一种小血藤功能性有效成分的检测方法及应用

摘要

本发明属于中药成分检测技术领域，公开了一种小血藤功能性有效成分的检测方法及应用，包括分别制备芦丁、五味子甲素和五味子乙素的标准品溶液，制备供试品溶液，HPLC检测等步骤，其中HPLC检测色谱条件如下：以甲醇‑1％冰醋酸溶液为流动相洗脱液，梯度洗脱90min，洗脱各时段对应的洗脱液中甲醇体积分数分别为：0‑20min时为20％；20‑40min时为40％；40‑60min时为60％；60‑80min时为80％，80‑90min时为100％；流速为1mL/min，检测波长为257nm。本发明使用梯度洗脱的HPLC检测，可同时测定小血藤中三种功能性有效成分，能够较为全面反映出小血藤的药效。

说明书

技术领域

本发明属于中药成分检测技术领域，具体涉及一种小血藤功能性有效成分的检测方法及应用。

背景技术

小血藤(Schisandra Propinqua(Wall.)Baill.Var.Sinensis Oliv.，Dchisandrapropingua var.sinensis)又名铁箍散，为木兰科五味子属落叶性木质藤本植物。其以根、藤茎及叶入药。文献报道小血藤主要含有表恩施辛，恩施辛(enshicine)，异五味子酸(isoschizandrolic acid)，去氧五味子素(deoxyschizandrin)，β-谷甾醇(β-sitosterol)，硬脂酸(stearic acid)等化学成份。我们通过薄层色谱法发现其含有较多的芦丁、五味子甲素和五味子乙素。芦丁、五味子甲素和五味子乙素为功效确切的药效成分，它们是现今中国药典中较多中药的质量控制指标，如芦丁为中国药典一部收载的槐花等中药的质量控制指标成分，五味子甲素和五味子乙素为临床常用药物护肝片等中药的质量控制指标成分。芦丁、五味子甲素和五味子乙素具有抗氧化、保肝降酶等多种药理活性。

中国传统医学认为，小血藤味辛性温，具有祛风活血、解毒消肿、止血的功效，这些功效与芦丁、五味子甲素和五味子乙素具有的药理作用类似。然而中国药典没有收载小血藤的质量控制方法及功能性有效成分检测指标，不能有效控制小血藤药材的质量，进而使含小血藤药材的中成药质控方法存在缺陷。为控制小血藤的质量，以更好的保证临床用药的安全，有必要建立一种能够同时测定小血藤中多种具有药效的有效成分的方法，实现小血藤及含小血藤中成药的质量管控。

发明内容

本发明提供的一种小血藤功能性有效成分的检测方法及应用，能够同时测定小血藤中多种具有药效的有效成分芦丁、五味子甲素和五味子乙素含量，实现小血藤及含小血藤中成药的质量管控。

本发明的目的是提供一种小血藤功能性有效成分的检测方法，包括以下步骤：

S1，分别制备芦丁、五味子甲素和五味子乙素的标准品溶液：

S2，制备供试品溶液

称取小血藤10-10.5g，加入甲醇45-55mL，超声30-40min，冷却，过滤，收集滤液并浓缩，得到浓缩液；将浓缩液转移于容量瓶中，加甲醇定容至，摇匀，过滤，收集的滤液再用微孔滤膜过滤，收集微孔滤膜过滤后的即为供试品溶液；

S3，HPLC检测

色谱条件：以甲醇-1％冰醋酸溶液为流动相，梯度洗脱90min，洗脱各时段对应的洗脱液中甲醇体积分数分别为：0-20min时为20％；20-40min时为40％；40-60min时为60％；60-80min时为80％，80-90min时为100％；流速为1mL/min，检测波长为257nm；

其中，1％冰醋酸溶液中冰醋酸的体积分数为1％，溶剂为双蒸水。

优选的，上述小血藤功能性有效成分的检测方法，S1中，芦丁标准品溶液制备方法如下：精确称取芦丁标准品0.0091g于10mL容量瓶中，加入甲醇定容至10mL，即得0.91mg/mL的芦丁标准品溶液；

五味子甲素标准品溶液制备方法如下：精确称取五味子甲素标准品0.0043g于10mL容量瓶中，加入甲醇定容至10mL，即得0.43mg/mL的五味子甲素标准品溶液；

五味子乙素标准品溶液制备方法如下：精确称取五味子乙素标准品0.0010g于10mL容量瓶中，加入甲醇定容至10mL，即得0.10mg/mL的五味子乙素标准品溶液。

优选的，上述小血藤功能性有效成分的检测方法，S2的具体步骤为：

称取小血藤10-10.5g，置于150mL具塞锥形瓶中，加入甲醇约50mL，超声30min，超声功率为180W，超声频率为40kHz，自然冷却，快速定性滤纸过滤，收集滤液并浓缩，得到浓缩液；将浓缩液转移于50mL的容量瓶中，加甲醇定容至50mL，摇匀，快速定性滤纸过滤，收集的滤液再用微孔滤膜过滤，微孔滤膜的微孔直径为φ0.45μm，收集微孔滤膜过滤后的滤液即为供试品溶液。

优选的，上述小血藤功能性有效成分的检测方法，S3的具体步骤为：

色谱条件：色谱柱为Symmetryshield Rp18 4.6mm×250mm色谱柱；以甲醇-1％冰醋酸溶液为流动相，梯度洗脱90min，洗脱各时段对应的洗脱液中甲醇体积分数分别为：0-20min时为20％；20-40min时为40％；40-60min时为60％；60-80min时为80％，80-90min时为100％；使用前流动相采用超声处理脱气，并用微孔直径为φ0.45μm的微孔滤膜过滤；流速为1mL/min，检测波长为257nm；

其中，1％冰醋酸溶液中冰醋酸的体积分数为1％，溶剂为双蒸水。

本发明还提供了上述小血藤功能性有效成分的检测方法在检测小血藤或者含小血藤中成药中芦丁、五味子甲素和五味子乙素含量的应用。

与现有技术相比，本发明提供一种小血藤功能性有效成分的检测方法及应用，具有以下有益效果：

(1)现有技术多为针对小血藤中的芦丁用UV进行测定，UV测定法干扰较多，不能有效定量，特别是不能在混合组分中定量，虽有使用HPLC定量芦丁的方法，但使用的同梯度洗脱，且单一组分不能全面反映中药质量。本发明使用梯度洗脱的HPLC检测，可同时测定小血藤中三种功能性有效成分，可较为全面的洗脱出药物浸膏中的成分，能够较为全面反映出小血藤的药效。

(2)我们建立了同时测定与小血藤药效相关的有效成分芦丁、五味子甲素、五味子乙素含量的HPLC法。线性关系良好，芦丁线性范围为1.82μg～14.56μg，五味子甲素线性范围为0.86μg～6.88μg，五味子乙素线性范围为0.20μg～1.60μg；精密度良好，5次芦丁检测结果的RSD为1.57％，五味子甲素的RSD为1.08％，五味子乙素的RSD为1.36％；重复性良好，5次平行试验得出小血藤中芦丁含量的RSD为0.12％；五味子甲素含量的RSD为0.67％；五味子乙素含量的RSD为0.42％；稳定性良好，12h内芦丁的峰面积RSD为0.75％，五味子甲素12h内峰面积的RSD为1.24％，五味子乙素峰面积的RSD为0.91％，表明供试品溶液在12h内基本稳定；回收率高，芦丁、五味子甲素、五味子乙素的回收率分别为97.34％、97.12％、95.48％。

(3)我们更换HPLC的检测条件后发现，不同的洗脱梯度、洗脱时间均对样品检测具有较大影响，说明本发明的HPLC检测条件具有显著的效果。

附图说明

图1是芦丁、五味子甲素、五味子乙素混合标准品的测试结果图；

图2是产品批号为120901的小血藤中芦丁、五味子甲素、五味子乙素的检测液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供的一种小血藤功能性有效成分的检测方法，包括以下步骤：

S1，分别制备芦丁、五味子甲素和五味子乙素的标准品溶液：

S2，制备供试品溶液

称取小血藤10-10.5g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇45-55mL，超声30-40min，冷却，过滤，收集滤液并浓缩，得到浓缩液；将浓缩液转移于容量瓶中，加甲醇定容至，摇匀，过滤，收集的滤液再用微孔滤膜过滤，收集微孔滤膜过滤后的滤液即为供试品溶液；

S3，HPLC检测

色谱条件：以甲醇-1％冰醋酸溶液(甲醇和1％冰醋酸溶液的混合溶液)为流动相洗脱液，梯度洗脱90min，洗脱各时段对应的洗脱液中甲醇体积分数分别为：0-20min时为20％；20-40min时为40％；40-60min时为60％；60-80min时为80％，80-90min时为100％；流速为1mL/min，检测波长为257nm；

其中，1％冰醋酸溶液中冰醋酸的体积分数为1％，溶剂为双蒸水。

本发明小血藤功能性有效成分的检测方法包括以下实施例。

实施例1

一种小血藤功能性有效成分的检测方法，包括以下步骤：

S1，分别制备芦丁、五味子甲素和五味子乙素的标准品溶液：

(1)芦丁标准品溶液制备：精确称取芦丁标准品0.0091g于10mL容量瓶中，加入甲醇定容至10mL，即得0.91mg/mL的芦丁标准品溶液。

(2)五味子甲素标准品溶液制备：精确称取五味子甲素标准品0.0043g于10mL容量瓶中，加入甲醇定容至10mL，即得0.43mg/mL的五味子甲素标准品溶液。

(3)五味子乙素标准品溶液制备：精确称取五味子乙素标准品0.0010g于10mL容量瓶中，加入甲醇定容至10mL，即得0.10mg/mL的五味子乙素标准品溶液。

S2，制备供试品溶液

精确称取小血藤10.1756g，置于150mL具塞锥形瓶中，加入甲醇50mL，超声30min，超声功率为180W，超声频率为40kHz，自然冷却，快速定性滤纸过滤，收集滤液并旋转蒸发浓缩至体积为20mL左右，得到浓缩液；将浓缩液转移于50mL的容量瓶中，加甲醇定容至50mL，摇匀，滤纸过滤，收集的滤液再用微孔滤膜过滤，微孔滤膜的微孔直径为φ0.45μm，收集微孔滤膜过滤后的滤液即为浓度为0.2035g/mL的供试品溶液，即该溶液中供试品小血藤的浓度为0.2035g/mL。

S3，HPLC检测

色谱条件：色谱柱为Symmetryshield(Rp18 4.6mm×250mm)色谱柱。以甲醇-1％冰醋酸溶液(甲醇与1％冰醋酸溶液的混合液)为流动相洗脱液，梯度洗脱90min，洗脱各时段对应的洗脱液中甲醇体积分数分别为：0-20min时为20％；20-40min时为40％；40-60min时为60％；60-80min时为80％，80-90min时为100％；使用前流动相采用超声处理脱气，并用微孔直径为φ0.45μm的微孔滤膜过滤；流速为1mL/min，检测波长为257nm。

其中，1％冰醋酸溶液中冰醋酸的体积分数为1％，溶剂为双蒸水。

实施例2

一种小血藤功能性有效成分的检测方法，步骤与实施例1基本相同，区别在于，S2中称取小血藤的质量为10.1235g，加入的甲醇为45ml，超声时间为40min。

实施例3

一种小血藤功能性有效成分的检测方法，步骤与实施例1基本相同，区别在于，S2中称取小血藤的质量为10.4751g，加入的甲醇为55ml，超声时间为35min。

为了验证上述方法的可行性和效果，我们进行了如下实验：

一、检测波长的选择

取实施例1的S1中获得的三种标准品溶液，以流动相为空白在210-550nm范围内绘制吸收光谱图，其中流动相采用的是甲醇-1％冰醋酸溶液，且甲醇与1％(v/v)冰醋酸溶液的体积比例为4:1。结果表明当采用257nm为检测波长时，芦丁、五味子甲素、五味子乙素的检测灵敏度高，杂质峰较少，基线平稳，杂质均不干扰测定。综上因素，选择257nm为其检测波长。

二、线性关系考察

分别精确吸取实施例1的S1中芦丁、五味子甲素、五味子乙素标准品溶液1mL、2mL、3mL、5mL、8mL，分别置于10mL量瓶中，并加甲醇稀释至刻度定容，摇匀，得到不同浓度的待检测溶液。实施例1中S3的HPLC检测的色谱条件下进样检测，测定峰面积，然后以峰面积积分值为纵坐标，分别以芦丁标准品溶液、五味子甲素标准品溶液和五味子乙素标准品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程分别为：芦丁，Y＝169692X-70183，R²＝0.9998，线性范围为1.82μg～14.56μg。五味子甲素，Y＝33822X+6747，R²＝0.9994，线性范围为0.86μg～6.88μg。五味子乙素，Y＝74429X-532.96，R²＝0.9997，线性范围为0.20μg～1.60μg。

另外，在实施例1中S3的HPLC检测的色谱条件下，分别精确吸取芦丁、五味子甲素、五味子乙素标准品溶液1mL，于10mL量瓶中，并加甲醇稀释至刻度定容，摇匀，得到混合标准品溶液，分别精确量取混合标准品溶液20μL进样，测定峰面积。图1是芦丁、五味子甲素、五味子乙素混合标准品的测试结果图。结果显示，上述HPLC检测的色谱条件下混合标准品溶液也具有良好的识别效果。

三、精密度试验

精确吸取芦丁标准品溶液(1.82mg/mL)20μL，在实施例1中S3的HPLC检测的色谱条件下，重复进样5次，计算峰面积及5次峰面积的RSD(相对标准偏差)，结果得出芦丁标准品溶液的峰面积的RSD为1.57％；精确吸取五味子甲素标准品溶液(0.43mg/mL)20μL，重复进样5次，计算峰面积及5次峰面积的RSD，结果得出五味子甲素标准品溶液的峰面积的RSD为1.08％；精密吸取五味子乙素标准品溶液(0.10mg/mL)20μL，重复进样5次，计算峰面积及5次峰面积的RSD，结果得出五味子乙素标准品溶液的峰面积的RSD为1.36％，表明实施例1的HPLC检测方法精密度良好。

四、重复性试验

取同一批次溶液，平行精确称取5份，分别在实施例1中S3的HPLC检测的色谱条件下测定，计算峰面积及5次峰面积的RSD，结果得出小血藤中芦丁含量的RSD为0.12％；五味子甲素含量的RSD为0.67％；五味子乙素含量的RSD为0.42％，表明实施例1的HPLC检测方法重复性良好。

五、稳定性试验

取小血藤供试品溶液，室温放置，每隔1h时间测定一次，测定条件同实施例1中S3的HPLC检测的色谱条件，结果12h内芦丁的峰面积RSD为0.75％，五味子甲素12h内峰面积的RSD为1.24％，五味子乙素峰面积的RSD为0.91％，表明供试品溶液在12h内基本稳定，小血藤供试样品溶液中芦丁、五味子甲素和五味子乙素在供试品溶液内稳定性良好，适合于长时间保存，也表明实施例1的方法检测稳定性良好。

六、回收率试验

采用加样回收法。分别精确称取已知含量的小血藤5份，分别加入芦丁标准品、五味子甲素标准品、五味子乙素标准品适量，按照实施例1的S2中方法制成供试品溶液，按照实施例1中S3的方法测定芦丁、五味子甲素、五味子乙素含量，计算回收率，芦丁的添加量和回收率检测结果如表1所示，五味子甲素的添加量和回收率检测结果如表2所示，五味子乙素的添加量和回收率检测结果如表3所示，表1-3的结果表明，实施例1的HPLC检测方法具有良好的回收率。

表1芦丁添加量和回收率检测结果

表2五味子甲素添加量和回收率检测结果

表3五味子乙素添加量和回收率检测结果

七、样品测定

按照实施例1中S2的方法制备不同来源的小血藤供试品溶液十批，分别精确吸取各批次供试品溶液各20μL进样，按照实施例1中S2的方法测定。结果见表4。由于十批样品的HPLC图谱相近，故图2仅显示产品批号为120901的小血藤中芦丁、五味子甲素、五味子乙素的检测液相色谱图。

表4十批小血藤样品的检测结果

由表4中十批样品的测定结果可知，小血藤中芦丁的含量范围为：2.24-2.45mg/g；五味子甲素含量范围为：0.60-0.83mg/g；五味子乙素含量范围为：0.16-0.22mg/g。考虑到中药材生长环境的差异较大，故暂定小血藤中功能性有效组分芦丁的含量不低于1.78mg/g；五味子甲素的含量不低于0.48mg/g；五味子乙素的含量不低于0.12mg/g。

上述实验表明，本发明的小血藤功能性有效成分的检测方法采用梯度洗脱，能够同时检测出小血藤中含有的功能性有效组分芦丁、五味子甲素和五味子乙素，且平均回收率在95％以上，准确度高，稳定性良好，这三种组分能够全面反映出小血藤的药效，是实现小血藤质量控制和含小血藤中成药的质量管控的有效方法之一，可作为小血藤质量控制和含小血藤中成药的质量管控的标准。

我们对实施例1中HPLC检测条件中洗脱梯度进行改变，洗脱各时段对应的洗脱液中甲醇体积分数分别为：0-20min时为10％；20-40min时为35％；40-60min时为55％；60-80min时为75％，80-90min时为100％；然后对表4中的小血藤样品进行检测，计算出的芦丁、五味子甲素和五味子乙素含量均较表4中的数据低10-15％，说明不同的洗脱梯度对样品检测具有较大影响。

需要说明的是，可以用本方法的色谱条件，使用HPLC-MS分析方法，增加药物成分含量测定来替代本方案。

需要说明的是，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。