不影响蛋白质功能性质的磁性纳米颗粒在交联蛋白质基质中的包埋

摘要

本文公开了在目的蛋白质的交联基质中包埋磁性纳米颗粒，而不具有受影响的蛋白质的功能特性，以及其制备方法。此外，本文描述了在蛋白质基质中包埋的磁性纳米颗粒在诊断、固定和免疫沉淀试剂盒中的用途。

说明书

发明技术领域

本发明涉及在目标蛋白质的交联基质中包埋磁性纳米颗粒，而不影响蛋白质的功能性质。本发明还涉及在目标蛋白质的交联基质中包埋磁性纳米颗粒，用于生物应用的方法。

更具体地说，该方法涉及在特定温度和pH的条件下将磁性纳米颗粒和目标蛋白质一起孵育，然后用交联剂处理。

发明背景

包被有蛋白质的磁性颗粒已经在生物技术中发现了巨大的应用，其包括：(a)使用抗体包被的颗粒分离和扩增细胞，(b)使用蛋白A或G包被的颗粒进行抗体纯化和免疫沉淀，以及(c)固定酶等等。研究人员已经记录了用于制备具有不同物理和生化特性的磁性支持系统的各种方法[L.R.Witherspoon,S.E.Shuler,S.S.Gilbert,Estimation of Thyroxin,Triiodothyronine,Thyrotropin,Free Thyroxin,and Triiodothyronine Uptake by Useof Magnetic-Particle Solid Phases,Clin.Chem.31(1985)415-419]。不同类型的基于诸如Cu、Co、Fe、Ni等金属的磁性材料是可用的。磁性颗粒也可用作微米和纳米尺寸的颗粒，其可以根据测定的具体要求进行选择。氧化铁纳米颗粒被广泛使用，并具有在生物学和医学的应用中巨大的潜力。

由于氧化铁磁性纳米颗粒具有诸如超顺磁性、低毒性、高表面积、大比表面积和在外部磁场条件下容易分离的特点，其在过去的几十年中引起了很多关注。可以将不同类型的生物分子，如蛋白质、多肽、酶、抗体和抗癌剂固定在这些纳米颗粒上。用于固定目的的磁性载体或者通过在载体聚合物的合成过程中掺入磁性颗粒来制备，或者磁性颗粒本身用普通的支持材料如葡聚糖或者琼脂糖包被来制备。

在大多数可商购的产品中，将蛋白质附着到微米或亚微米大小的磁珠上，所述磁珠预先用稳定剂包被。例如Lauva等已经使用肝素稳定的胶体磁铁矿来结合来自全血的细胞[Lauva M.,Auzans E.,Levitsky V.and Plavins J,Selective HGMS of colloidalmagnetite-binding cells from whole blood.J.of Magnetism and MagneticMaterials,85(1990),295-298]。同样，Rusetski和Ruuge使用葡聚糖包被的磁铁矿作为药物载体[Rusetski,A.N.和Ruuge,E.K.(1990),Magnetic fluids as a possible drugcarrier for thrombosis treatment.J.Magn.Magn.Mater.85,299–302].Witherspoon等(1985)已经报道了使用硅烷包被的铁氧体颗粒进行放射性免疫测定。

有一些报告，其中研究者表明，有可能在交联剂如碳化二亚胺(CDI)的存在下，直接在新制备的磁铁矿颗粒上结合蛋白质分子[R.V.Mehta,R.V.Upadhyay,S.W.Charles,C.N.Ramchand,Direct binding of protein to magneticparticles.Biotechnol.Tech.11(1997)493-496]。Koneracka等已经使用碳化二亚胺方法将几种蛋白质直接结合到磁性颗粒上[Konerackáa M,Kopcanskya P,Timkoa M,RamchandCN,de Sequeirac A,Trevand M,Direct binding procedure of proteins and enzymestofine magnetic particles.J.Mol.Catal.B:Enzym.18(2002)13–18]。由于磁性颗粒是通过共沉淀法合成的，所以会形成大离子。所提出的这种结合的机制是两性羟基(-OH)基团的特异性吸附在碱性介质中赋予颗粒表面负电荷，在酸性介质中赋予颗粒表面正电荷。碳化二亚胺充当颗粒表面上的游离羟基与结合蛋白的-NH ₂基团之间的接头。

现有技术检索揭示了使用不同技术固定蛋白质和多糖的几种方法。“超顺磁性颗粒的形成”的专利(US20040146855)指出，其发明特征在于通过在交联淀粉基质中原位形成这些颗粒或通过形成超顺磁性壳聚糖材料来制备超顺磁性铁颗粒的方法。超顺磁性材料是由亚铁离子在碱性条件下与温和的氧化剂硝酸盐的温和氧化形成的，或者包埋在交联的淀粉基质中，或者包埋为壳聚糖-Fe(II)复合物。

另一件专利(WO2002098364A2)提供了结合部分-纳米颗粒偶联物、这些偶联物的聚集体的新型组合物，以及使用这些偶联物和聚集体的新方法。这些偶联物中的纳米颗粒可以是磁性金属氧化物，单分散或多分散的。结合部分可以是例如寡核苷酸、多肽或多糖。寡核苷酸序列与非聚合物表面官能化金属氧化物或与金属氧化物缔合的官能化聚合物连接。所述组合物可以用于体外检测靶分子(例如核酸和蛋白质)或作为磁共振(MR)造影剂检测活体内靶分子的分析。

美国专利US8420055B2中描述了另一种方法，其包括胺官能化磁性纳米颗粒组合物的合成和合成其的方法。该方法包括获得基本上纯形式的羧化聚合物，其用于制备基本上大小均匀的聚合物包被的羧基官能化磁性纳米颗粒。使用水溶性碳化二亚胺，随后与大量过量的二胺反应，将羧基转化为反应性伯氨基。然后使胺封端的纳米颗粒与双功能交联剂和各种生物分子反应以制备用于体外测定、细胞分选应用和靶特异性MRI造影剂的纳米颗粒。

美国专利US6689338B2描述了包括与生物载体分子共价连接的纳米颗粒的生物偶联物。纳米颗粒通常是放射性金属离子，最典型的是金属硫化物或金属氧化物。生物载体分子通常是单克隆抗体或单克隆抗体的片段，或对癌细胞具有已知亲和性的肽。除生物载体分子之外，一个或多个另外的不同生物部分可共价连接至纳米颗粒以增强其活性。该生物偶联物可用作有效的放射性药物，以在肿瘤治疗中传递放射性标签。

通常用于将蛋白质结合到磁性颗粒上的方法需要用聚合物对颗粒进行预包被，然后将蛋白质交联到包被材料上。在大多数目前的产品/方法中，使用交联剂将蛋白质与聚合物包被的磁性颗粒结合。在磁性颗粒上包被另一种材料的额外步骤增加了试剂的制备时间，并且额外的聚合物层可能干扰磁性。

因此，本领域仍然需要提供一种毒性更低，更少的时间消耗和方便的方式来将磁性纳米颗粒包埋在蛋白质基质中，这成为本发明的目的，为此寻求保护。因此，本发明的发明人提出了一种新的方法，其中使用环氧氯丙烷等环氧化物作为交联剂将磁性颗粒包埋在目的蛋白质的交联基质中。该方法允许从剩余的试剂中容易地分离固定的蛋白质或酶。由于这涉及到蛋白质和磁性颗粒之间的直接接触而没有任何干扰性聚合物质，所以不会有任何磁性损失。而且，酶/蛋白质的功能活性的改变不会发生。

发明目的

本发明的目的是提供一种将磁性纳米颗粒包埋在蛋白质或其片段的交联基质中，而不影响蛋白质的功能特性的方法。

本发明的另一个目的是提供包埋在蛋白质或其片段的交联基质中的磁性纳米颗粒在生物应用中的用途。

发明概述

一方面，本发明公开了使用交联剂将磁性纳米颗粒包埋在目标蛋白质的交联基质中。目标蛋白质以这样的方式交联形成基质，从而促进纳米颗粒包埋在内部，进而实现蛋白质的固定。这是直接缔合机制，其中使用没有任何种类的聚合物，如琼脂糖或葡聚糖的未包被的磁性纳米颗粒。

另一方面，本发明公开了在优选环氧化物的交联剂的存在下，在特定温度和pH的条件下，孵育蛋白质和磁性纳米颗粒时实现包埋的方法。

因此，将未包被的磁性纳米颗粒包埋在蛋白质的交联基质中的方法包括在pH为6-9的结合缓冲液中，在存在交联剂的情况下，在约4℃至30℃的温度将目的蛋白质与磁性纳米颗粒一起孵育1-72小时，可选地补充盐。

该方法用于制备基于磁性纳米颗粒的产品，其可用作诱饵用于细胞或蛋白质分离或用于产生固定化酶。

另一方面，本发明公开了包埋在与环氧氯丙烷交联的蛋白质基质中的未包被的磁性纳米颗粒(MNP)，其中包埋在蛋白质基质中的所述纳米颗粒的比例为约1:5至1:0.25，并且具有1至100nm的粒径。

有利地，通过本方法制备的本发明的磁性纳米颗粒-蛋白质偶联物用于蛋白质、酶、抗体、抗原、抗原蛋白质及其片段，以及RNA和DNA的固定、纯化和免疫沉淀。

另一方面，本发明公开了用于从生物样品中固定、鉴定和纯化IgG、Fab片段或单链变体、功能蛋白的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)包埋在交联蛋白质基质中，在5mM磷酸钠缓冲液，pH8.0中具有对IgG/Fab片段的亲和力的25μgm-10mg磁性纳米颗粒；

(b)25ml洗涤缓冲液，即1X磷酸盐缓冲液，pH8；

(c)50ml IgG/Fab片段洗脱缓冲液，即包含磷酸盐缓冲液pH，2.8；或甘氨酸，pH2；或L-精氨酸，pH3的酸性缓冲液；

(d)2ml中和缓冲液，即1M Tris，pH9.0；

(e)包含与使用该试剂盒有关的说明书和参数的目录。

因此，该诊断试剂盒用于检测生物样品中IgG的存在，所述的生物样品包括全血、血清、血浆和腹水、细胞培养基和细菌细胞裂解物。

另一方面，本发明公开了用于检测免疫原或抗原蛋白的免疫沉淀试剂盒，其包括：

(a)包埋在交联蛋白质基质中，在5mM磷酸钠缓冲液，pH8.0中具有对IgG/Fab片段的亲和力的25μgm-10mg磁性纳米颗粒；

(b)对待检测抗原具有特异性的一抗；

(c)1ml 1X十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲液；

(d)微型离心管；

(e)包含试剂盒使用说明的目录。

此外，本发明提供了包埋在蛋白质的交联基质中的磁性纳米颗粒用于生物应用的用途，所述的生物应用选自抗体或抗体片段、抗原性蛋白质、功能和结构蛋白的纯化；酶固定化，用于从生物来源分离不同细胞类型的抗体固定化；基于抗体的细胞分选；免疫沉淀如蛋白质免疫沉淀、染色质免疫沉淀、RNA免疫沉淀或类似的测定和技术。

附图简述

图1：交联剂对BSA固定在磁性纳米颗粒上的影响；

图2：使用交联剂固定在磁性颗粒上的HRP酶的活性；

图3：在不同的三天测量的游离HRP酶(未结合/游离)的活性(使用两种不同稀释度的酶(0.5和1U)。A和B代表在不同的两天，但是在相同的条件下进行的两个不同的实验)；

图4：通过包埋法将IgG固定到磁性颗粒上；

图5：固定化后直到第150天测量的固定化HRP酶(A)和游离酶(B)的活性；

图6：在不同实验条件下储存后，固定的和游离酶的活性描绘的温度和光敏度的改进。实验条件包括储存温度(室温和4℃)以及是否存在光线(未覆盖和覆盖)；

图7：通过非还原SDS-PAGE分析使用蛋白A-MNP(磁性纳米颗粒)纯化来自人血浆的完整IgG；[实验1：从50μl血浆中纯化IgG。实验2：与实验1相同。实验3：重复使用来自实验1的蛋白A-MNP的IgG的纯化]E1-E3：洗脱的IgG；

图8：使用蛋白A-MNP纯化来自细胞培养物上清液的IgG；E1-E4：分四步在L-精氨酸中洗脱的IgG；

图9：使用蛋白A-MNP纯化来自细菌裂解物的Fab；E1-E2代表在两步中洗脱的Fabs，M代表标准蛋白质标记物；

图10：免疫沉淀(IP)实验中蛋白A-MNP的抗体结合能力；

图11：SREBP裂解活化蛋白(SCAP)和固醇调节元件结合转录因子1a(SREBP-1a)的免疫共沉淀。使用蛋白A-MNP，其中M是标记物，A是阴性对照，B是与蛋白A-MNP的IP，C是与蛋白A-Sepharose的IP；

图12：谷胱甘肽-MNP的GST结合能力的检测：在图的顶部的1-7(从左到右)，不同量的GST酶的结合与洗脱表示不同量的洗脱的GST；

图13：使用谷胱甘肽-MNP从细菌培养物纯化GST-标记的重组蛋白质；

图14：通过本方法合成的磁性纳米颗粒的TEM图像：(A)未包被的磁性纳米颗粒和(B)包埋在交联蛋白质基质中的未包被的磁性纳米颗粒；

图15：使用磁力架轻松的分离固定的蛋白质。

发明详述

现在将结合某些优选的和可选的实施例来详细描述本发明，从而可以更全面地理解本发明的各个方面。

如本文所用，包埋的方法的术语，包括“固定”和“交联”，在本发明中可互换地使用。

本发明描述了使用交联剂，在没有聚合物的存在下，于目标蛋白质的交联基质中未包被的磁性纳米颗粒，即磁性纳米颗粒的包埋。

本发明中描述的技术是新型的，因为其首次演示了通过自身交联固定蛋白质并同时捕获蛋白质基质内的纳米磁性颗粒的方法。交联在交联剂存在下完成。

在一种优选的实施方案中，本发明提供了用于将未包被的磁性纳米颗粒包埋在蛋白质的交联基质中的方法，所述方法包括：在约4℃至30℃的温度，将目的蛋白质与磁性纳米颗粒在pH范围为6-9的结合缓冲液中与交联剂一起孵育1-72小时，可选地补充盐。

与上述实施方案一致，磁性纳米颗粒选自任何适宜的磁性材料或材料组合的合成类似物的氧化物，所述的磁性材料选自磁铁矿、钛尖晶石、赤铁矿、钛铁矿、磁赤铁矿、锰尖晶石、铁镍矿、镁铁矿、磁黄铁矿、硫复铁矿、硫铁矿、针铁矿、纤铁矿、六方纤铁矿、铁、镍、钴、铁镍矿、铁钴矿，或其任意组合。

适宜的交联剂包括但不限于环氧化物、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、碳化二亚胺、戊二醛等，优选的交联剂是环氧化物，如环氧氯丙烷。

在一种实施方式中，本发明提供了选自功能蛋白，例如酶、抗体分子、抗原蛋白、肽片段和其他结构蛋白(包括其组合和变体)的蛋白质的包埋。

酶选自过氧化物酶、淀粉酶、果胶酶、酯酶、蛋白酶、脂肪酶、连接酶、转移酶、合成酶、水解酶、氧化还原酶和异构酶。抗氧化剂选自谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等。抗体包括全长IgG、抗体的Fab片段、单链可变片段(scFv)及其变体。免疫原或抗原蛋白，免疫球蛋白结合蛋白例如细菌蛋白，包括蛋白A、蛋白G和蛋白L，及其他过敏原和其他蛋白。其他蛋白包括但不限于组蛋白、胎球蛋白、胃蛋白酶抑制剂等。载体蛋白或转运蛋白包括膜转运蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、肌红蛋白、细胞色素、卵清蛋白、血红蛋白和其他相关蛋白。功能蛋白选自但不限于细菌蛋白质如明胶、组蛋白及其组合，以及结构蛋白或其组合的任何变体。结构蛋白可选自明胶、胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白、角蛋白、肌动蛋白、辅肌动蛋白、钙粘蛋白、网格蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白、波形蛋白等及其组合，以及结构蛋白或其组合的任何变体。通过本发明方法包埋的上述蛋白质或者通过重组方法制备，或者是天然蛋白质或者其片段。

在一种实施方案中，本发明中使用的未包被的磁性纳米颗粒具有1-100nm的平均粒度。图14(a)和(b)中显示了纳米颗粒和包埋在交联蛋白质基质内的纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)分析。

在随后的实施方案中，在蛋白质基质中交联的磁性纳米颗粒具有1nm至30nm范围内的平均粒度。因此，图14(b)中的TEM图显示了包埋在交联蛋白基质中的未包被的磁性纳米颗粒的粒度优选在1至20nm的范围内。与微米级颗粒相比，它们也具有更大的单位重量的表面积。

在一种优选的实施方案中，本发明公开了一种方法，其中向指定量的磁性纳米颗粒中加入所需量的蛋白质，并在交联剂如环氧氯丙烷的存在下进行交联。反应在pH6.0-9.0的5-50mM磷酸盐缓冲液中进行。然后将混合物在4℃至30℃的温度，连续振荡下孵育18至24小时。还包括在4℃至30℃，无旋转的孵育另外24至48小时，以促进交联剂与蛋白质之间形成的键的稳定性。

固定后，分离珠子并用磁铁洗涤。图15显示了通过本方法获得的固定化蛋白质的分离。使用标准蛋白质测定方法测量固定的和游离的蛋白质浓度，并计算固定的百分比。在酶的情况下，通过进行标准测定来测量酶的活性。在谷胱甘肽的情况下，使用标准谷胱甘肽测定法进行估计。可以使用的其他优选的蛋白质测定方法包括Bradford测定法和修改的Lowry法。

在又一种实施方案中，用于本发明的环氧氯丙烷的浓度在约0.1M至约2M的范围内。更优选地，在本发明中使用约0.6M至约1.2M的浓度。此外，结合缓冲液选自磷酸盐、碳酸盐、硼酸盐及其组合，摩尔浓度范围为5mM至200mM。可以任选加入的盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁及其任意组合。

在另一种实施方案中，本发明提供了在约1:5至约1:0.25的比例范围内在蛋白质基质中交联的磁性纳米颗粒(MNP)。因此，交联基质中的MNP与蛋白质的比例为1:5、1:4、1:1、1:0.5和1:0.25。

在另一种优选的实施方案中，本发明公开了包埋在与环氧氯丙烷交联的蛋白质基质中的未包被的磁性纳米颗粒(MNP)，其中包埋在蛋白质基质中的所述纳米颗粒的比例范围为约1:5至1:0.25，并且具有1至100nm的粒径。

因此，与优选的蛋白质交联的磁性纳米颗粒选自但不限于蛋白A-MNP、蛋白G-MNP、蛋白L-MNP、过氧化物酶-MNP、谷胱甘肽-MNP、牛血清白蛋白(BSA)-MNP、卵清蛋白-MNP、淀粉酶-MNP、血红蛋白-MNP、脂肪酶-MNP、Fab-MNP、ScFv-MNP、IgG-MNP、凝集素-MNP、钙调蛋白-MNP、链霉亲和素-MNP、白蛋白-MNP、明胶-MNP、组蛋白-MNP等。

与优选的蛋白质交联的磁性纳米颗粒中所用的未包被的磁性纳米颗粒选自磁铁矿、钛尖晶石、赤铁矿、钛铁矿、磁赤铁矿、锰尖晶石、铁镍矿、镁铁矿、磁黄铁矿、硫复铁矿、硫铁矿、针铁矿、纤铁矿、六方纤铁矿、铁、镍、钴、铁镍矿、铁钴矿，或其任意组合。

在另一种实施方案中，本发明公开了通过本发明方法与磁性纳米颗粒交联的IgG结合免疫原性蛋白质。抗体分子在孵育期间结合蛋白A，并用酸性洗脱缓冲液洗脱。磁性颗粒作为支持体系，且通过将反应管放置在磁性支架上，磁性颗粒便于纯化抗体的轻易分离。如图7所示，在非还原条件下通过SDS-PAGE分析显示纯化的抗体的存在。

蛋白A-MNP用于从用导致IgG分子的产生和细胞外分泌的表达载体瞬时转染的哺乳动物细胞的培养基中纯化IgG分子。在非还原条件下通过SDS-PAGE分析显示纯化抗体的存在(图8)。通过本方法合成的蛋白A-MNP用于抗体的Fab(抗原结合片段)片段的纯化。将表达重组Fab分子的细菌细胞裂解并与蛋白A-MNP孵育以获得结合蛋白A-MNP的Fab分子(图9)。

在另一种实施方案中，本发明公开了牛血清白蛋白(BSA)在磁性纳米颗粒上的固定，其中在不存在环氧化物的情况下，以及环氧化物在低浓度下，BSA至磁性颗粒的固定非常弱。当使用0.24M环氧化物时，缔合百分比增加，并随着数量的增加而逐渐增加。使用所述交联剂在0.6M-1.2M范围内达到饱和水平(图1)。

在另一种实施方案中，本发明公开了将辣根过氧化物酶(HRP)固定在磁性纳米颗粒上，其中在三个不同的时间点(第1、40和60天)在固定后测量酶活性。使用两种不同稀释度的酶(0.5和1U)。A和B代表在两个不同的日子，但在相同的条件下进行的两个不同的实验。Y轴表示在450nm处测量的从TMB底物产生的黄色的强度。X轴表示以单位给出的酶的活性。很明显，即使在60天后，固定的酶的活性仍保持完整(图2)。

在另一种实施方案中，本发明公开了存在于溶液中的HRP酶(未固定)的酶活性测定(TMB测定)的结果。在三个不同的时间点(第1、40和60天)测量酶活性。该实验与固定化酶的测定平行进行。使用两种不同稀释度的酶(0.5和1U)。A和B代表在两个不同的日子，但在相同的条件下进行的两个不同的实验。Y轴表示在450nm处测量的从TMB底物产生的黄色的强度。X轴表示以单位给出的酶的活性。与固定化酶不同，游离酶的活性在4℃下储存数天后失去(图3)。

在又一种实施方案中，本发明公开了在上述固定条件下将全长IgG固定到磁性纳米颗粒。因此，在0.6M环氧化物的存在下，将增加量的IgG与BSA一起加入到1mg的纳米颗粒中。由于IgG偶联到HRP，因此基于酶活性测定固定的IgG的量。从图4可以清楚地看到固定化的逐渐增加，但即使添加300μg抗体也不饱和。

在一种优选的实施方案中，本发明公开了用于从生物流体固定、纯化和鉴定IgG、Fab片段或单链变体、功能蛋白的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)包埋在交联蛋白质基质中，在5mM磷酸钠缓冲液，pH8.0中具有对IgG/Fab片段的亲和力的25μgm-10mg磁性纳米颗粒；

(b)25ml洗涤缓冲液，即1X磷酸盐缓冲液，pH8；

(c)50ml IgG/Fab片段洗脱缓冲液，即包含磷酸盐缓冲液，pH2.8；或甘氨酸，pH2；或L-精氨酸，pH3的酸性缓冲液；

(d)2ml中和缓冲液，即1M Tris，pH9.0；

(e)包含与使用该试剂盒有关的说明书和参数的目录。

在磁性纳米颗粒存在下交联的蛋白质包括IgG结合蛋白如蛋白A、蛋白L、蛋白G，其他功能蛋白如酶，和抗氧化剂如谷胱甘肽、过氧化物酶；免疫球蛋白如IgG、IgE、IgA；Fab片段；scFv片段；结构蛋白，包括其组合和变化。

预先通过将在1ml 50mM磷酸盐缓冲液，pH 8中的约10mg的MNP与在相同缓冲液中的4-5mg蛋白A在化学交联剂，即环氧氯丙烷存在下的交联来制备蛋白A-MNP。交联在4℃进行48-72小时，任选旋转和任选补充盐。

诊断试剂盒用于检测生物样品中IgG的存在，所述的生物样品包括全血、血清、血浆和腹水、细胞培养基和细菌细胞裂解液。

在一种实施方案中，本发明的方法使用诊断试剂盒来鉴定和纯化IgG、Fab片段或单链变体，所述方法包括：

(i)用磷酸盐缓冲液稀释血浆，并用包埋在交联的蛋白质基质中的纳米颗粒处理它，所述的交联蛋白质基质用本发明的方法合成，并随后在室温下使样品旋转约2小时；

(ii)在步骤(i)中的旋转后，用磷酸盐缓冲液至少洗涤磁性颗粒两次，并用酸性缓冲液洗脱与蛋白A-磁性纳米颗粒结合的抗体；

(iii)用1M Tris缓冲液，pH9中和抗体，并通过凝胶电泳技术表征IgG，然后进行免疫印迹(Western blotting)。

诊断试剂盒更优选地储存在4℃并避光。然而，它可以储存在高达30℃的温度和光照下，而不会影响纳米颗粒中交联的蛋白质的磁性。根据上述实施方案，通过本方法制备的蛋白A-MNP用于从血浆中纯化IgG分子。准确地说，用850μl磷酸盐缓冲液稀释50μl血浆，并与100μl蛋白A-MNP混合。然后通过在室温下轻轻旋转彻底混合2小时。弃去上清液，重复用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀。结合的抗体用酸性缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH2.8；或甘氨酸，pH2；或L-精氨酸，pH3或任何其它针对IgG洗脱所述的缓冲液)洗脱。然后使用适宜的缓冲液(1MTris，pH9.0)中和纯抗体。通过在非还原条件下进行SDS-PAGE，随后对凝胶进行考马斯(Coomassie)染色，观察洗脱液中IgG的存在。描述SDS-PAGE的图7显示通过本发明方法制备的蛋白A-MNP能够从血浆中纯化IgG分子，并且所述蛋白A-MNP可以重新用于随后的纯化。

使用与使用诊断试剂盒几乎相似的方法来鉴定和纯化IgG和Fab片段，本发明人公开了从哺乳动物细胞培养系统以及细菌裂解物中纯化和鉴定所述片段。图8描绘了在SDS凝胶上的鉴定和纯化，其中使用包含通过本发明方法合成的蛋白A-MNP的试剂盒纯化使用转染的哺乳动物细胞系产生的单克隆抗体。

通过本方法获得结合蛋白A-MNP的Fab分子。图9描述了在非还原条件下在SDS-PAGE上存在分子量约48kDa的Fab分子。

作为图2和图3提供的数据的延伸，在固定化后直到第150天在不同天测量游离的和固定化的HRP的酶活性(图5A，B)。使用两种不同稀释度的酶(0.5和1U)。Y轴表示在450nm处测量的从TMB底物产生的黄色的强度。X轴表示测量天数。从图5(a)清楚可见，固定化酶的活性即使在150天后仍然保持完整，而没有游离酶的活性保留。将固定的和游离的酶都储存在4℃。而且，图5(b)显示了与游离酶相比，通过本发明方法固定的HRP酶增强的活性。另外，在不同的储存条件下，例如室温和4℃下，以及以未覆盖和覆盖表示的存在和不存在光，比较固定的和游离酶的酶活性，以测试温度敏感性。从固定之日起的第1周至第6周每周测量一次酶的活性(图6A-D)。Y轴表示在450nm处测量的从TMB底物产生的黄色的强度。X轴表示测量周。从结果显而易见的是，在任何给定的实验条件下，与游离酶相比，固定化酶的活性被有效保存。

在另一种实施方案中，本发明公开了本发明的蛋白质-磁性纳米颗粒对抗原蛋白质的选择性结合能力。

使用通过本方法合成的蛋白A-MNP进行免疫沉淀(IP)实验。使用一抗来选择性结合存在于细胞裂解物中的目标抗原。该抗体与靶抗原一起被蛋白A捕获。免疫沉淀表明蛋白A-MNP具有与蛋白A-Sepharose相同的抗体结合能力，蛋白A-Sepharose是用于免疫球蛋白纯化和分离的充分证明的介质，并且适用于免疫沉淀。图10表明形成了抗体-蛋白A-MNP偶联物的表达，其中观察到抗体对蛋白A的结合能力与对蛋白A-Sepharose的结合能力相似。

另外，使用本发明的新型蛋白A-MNP进行IP实验。这个实验是共免疫沉淀，其中研究了两种蛋白质之间的关联。使用卵巢的RIPA缓冲液裂解物。在IP阶段使用抗SCAP蛋白的一抗，并将抗固醇调节元件结合蛋白1-a(SREBP-1a)的抗体用于免疫印迹。使用抗SCAP蛋白(SREBP-裂解活化蛋白)的一抗选择性结合来自使用卵巢组织制备的RIPA裂解物的蛋白质复合物。使用蛋白A-MNP来结合抗体与蛋白质复合物。然后通过在1X SDS样品缓冲液中煮沸从蛋白A-MNP洗脱抗体-蛋白质复合物，并通过在SDS-PAGE上运行样品进行分离。然后通过免疫印迹将存在于凝胶上的蛋白质转移到硝化纤维素/PVDF膜上。使用抗SREBP-1α的另一种一抗证实了相互作用蛋白质的存在。蛋白A-MNP具有与蛋白A-琼脂糖相同的性能(图11)。

相应地，在一种更优选的实施方案中，本发明公开了一种免疫沉淀试剂盒，其包括：

(a)包埋在交联蛋白质基质中，在5mM磷酸钠缓冲液，pH8.0中具有对IgG/Fab片段的亲和力的25μgm-10mg磁性纳米颗粒；

(b)对待检测抗原具有特异性的一抗；

(c)1ml 1X十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲液；

(d)微型离心管；

(e)包含试剂盒使用说明的目录。

此外，使用免疫沉淀试剂盒的方法包括：(i)根据待检测实验的要求，用蛋白质特异性的一抗处理细胞裂解物，然后加入包埋在蛋白质中的磁性纳米颗粒以形成Ag-第一抗体-蛋白质-MNP复合物；和(ii)将步骤(i)的Ag-第一抗体-蛋白质-MNP复合物加热至100℃，随后在还原条件下在SDS-PAGE上运行混合物以鉴定Ag。

在上述诊断试剂盒和免疫沉淀试剂盒中，包埋在交联蛋白质基质中的磁性纳米颗粒选自广泛的蛋白质，例如选自酶、抗体分子、抗原蛋白质、肽片段的功能蛋白和其他结构蛋白，包括其组合和变体。包埋的磁性纳米颗粒选自磁铁矿、钛尖晶石、赤铁矿、钛铁矿、磁赤铁矿、锰尖晶石、铁镍矿、镁铁矿、磁黄铁矿、硫复铁矿、硫铁矿、针铁矿、纤铁矿、六方纤铁矿、铁、镍、钴、铁镍矿、铁钴矿，或其任意组合。

在另一种实施方案中，通过本发明的方法将磁性纳米颗粒包埋在谷胱甘肽(GSH)中，用于检测和纯化GST标记的融合蛋白。在交联剂存在下孵育磁性颗粒和肽。由于谷胱甘肽是GST的底物，因此通过纯化GST(谷胱甘肽S转移酶)来测试谷胱甘肽-MNP。溶液中的GST可以与固定化的GSH结合，其随后可以用含有过量GSH的缓冲液洗脱。SDS-PAGE分析显示洗脱物中GST酶的存在(图12)。类似地，谷胱甘肽-MNP用于纯化GST-标记的融合蛋白(图13)。

在一种优选的实施方案中，本发明提供了包埋在蛋白质的交联基质中的磁性纳米颗粒用于生物应用的用途，所述的生物应用选自抗体或抗体片段、抗原蛋白质、功能和结构蛋白的纯化；酶固定化，用于从生物来源分离不同细胞类型的抗体固定；基于抗体的细胞分选；免疫沉淀实验如蛋白质免疫沉淀、染色质免疫沉淀、RNA免疫沉淀或类似的测定和技术。通过本发明方法包埋在蛋白质中的磁性纳米颗粒可用于几种生物学应用，其中需要磁性纳米颗粒与蛋白质的偶联。

有利的是，本发明的方法耗时较少且经济。这是一种直接包埋机制，其不包括任何种类的聚合物材料作为磁性颗粒表面上的涂层。相反，蛋白质与颗粒直接结合，因此颗粒的磁性不会减弱。使用这种方法，蛋白质的功能活性即使在固定之后也不会丢失。

提供了说明本发明实施方案的一些典型例子；然而，这些仅仅是示例性的，不应被认为是限制本发明的要素。

实施例

实施例1：牛血清白蛋白(BSA)在磁性纳米颗粒上的固定

向在5mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中的10mg的Fe₃O₄氧化铁磁性纳米颗粒中加入2.5mgBSA，并在浓度为1M的环氧氯丙烷存在下进行交联。然后将混合物在室温下连续摇动孵育20小时。孵育后，分离珠子并用磁铁洗涤。使用Bradford's试剂测定固定的和游离的蛋白质浓度，并计算结合百分比(图1)。

实施例2：辣根过氧化物酶(HRP)酶在磁性纳米颗粒上的固定

向在5mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中的1mg的赤铁矿Fe₂O₃磁性纳米颗粒中加入约1U和0.5U的HRP酶(与200μg的BSA混合在一起)，并在0.6M的环氧氯丙烷存在下进行交联。然后将混合物在4℃下连续摇动孵育20小时。孵育后，分离珠子并用磁铁洗涤。测量固定的和游离的蛋白质浓度并计算结合的百分比。Bradford方法的蛋白质估算测定显示酶与纳米颗粒(固定化)几乎90％的缔合。还测量了固定化和游离部分中的酶活性。当使用少量酶结合时，BSA用作稀释剂和稳定剂。如后续测定所示，固定在磁性颗粒上的酶的活性即使在4℃下长期储存后也保留下来(图2和3)。

实施例3：抗体(全长IgG)在磁性纳米颗粒上的固定

向在5mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中的1mg的镍(Ni)磁性纳米颗粒中加入10-300μg抗体以及250μg BSA，并在浓度为0.6M的环氧氯丙烷存在下进行交联。然后将混合物在4℃下连续摇动孵育20小时。孵育后，分离珠子并用磁铁洗涤。测量固定的和游离的蛋白质浓度并计算结合的百分比。当使用少量抗体时，BSA可以用作稀释剂和稳定剂(图4)。

实施例4：HRP酶的固定和在不同实验条件下保持活性的证明

向在5mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中的1mg的钴(Co)磁性纳米颗粒中加入约1U和0.5U的HRP酶(与200μg的BSA混合在一起)，并在浓度为0.6M的环氧氯丙烷存在下进行交联。然后将混合物在4℃下连续摇动孵育20小时。孵育后，分离珠子并用磁铁洗涤。在不同的时间点测定直到固定化后的第150天的固定的和游离的蛋白质浓度。通过进行TMB测定来测量酶的活性，并且在450nm处测量显现的黄色(图5A-B)。为了比较固定化和游离酶的光敏性和温度敏感性，进行了以下实验。将固定的和游离酶的等分试样在室温和4℃下储存，覆盖或未覆盖箔。在所有这些条件下储存相同浓度的固定化和游离酶用于TMB测定。在450nm处测量显现的黄色(图6A-D)。X轴表示测量周，Y轴表示450nm的OD单位。不论管保持覆盖还是未覆盖，在4℃(A)和在室温(B)下储存的游离酶的活性在6周后完全丧失或显着减少。但固定化酶不管覆盖还是未覆盖，在室温下保持50-60％的活性(C)，在4℃下保持80％以上的活性(D)。

实施例5：在磁性纳米颗粒上固定蛋白A和使用蛋白A-MNP从血浆中纯化抗体(IgG)

蛋白A-MNP(Fe₃O₄氧化铁)是通过将在1ml磷酸盐缓冲液(50mM，pH>

实施例6：蛋白A在磁性纳米颗粒上的固定和使用蛋白A-MNP从细胞培养基(上清液)中纯化IgG

如实施例5所述制备蛋白A-MNP。加入1ml蛋白A-MNP，并与125ml细胞培养基混合过夜，由用表达IgG的表达载体瞬时转染的哺乳动物细胞分泌IgG至所述的细胞培养基中。孵育后，除去用过的培养基，用1×PBS洗涤MNP多次，最后用酸性缓冲液，优选L-精氨酸，pH3.0洗脱IgG。然后使用适宜的缓冲液，优选1M Tris缓冲液，pH9.0中和纯抗体。通过在非还原条件下进行SDS-PAGE，然后考马斯染色凝胶，观察洗脱液中IgG的存在(图8)。

实施例7：蛋白A在磁性纳米颗粒上的固定和使用蛋白A-MNP从细菌培养基中纯化IgG的Fab片段

如实施例5所述制备蛋白A-MNP。加入1ml蛋白A-MNP，并与100ml含有重组Fab分子的细菌细胞裂解物混合过夜。孵育后，除去用过的裂解物，用1X PBS洗涤MNP多次，最后用酸性缓冲液，优选但不限于磷酸盐缓冲液，pH2.8洗脱Fab。然后使用适宜的缓冲液中和纯的Fab。通过在非还原条件下进行SDS-PAGE，然后考马斯染色凝胶，观察洗脱液中Fab的存在(图9)。

实施例8：蛋白A在磁性纳米颗粒上的固定和使用蛋白A-MNP进行免疫沉淀

在免疫沉淀(IP)中，使用一抗来选择性结合存在于细胞裂解物中的目标抗原。该一抗将被蛋白A与靶抗原捕获。进行实验(图10)以证明蛋白A-MNP具有与主要竞争产物蛋白A-琼脂糖相同的抗体结合能力。通过在1X SDS样品缓冲液中煮沸来洗脱与MNP结合的抗体，并且在还原条件下在SDS-PAGE上分离样品，然后进行银染。另外，使用本发明的方法产生的新型蛋白A-Fe₂TiO₄进行IP实验。这个实验是免疫共沉淀，其中研究了两种蛋白之间的关联。使用抗SCAP蛋白(SREBP裂解活化蛋白)的一抗选择性结合来自使用卵巢组织制备的RIPA裂解物的蛋白质复合物。使用50μl的蛋白A-MNP与捕获蛋白质复合物与抗体。然后通过在1XSDS样品缓冲液中煮沸从蛋白A-MNP洗脱抗体-蛋白质复合物，并通过在还原条件下在SDS-PAGE上运行样品来分离。然后通过免疫印迹将存在于凝胶上的蛋白质转移到硝化纤维素/PVDF膜上。用另一种抗SREBP-1a的一抗证实相互作用蛋白的存在，并证明两种蛋白质之间存在关联。蛋白A-MNP具有与蛋白A-琼脂糖相同的性能(图11)。

实施例9：谷胱甘肽在磁性纳米颗粒上的固定和使用谷胱甘肽-MNP纯化GST标记融合蛋白

如前所述，使用包埋法进行肽-谷胱甘肽(GSH)的固定。磁性颗粒即Fe₃O₄和肽在优选为环氧化物，如环氧氯丙烷的交联剂的存在下孵育。通过纯化GST(谷胱甘肽S转移酶)酶来测试谷胱甘肽-MNP的性能。由于谷胱甘肽是其底物，所以GST酶可以与固定化的GSH结合，其随后可以用含有过量GSH的缓冲液洗脱。SDS-PAGE分析显示洗脱物中GST酶的存在(图12)。类似地，通过孵育在含有过表达的重组GST-标记的蛋白质的50ml的细菌细胞裂解物中的约500μl的MNP，将谷胱甘肽-MNP用于纯化GST-标记的融合蛋白。使用含有过量谷胱甘肽的缓冲液进行纯化蛋白的洗脱(图13)。

实施例10：用于固定、纯化和鉴定的诊断试剂盒

本发明人设计了用于从生物流体中固定、纯化和鉴定IgG、Fab片段或单链变体的诊断试剂盒。该试剂盒包括：(a)在5mM磷酸钠缓冲液，pH8.0中具有对IgG/Fab片段亲和力的25μgm至10mg的与蛋白A交联的Fe₃O₄；(b)25ml洗涤缓冲液，即1X磷酸盐缓冲液，pH-8；(c)50ml的IgG/Fab片段洗脱缓冲液，即包含磷酸盐缓冲液，pH>

本发明的工业优势：

1.不存在磁性纳米颗粒的聚合物涂层，使得蛋白质与纳米颗粒直接接触，因此蛋白质的磁性没有降低。

2.通过将所述纳米颗粒包埋在目标蛋白质中，目前合成的包埋在蛋白质中的磁性纳米颗粒可以用于大范围的诊断程序。

3.使用本发明的方法，诸如酶的固定、免疫沉淀和免疫原性蛋白质的鉴定和纯化的方法可方便且容易地进行。固定化酶可以用来通过提供固定化酶来克服先天性代谢紊乱。包埋技术可以有效地用于药物递送系统，特别是至致癌部位。

4.发现固定在磁性纳米颗粒上的酶能够承受恶劣的实验条件，包括温度变化、暴露在光下以及存在有机溶剂等等。

5.此外，包埋在蛋白质中的MNP可以重新使用，从而节省了资金成本和工艺投资，从而支持了绿色化学的概念。