用于核酸检测的痰液收集管及痰液保存方法

摘要

本发明提供了一种用于核酸检测的痰液收集管及痰液保存方法，痰液收集管内置核酸酶抑制剂，pH值维持剂和脱水剂。本发明针对痰液样本中核酸易降解的问题，设计一种含有核酸保护剂的收集管，方便需要做痰液核酸检测的受检者在有痰时利用随身携带的收集管随时收集痰液，同时能够在室温条件下保护痰液样本中的核酸不被降解，给予受检者充足的时间(72小时)将样本送至(或快递)医院或其他检验机构进行核酸检测。

说明书

技术领域

本方法属于用于医学检测的样本保存技术领域，涉及一种用于核酸检测的痰液保存方法及收集管，技术关键在于保护痰液样本中的核酸不被降解。

背景技术

痰是人体呼吸道的分泌物，它是通过支气管纤毛运动上皮纤毛的运动，从肺部向上呼吸道推动，最后，通过人的正常咳嗽反射从气管内咳出排出体外，正常人痰很少，只是保持呼吸道湿润而分泌的少量粘液。当人吸入刺激性气体、尘埃、致病细菌、病毒等有害微生物时，上呼吸道就可能发生炎症；或者肺部发生疾病，如支气管扩张、肺脓肿、肺癌等，呼吸道就会分泌增加，痰量就会增加，而痰的性质也会发生变化，可以由粘痰变成干酪痰、血痰、黄脓痰等。根据痰液产生和排出机制可知，痰液中包含多种病原微生物、各类炎症细胞、脱落坏死的黏膜上皮细胞以及肿瘤细胞等。

目前在临床上，痰液样本主要用于痰液细胞学检测以及呼吸道病原体检测。其中，通过检测痰液样本中病原体的核酸来鉴定病原体的种类是目前最精准且最快速的呼吸道病原体诊断方法。可引起急性呼吸道感染的病原体中，病毒占主要地位，其次才是细菌、支原体、霉菌、原虫等。在原发的急性上呼吸道感染中，病毒感染高达90％以上。常见的呼吸道病原体有：结核分枝杆菌、呼吸道合胞病毒、腺病毒、EB病毒、流感病毒、肺炎支原体、风疹病毒、链球菌、葡萄球菌、肺炎衣原体、细小病毒B19、巨细胞病毒以及冠状病毒等。传统的病原体诊断方法是分离培养或者血清学检测，分离培养耗时长、操作复杂，不适用于临床急症的诊断；血清学检测很难在疾病做到早期诊断。随着荧光定量PCR以及多重PCR技术在病原体检测领域的快速发展，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、检测迅速、检出率高等特点，该技术已逐渐在临床诊断领域占据重要地位。此外，从肺癌高危人群及肺癌患者的痰液样本中提取核酸，可用于早期肺癌的预测以及肺癌患者的基因突变检测和治疗监测。综上，痰液样本中核酸检测在临床上具有重要意义。然而在实际操作中，痰液样本中的核酸(尤其是RNA)极不稳定，通常在温室条件下数小时就被降解。造成核酸降解的外界物理因素如温度、湿度、紫外线等；化学因素如强酸或强碱环境、水解反应等；生物因素如酶解及微生物侵染等。其中，痰液中细胞破裂释放的核酸酶以及操作过程中因污染引入的核酸酶是造成核酸降解的主要原因。此外，一般受检者，即使是处于发病期的患者，也不是随时能咳出足够量的痰液，多半患者在晨起后痰液量较多，却无法及时收集并保存痰液。

中国专利申请文件CN104263721A，公开了一种保护痰液中核酸(DNA和RNA)的痰纸及核酸提取方法，主要存在以下不足：(1)其专利所述的痰纸为方形或圆形纸片、信封式或盒式，此种痰纸易折损，不耐受外力挤压，痰液易外溢(尤其当痰液较多时)，采集痰液后不便于随身携带和运输；(2)其专利所述，在痰纸上浸润了主要成分为DTT(二硫苏糖醇)、EDTA(乙二胺四乙酸及其二钠盐)、Tris-HCl(三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液)的核酸保护液，浸润的保护液含量较少，不能保证痰液样本与核酸保护液充分接触，对痰液中核酸的保护效果一般。

此外，目前已公开的用于保护核酸或细胞的相关专利，例如中国专利申请文件CN105145545A公开的《用于常温条件下长期保存和运输组织样本的核酸保护液》、中国专利申请文件106065400A公开的《一种核糖核酸保护剂、试剂盒、应用及保存方法》以及中国专利申请文件CN 104041484 A公开的《一种细胞保存液》等，这些专利涉及的技术均可用于保护组织或细胞的核酸。然而，这些专利涉及的技术对于痰液样本的实用性较差，主要原因有：(1)痰液样本具有粘度大、蛋白多、不易液化、易成团等特点，将痰液加入常规液体保护剂后，痰液易与保护剂分层，保护剂与痰液样本接触面有限；(2)有些专利涉及的保护剂成分比较复杂，如含有防腐剂、缓冲剂、螯合剂、酶抑制剂、固定剂等，保护剂成分多且成本高，不适合临床广泛使用。

发明内容

为了解决目前临床上痰液样本中核酸极易被降解且不能随时收集痰液的问题，本发明提供了一种方便携带可随时收集痰液，并且能够保护痰液样本中的核酸不被降解的方法。

本发明的技术方案是：

一种可以保护核酸的痰液保存方法且方便携带可随时收集的痰液收集管。主要包括收集管和保护剂，收集管能够容纳痰液样本和保护剂，其可封闭且可随身携带；痰液收集管内预先放置保护剂，保护剂包括核酸酶抑制剂、pH值维持剂和脱水剂，起到保护样本中核酸的完整性的作用。

(1)所用收集管为50ml旋转盖尖底离心管、50ml旋转盖圆底离心管50ml旋转盖平底离心管(可立式)，不限于以上3种，其他能够容纳保护剂和痰液的可密闭且便于携带的容器均可。

(2)核酸酶抑制剂为盐酸胍、异硫氰酸胍、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1,5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠中的一种或几种组合。核酸酶抑制剂的质量为0.5-4.0g。

(3)pH值维持剂为三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS)、双(2-(羟甲基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis Tris)、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)中的一种或几种组合。pH值维持剂的质量为1.5-4.0mg。

(3)脱水剂为聚乙二醇(PEG)、正丁醇、仲丁醇，叔丁醇的一种或几种组合。脱水剂的质量为0.5-2.5g或体积为1.0-3.0ml。

优选的，所述核酸酶抑制剂及收集管为：1.0g盐酸胍、2.5mg Tris以及1.0g聚乙二醇置于50ml旋转盖尖底离心管中。

本发明还提供一种用于核酸检测的痰液保存方法，包括以下步骤

(1)收集的痰液样本，痰液样本的体积为1-5ml；其中痰液样本没有限制，收集的痰液样本可为粘痰、血痰、脓痰、稠厚痰、黄色/灰色/铁锈色痰等各种性状的痰液。

(2)将痰液样本直接置于如权利要求1-9任意一项所述的用于核酸检测的痰液收集管中，使痰液样本与痰液收集管中的保护剂混合，收集管的保存温度为小于或等于25℃。

本发明的原理如下：核酸酶抑制剂的作用是抑制体系中的核酸酶活性，防止痰液样本中的核酸被降解；pH值维持剂的作用是保持痰液样本为中性或弱碱性，为痰液样本中的核酸提供相对稳定的pH值环境；脱水剂的作用是减少痰液样本中的水分，防止痰液样本中的核酸被水解，脱水剂只吸走水分，不会溶解核酸。带盖可密闭的收集管便于随身携带，可方便受检者在突然有咳痰反应时随时收集痰液，且有效保护痰液中核酸的完整性。

为验证本方法的有效性，分别使用荧光定量PCR法和电泳法对本方法进行对比验证，实验步骤和结果如下：

(1)分别称取1.0g盐酸胍、2.5mg Tris以及1.0g聚乙二醇置于50ml旋转盖尖底离心管中，充分混匀制成痰液收集管，共制备4支含有保护剂的收集管，编号1-4；另外准备4支无保护剂的收集管，编号5-8；

(2)由浙江大学医学院附属第一医院呼吸内科提供的经临床确诊的肺癌患者痰液样本。肺癌细胞中含有的端粒酶赋予了肺癌细胞无限增殖的能力，而端粒酶由肺癌细胞的hTERT mRNA翻译合成，因此hTERT mRNA是肺癌细胞的特征标志物。在痰液的产生和咳出过程中，脱落的肺癌细胞混合在痰液中被咳出。因此在肺癌患者的痰液中能够检测到hTERTmRNA。将10例肺癌患者的痰液样本充分混匀制备成16ml的肺癌阳性混合痰液样本，分别取2ml痰液样本至1-8号收集管中；

(3)将收集管置于室温(20℃)条件下放置，不同的收集管及放置时间如下表所示：

收集管编号1、3、5、72、4、6、8放置时间5小时48小时

(4)荧光定量PCR法检测痰液样本中的mRNA：采用浙江今复康生物科技有限公司开发的“端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，该试剂盒可检测痰液样本中的hTERT mRNA。当PCR扩增结果为Ct值＜33时，表明检测结果为阳性即表示样本中含有hTERT mRNA；当PCR扩增结果为Ct值≥33或No Ct时，表明检测结果为阴性即表示样本中无hTERT mRNA。参照该试剂盒的产品说明书操作步骤对上述(3)得到的1号、2号、5号、6号收集管中的样品进行检测，经过痰液溶解、杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果如下表所示：

实验结果表明：使用本方法在室温(20℃)条件下分别保存肺癌阳性痰液5小时和48小时，样本中的hTERT mRNA均够被检出，证明其完整性良好；而不适用本方法在室温(20℃)条件下放置肺癌阳性痰液5小时和48小时后，

hTERT mRNA均未检出，说明其已被降解。因此本方法可有效保护痰液样本中的mRNA不被降解。

(5)电泳法检测痰液样本中的核酸：向上述(3)得到的3号、4号收集管中加入100μl盐酸胍溶液(2.0g/ml)，向上述(3)得到的7号、8号收集管中加入600μl盐酸胍溶液(2.0g/ml)，再分别向3号、4号、7号、8号管中加入100μlβ-巯基乙醇、30μl 20％NP-40；60℃保温5min，剧烈震荡混匀，12000rpm离心10min，取上清上核酸分离柱，12000rpm离心1min；取700μl洗涤液(10mM MES pH6.0，35％乙醇)洗涤2次；将柱子置于干净的1.5ml离心管上，向柱子膜中间位置加30μl TE溶液，60℃保温3min；12000rpm离心1min，收集流出液，取15μl流出液进行凝胶电泳，电泳结果见图1。

实验结果表明：使用本方法在室温(20℃)条件下分别保存肺癌阳性痰液5小时和48小时，对应的样品(分别为3、4号)经电泳后可见清晰的核酸条带，证明痰液样本中核酸完整性良好；而不采用本方法直接在室温(20℃)条件下放置5小时和48小时的肺癌阳性痰液样本(分别为7、8号)，经电泳后未见核酸条带，证明其已被降解。因此本方法可有效保护痰液样本中的核酸不被降解。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种能够随时收集痰液并保护痰液中核酸不被降解的方法。该方法将核酸保护剂置于一种方便携带的收集管中，可以在受检者有痰时随时收集痰液，其中的保护剂能够很好地避免核酸被降解。本发明涉及的保护剂为粉末状固体，能够较好地渗入痰液样本中，从而较好地与痰液样本充分接触。此外，本发明涉及的保护剂成分相对简单且成本低，非常适合在临床广泛使用，方便需要做痰液核酸检测的受检者在有痰时利用随身携带的收集管随时收集痰液，同时能够在室温条件下保护痰液样本中的核酸不被降解，给予受检者充足的时间将样本送至(或快递)医院或其他检验机构。

附图说明

图1为发明内容中电泳法检测痰液样本中的核酸的电泳图谱，从左至右依次为3号、7号、4号、8号、Marker；

图2为实施例4中电泳法检测痰液样本中的核酸的电泳图谱，从左至右依次为5号、6号、7号、8号、Marker。

具体实施方式

实施例中所用到的痰液样本由浙江今复康生物科技有限公司委托浙江大学医学院附属第一医院呼吸内科按临床标准取痰程序采集，参照《中国结核病防治规划·痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》，通过目测，黄色、灰色、铁锈色、血性、脓性、稠厚，呈现团块状的标本为接收标准。肺癌阳性痰液由临床确诊的肺癌患者采集得到。肺癌细胞中含有的端粒酶赋予了肺癌细胞无限增殖的能力，而端粒酶由肺癌细胞的hTERT mRNA翻译合成，因此hTERT mRNA是肺癌细胞的特征标志物。在痰液的产生和咳出过程中，脱落的肺癌细胞混合在痰液中被咳出。因此在肺癌患者的痰液中能够检测到hTERT mRNA。核酸检测采用浙江今复康生物科技有限公司开发的“端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，该试剂盒可检测痰液样本中的hTERT mRNA。当PCR扩增结果为Ct值＜33时，表明检测结果为阳性即表示样本中含有hTERT mRNA；当PCR扩增结果为Ct值≥33或NoCt时，表明检测结果为阴性即表示样本中无hTERT mRNA。

实施例1：痰液样本可在盐酸胍-Tris-聚乙二醇保护剂中保存72小时

步骤1：分别称取1.0g盐酸胍、2.5mg Tris以及1.0g聚乙二醇置于50ml旋转盖尖底离心管中，充分混匀制成痰液保护剂及收集管，共制备4支含有保护剂的收集管，编号1-4；另外准备4支无保护剂的收集管，编号5-8；取若干肺癌阳性痰液充分混匀制备成16ml的肺癌阳性痰液样本，分别取2ml痰液样本至各收集管中；

步骤2：将收集管置于室温(20℃)条件下放置，不同的收集管及放置时间如下表所示：

收集管编号1、52、63、74、8放置时间24小时48小时72小时96小时

步骤3：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤2得到的痰液样品进行检测，经过痰液溶解、杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示采用本方法保存的痰液样本在室温放置24-72小时后仍然能够检测出mRNA，而不采用本方法直接放置的痰液样本在室温放置24小时就无法检测到mRNA，因此本方法可以在室温(20℃)条件下保护痰液样本中核酸的完整性长达72小时。

样品编号1号2号3号4号5号6号7号8号Ct值25.9727.0330.1135.76No CtNo CtNo CtNo Ct实验结果阳性阳性阳性阴性阴性阴性阴性阴性

实施例2：本方法适用于粘痰、血痰、脓痰、稠厚痰、黄色痰、灰色痰、铁锈色痰

步骤1：分别称取1.0g盐酸胍、2.5mg Tris以及1.0g聚乙二醇置于50ml旋转盖尖底离心管中，充分混匀制成痰液收集管，共制备7支含有保护剂的收集管，编号1-7；

步骤2：取肺癌阳性且性状分别为粘痰、血痰、脓痰、稠厚痰、黄色痰、灰色痰、铁锈色痰各一例，分别置于1-7号收集管中，将收集管置于室温(20℃)条件下放置72小时；

步骤3：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤2得到的痰液样品进行检测，经过痰液溶解、杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示本方法对粘痰、血痰、脓痰、稠厚痰、黄色/灰色/铁锈色痰中的核酸均能发挥较好的保护作用：

样品编号1号2号3号4号5号6号7号Ct值22.6725.4429.0531.1125.6428.9227.49实验结果阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性

实施例3：本方法适用于1-5ml痰液样本

步骤1：分别称取1.0g盐酸胍、2.5mg Tris以及1.0g聚乙二醇置于50ml旋转盖尖底离心管中，充分混匀制成痰液保护剂及收集管，共制备5支含有保护剂的收集管，编号1-5；

步骤2：取若干肺癌阳性痰液充分混匀制备成10ml的肺癌阳性痰液样本，分别取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml痰液样本至1-5号收集管中，将收集管置于室温(20℃)条件下放置72小时；

步骤3：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤2得到的痰液样品进行检测，经过痰液溶解、杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示本方法对1-5ml痰液样本中的核酸均能发挥较好的保护作用：

样品编号1号2号3号4号5号Ct值29.7926.7425.0321.2120.65实验结果阳性阳性阳性阳性阳性

实施例4：痰液样本可在异硫氰酸胍-Bis Tris–正丁醇保护剂中保存72小时

步骤1：分别称取1.2g异硫氰酸胍、2.0mg Bis Tris以及2ml叔丁醇置于50ml旋转盖圆底离心管中，充分混匀制成痰液保护剂及收集管，共制备8支含有保护剂的收集管，编号1-8；

步骤2：取若干肺癌阳性痰液充分混匀制备成16ml的肺癌阳性痰液样本，分别取2ml痰液样本至1-8号收集管中，将收集管置于室温(20℃)条件下放置72小时；

步骤3：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)检测痰液样本中的mRNA，参照产品说明书操作步骤对步骤2得到的1-4号痰液样品进行检测，经过痰液溶解、杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示痰液样本可在异硫氰酸胍-Bis Tris-叔丁醇保护剂中保存72小时：

步骤4：利用电泳法检测痰液样本中的核酸。向步骤2得到的5-8号收集管中分别加入600μl盐酸胍溶液(2.0g/ml)，再分别向3号、4号、7号、8号管中加入100μlβ-巯基乙醇、30μl 20％的NP-40；60℃保温5min，剧烈震荡混匀，12000rpm离心10min，取上清上核酸分离柱，12000rpm离心1min；取700μl洗涤液(10mM MES pH6.0，35％乙醇)洗涤2次；将柱子置于干净的1.5ml离心管上，向柱子膜中间位置加30μl TE溶液，60℃保温3min；12000rpm离心1min，收集流出液，取15μl流出液进行凝胶电泳，电泳结果见图2。结果显示，痰液样本在异硫氰酸胍-Bis Tris-叔丁醇保护剂中保存72小时后，对应的样品(5-8号)经电泳后均可见清晰的核酸条带，证明痰液样本中的核酸完整性良好。

实施例5：保护剂中的盐酸胍在0.5-4.0g均具可发挥良好的核酸保护作用

步骤1：分别称取2.5mg Tris以及1.0g聚乙二醇置于50ml旋转盖尖底离心管中，共制备8支，编号1-8；分别向1-8号收集管中加入0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g盐酸胍，充分混匀制成痰液保护剂及收集管；

步骤2：取若干肺癌阳性痰液充分混匀制备成16ml的肺癌阳性痰液样本，分别取2ml痰液样本至1-8号收集管中，将收集管置于室温(20℃)条件下放置72小时；

步骤3：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤2得到的痰液样品进行检测，经过痰液溶解、杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示保护剂中的盐酸胍在0.5-4.0g均具可发挥良好的核酸保护作用：

实施例6：保护剂中的Tris在1.5-4.0mg均具可发挥良好的核酸保护作用

步骤1：分别称取1.0g盐酸胍以及1.0g聚乙二醇置于50ml旋转盖尖底离心管中，共制备6支，编号1-6；分别向1-6号收集管中加入1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mgTris，充分混匀制成痰液保护剂及收集管；

步骤2：取若干肺癌阳性痰液充分混匀制备成12ml的肺癌阳性痰液样本，分别取2ml痰液样本至1-6号收集管中，将收集管置于室温(20℃)条件下放置72小时；

步骤3：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤2得到的痰液样品进行检测，经过痰液溶解、杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示保护剂中的Tris在1.5-4.0mg均具可发挥良好的核酸保护作用：

样品编号1号2号3号4号5号6号Ct值21.7922.3525.7322.2221.7520.95实验结果阳性阳性阳性阳性阳性阳性

实施例7：保护剂中的聚乙二醇在0.5-2.5g均具可发挥良好的核酸保护作用

步骤1：分别称取1.0g盐酸胍以及2.5mg Tris置于50ml旋转盖尖底离心管中，共制备5支，编号1-5；分别向1-5号收集管中加入0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g聚乙二醇，充分混匀制成痰液保护剂及收集管；

步骤2：取若干肺癌阳性痰液充分混匀制备成10ml的肺癌阳性痰液样本，分别取2ml痰液样本至1-5号收集管中，将收集管置于室温(20℃)条件下放置72小时；

步骤3：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤2得到的痰液样品进行检测，经过痰液溶解、杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示保护剂中的聚乙二醇在0.5-2.5g均具可发挥良好的核酸保护作用：

样品编号1号2号3号4号5号Ct值20.6621.4721.5320.2623.67实验结果阳性阳性阳性阳性阳性