4

本实施例提供了一种洋葱鳞茎组织培养方法，包括如下步骤：

(1)选取洋葱的地下鳞茎作为外植体，除去外部2层鳞茎后，用自来水冲洗18min后，用体积百分比浓度为72％的酒精冲洗14min，再浸泡于质量分数为0.1％的HgCl₂溶液中消毒11min后，取出后用无菌水冲洗5次，每次25s，然后用无菌纸除去表面水分；

(2)将消毒处理过的外植体接种于pH为6.0的MS培养基中，所用MS培养基含有浓度为0.4mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.8mg/L的噻苯隆和浓度为0.8mg/L的维生素B₆，以及2％的蔗糖，在37℃温度下避光培养3天后，在26℃下避光培养14天，然后在光照强度为1200Lx，温度为24℃的条件下，每天光照15h，培养17天；

(3)将步骤(2)得到的外植体移植到pH为6.4的White培养基中进行生根培养，所用White培养基含有浓度为0.2mg/L的吲哚丁酸、浓度为0.8mg/L的噻苯隆和浓度为10mg/L的维生素B₁，以及2.5％的蔗糖，在光照强度为2000Lx，温度为24℃的条件下，每天光照16h；

当不定根长至4cm时，移植到育苗基质中培养成苗。

对比例1

本对比例提供了一种葱鳞茎组织培养方法，包括如下步骤：

(1)选取葱的地下鳞茎作为外植体，除去外部2层鳞茎后，用自来水冲洗15min后，用体积百分比浓度为75％的酒精冲洗15min，再浸泡于质量分数为0.1％的HgCl₂溶液中消毒10min后，取出后用无菌水冲洗5次，每次30s，然后用无菌纸除去表面水分；

(2)将消毒处理后的外植体接种于pH为6.2的MS培养基中，所用MS培养基含有浓度为0.3mg/L的6-BA和浓度为0.1mg/L的NAA，在35℃温度下避光培养4天后，在25℃下避光培养15天，然后在光照强度为1300Lx，温度为25℃的条件下，每天光照16h，培养15天；

(3)将步骤(2)得到的外植体移植到pH为6.2的White培养基中进行生根培养，所用White培养基含有浓度为0.3mg/L的吲哚丁酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆和浓度为9mg/L的维生素B₁，以及3％的蔗糖，在光照强度为2500Lx，温度为25℃的条件下，每天光照15h。

对比例2

本对比例提供了一种葱鳞茎组织培养方法，包括如下步骤：

(1)选取葱的地下鳞茎作为外植体，除去外部2层鳞茎后，用自来水冲洗15min后，用体积百分比浓度为75％的酒精冲洗15min，再浸泡于质量分数为0.1％的HgCl₂溶液中消毒10min后，取出后用无菌水冲洗5次，每次30s，然后用无菌纸除去表面水分；

(2)将消毒处理后的外植体接种于pH为6.2的MS培养基中，所用MS培养基含有浓度为0.3mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆和浓度为1.0mg/L的维生素B₆，以及3％的蔗糖，在光照强度为1300Lx，温度为25℃的条件下，每天光照16h，培养34天；

(3)将步骤(2)得到的外植体移植到pH为6.2的White培养基中进行生根培养，所用White培养基含有浓度为0.3mg/L的吲哚丁酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆和浓度为9mg/L的维生素B₁，以及3％的蔗糖。

对比例3

本对比例提供了一种葱鳞茎组织培养方法，包括如下步骤：

(1)选取葱的地下鳞茎作为外植体，除去外部2层鳞茎后，用自来水冲洗15min后，用体积百分比浓度为75％的酒精冲洗15min，再浸泡于质量分数为0.1％的HgCl₂溶液中消毒10min后，取出后用无菌水冲洗5次，每次30s，然后用无菌纸除去表面水分；

(2)将消毒处理后的外植体接种于pH为6.2的MS培养基中，所用MS培养基含有浓度为0.3mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆和浓度为1.0mg/L的维生素B₆，以及3％的蔗糖，在35℃温度下避光培养4天后，在25℃下避光培养15天，然后在光照强度为1300Lx，温度为25℃的条件下，每天光照16h，培养15天；

(3)将步骤(2)得到的外植体移植到pH为6.2的MS培养基中进行生根培养，所用MS培养基含有浓度为0.3mg/L的6-BA和浓度为0.1mg/L的NAA。

对比例4

本对比例提供了一种葱鳞茎组织培养方法，包括如下步骤：

(1)选取葱的地下鳞茎作为外植体，除去外部2层鳞茎后，用自来水冲洗15min后，用体积百分比浓度为75％的酒精冲洗15min，再浸泡于质量分数为0.1％的HgCl₂溶液中消毒10min后，取出后用无菌水冲洗5次，每次30s，然后用无菌纸除去表面水分；

(2)将消毒处理后的外植体接种于pH为6.2的MS培养基中，所用MS培养基含有浓度为0.3mg/L的6-BA和浓度为0.1mg/L的NAA，在35℃温度下避光培养42天。

效果例1

本效果例比较了实施例1和对比例1、对比例2、对比例3及对比例4中葱鳞茎的增殖系数及生根率，具体结果见表8。

表8 增殖系数和生根率比较

序号接种数/个分化芽总数/个增殖系数生根率/％实施例150134826.96100对比例150114022.8099对比例250103220.64100对比例350115623.1287对比例45091718.3483

从表1中可看出，本发明实施例1提供的葱鳞茎组织培养方法具有较高的增殖系数，生根率达100％。

效果例2

本效果例比较了实施例1和对比例1、对比例2、对比例3及对比例4中得到的培养苗的平均直径和平均重量，具体结果见表9。

表9 平均直径和平均重量比较

从表9可以看出，本发明实施例1提供的葱鳞茎组织培养方法的培育速度快，培养效果好。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。