一种池生代尔夫特菌及其在水稻稻曲病防治中的应用

摘要

本发明公开了一种池生代尔夫特菌及其在水稻稻曲病防治中的应用，该菌株命名为池生代尔夫特菌(Delftia lacustris)ZJU‑B1，保藏编号为CCTCC NO:M 2017641，保藏日期为2017年10月30日。本发明分离获得的池生代尔夫特菌(Delftia lacustris)ZJU‑B1能有效防治水稻稻曲病的发生，降低病害发生率，显著提高水稻的产量和安全性，实现水稻的健康无公害生产。

说明书

技术领域

本发明涉及农作物病害防治技术领域，尤其涉及一种池生代尔夫特菌及其在水稻稻曲病防治中的应用。

背景技术

水稻是我们种植面积最大，产量最高的粮食作物，全国约有60％以上的人口以稻米为食。在水稻生产过程中，病害是制约水稻产量和质量的主要因素，常造成巨大的经济损失。

目前，稻曲病已广泛分布在全球40多个国家，该病在20世纪80年代以前一直是水稻的一个次要病害，在田间发病较轻，但90年代后，随着高度感病的杂交稻的推广种植及施肥水平的提高，其危害面积不断扩大，在许多地方已经跃升为水稻最主要病害，该病主要在穗部发生，不仅影响谷粒本身，影响稻米的色泽，同时会在稻曲球形成过程中消耗病穗及病株的营养，致使病穗上的其他谷粒无法正常受精或者不饱满，从而会造成水稻减产，其带有毒素的孢子会对人畜健康造成不良影响也会污染健康的稻谷，降低了稻米的品质，严重制约着水稻的健康无公害生产。

选育抗病品种是防治稻曲病的重要措施，但目前进行田间抗性评价研究中未发现对该病高抗的水稻品种。因此，现阶段对稻曲病的防治主要采用化学防治手段。水稻生产中不同稻作区连年使用单一化学药剂防治稻曲病，容易导致田间抗药性的产生，药剂防效降低，药量增大，不利于环境的可持续发展。开发水稻环境友好型及无交互抗性的新型药剂，提高增效减药技术，是当前我国农业生产的迫切需要，做好预防控制稻曲病急需解决的难题。

生物农药是指那些由植物提取物、微生物活体或微生物产生的代谢产物制成的具有农药属性的产品。它们的种类非常多，按来源可分为植物农药、细菌农药、真菌农药、病毒农药、农用抗生素等。生物农药通常容易降解，进入自然界的碳、氮循环，是不污染环境的绿色农药，是解决化学农药污染的有效途径之一。目前生物防治技术在稻曲病防治中的应用，国内外没有太多的报道。

池生代尔夫特菌为氧化酶、触酶均阳性，不发酵葡萄糖，不形成芽孢的革兰式阴性菌，能改良疏松土壤，解决土壤板结，活化土壤，促进固定的磷、钾和微量元素的释放，提高肥料利用率。同时，能分泌细胞分裂素、吲哚乙酸、生命素、维生素、有机酸、蛋白酶、粮化酶等活性成分，直接促进根毛生长，还可以降解辛硫磷，两天内降解率90％以上。另外，该菌在三氯乙烯、芳香族化合物及有机磷除草剂的降解方面颇为有效，还可吸收分解作物根系分泌的自毒有机酸，净化生长环境。

因此，成功开发一种能防控稻曲病发生的多功能性内生菌显得尤为重要。

发明内容

本发明提供了一种池生代尔夫特菌及其在稻曲病防治中的应用，该菌株能有效防治水稻稻曲病的发生，降低病害发生率，显著提高水稻的产量和安全性，实现水稻的健康无公害生产。

本发明提供了一种池生代尔夫特菌，命名为池生代尔夫特菌(Delftialacustris)ZJU-B1，保藏编号为CCTCC NO:M 2017641，保藏日期为2017年10月30日。

上述池生代尔夫特菌(Delftia lacustris)ZJU-B1分离自浙江省温岭市稻曲病发病田块，为水稻内生菌，寄生于水稻稻穗中。

所述池生代尔夫特菌的生物学特征为：菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，为光泽且不透明的黄白色菌落，菌落的周围存在透明的分泌圈；革兰式染色为阴性，细胞呈球杆状，单个分散排列，规格为0.4-0.9×1.7-3.6μm。

具体地，所述池生代尔夫特菌的16S rDNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述的池生代尔夫特菌在防治水稻稻曲病中的应用。

本发明还提供了一种用于防治水稻稻曲病的生防制剂，所述生防制剂包含所述的池生代尔夫特菌(Delftia lacustris)ZJU-B1。

进一步地，所述生防制剂中，池生代尔夫特菌的浓度为2×10⁷-2×10⁹CFU/mL。

更优选，所述生防制剂中，池生代尔夫特菌的浓度为2×10⁹CFU/mL。

作为优选，所述的生防制剂，以体积分数计，，包括以下原料组分：

池生代尔夫特菌液85～90％；

分散剂2～5％；

渗透剂0.2～0.5％；

其余为水。

作为优选，所述分散剂为SP-SC29和SP-SC3；以生防制剂计，所述SP-SC29的添加量为2～5％；所述SP-SC3的添加量为2～5％。

作为优选，所述渗透剂为有机硅。

本发明还提供了所述生防制剂在防治水稻稻曲病中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明分离获得的池生代尔夫特菌(Delftia lacustris)ZJU-B1为水稻多功能性内生菌，寄生在水稻稻穗中，能快速在水稻中占据有利的生态位，并能与寄主植物和环境建立和谐联合的关系，同时能够有效的防治稻曲病菌的侵染，降低病害发生率，显著提高水稻的产量和安全性，实现水稻的健康无公害生产。

(2)本发明分离获得的池生代尔夫特菌(Delftia lacustris)ZJU-B1生长速度快，营养条件要求低，在普通LB培养基中，以1％的种子量接入，30℃160rpm振荡培养20-24小时，活菌总浓度可达2×10⁷-2×10⁹CFU/mL。

(3)本发明分离获得的池生代尔夫特菌(Delftia lacustris)ZJU-B1具有良好的稻曲病防治效果，能有效替代或减少化学农药的使用，减少抗药性的发生，绿色、环保且安全，将为维护农业生态平衡，实现农业可持续发展发挥重要的作用。

附图说明

图1为实施例1中池生代尔夫特菌(ZJU-B1)拮抗稻曲病菌的结果图；

其中，A为对照CK；B为池生代尔夫特菌ZJU-B1。

图2为实施例1中池生代尔夫特菌(ZJU-B1)的系统进化分析图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1池生代尔夫特菌的分离和鉴定

1、从稻穗中分离内生菌

从温岭稻曲发病株中，挑取健康稻粒，用75％乙醇消毒1min左右，再用灭菌水漂洗3次，除去残留的消毒剂，最后将其放在无菌吸水纸上吸去多余的水分，再把其放入无菌研钵中，加入6mL BPS缓冲液研碎，取上清10、50、100倍稀释，取各稀释液200μL涂布于LB平板，同时验证最后一次冲洗水涂布于LB平板，检验组织表面消毒是否彻底，30℃暗培养1-2d，并记录菌落形态、大小和颜色。

上述池生代尔夫特菌的生物学特征为：在LB培养基上所分离纯化的菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，有光泽、不透明的黄白色，菌落周围会出现透明的分泌圈，革兰式染色为阴性，显微镜镜检结果表明该细胞为球杆菌(0.4-0.9×1.7-3.6μm)，单个分散排列。

2、室内拮抗实验评价池生代尔夫特菌对稻曲病菌的抑制作用

对实验室分离鉴定的稻曲菌株重新活化培养约10d左右，在菌株生长活跃的同一圆周上制取菌碟(直径0.5cm)，菌丝面朝下并将其转移到PDA平板中央，用灭菌镊子取出浸在菌液中的滤纸片，放置在离稻曲菌碟2.5cm处的平板上，以无菌液滤纸片做对照，实验做4个重复，然后把培养皿倒置在25℃培养箱中，培养10d，取出观察是否具有了明显的抑制作用。

结果如图1所示，当量取CK对照平板的稻曲菌落直径为3.6cm时，加拮抗菌ZJU-B1平板中的稻曲病菌只长了0.9cm，抑制率达到了87％，说明池生代尔夫特菌ZJU-B1对稻曲病菌具有明显的拮抗效果。

3、菌株的分子鉴定

通过16S rDNA基因片段分析对分离的内生菌进行分类鉴定，主要分析方法是将PCR产物克隆到质粒载体上进行测序，与16S rRNA数据库中的序列进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样品中可能的微生物种类。

用1.5ml离心管收集过夜培养的ZJU-B1菌种1ml，用TakaraDNA提取试剂盒对其进行DNA提取和纯化。PCR扩增所用的引物序列为：

27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’；

1525R:5'-AAGGAGGTGWTCCARCC-3'；

反应体系：

PCR反应条件：

95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，最后72℃扩展7min，35个循环。

16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示；测序结果在BLAST researches上比对测序结果(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。用软件MEGA构建进化树，发现ZJU-B1与Delftialacustris共享同一个分支，支持度为100％，具有高度的相似性(图2)。

综上所述，通过上述方法获得池生代尔夫特菌(Delftia lacustris)ZJU-B1，并对该菌株进行保藏。

菌株保藏说明：

菌株名称：池生代尔夫特菌；拉丁名：Delftia lacustris；菌株编号：ZJU-B1；

保藏单位：中国典型培养物保藏中心；

保藏号：CCTCC NO:M 2017641；

保藏机构简称：CCTCC；

地址：中国武汉武汉大学；保藏日期为2017年10月30日。

实施例2生防制剂的制备和应用

1、生防制剂的制备

将池生代尔夫特菌划线于LB平板上，挑取单菌落到装有50mL LB液体培养基的三角瓶中，30℃180rpm振荡培养18-22h左右，当测得600nm处的OD值在0.8-1.0之间时，再将种子液以1％的接种量加入到装有100mL LB培养基的250mL三角瓶中，30℃180rpm振荡培养24小时，测其活菌数可达到10⁹CFU/mL。

以体积分数计，取制得的发酵液87.5％，加入分散剂SP-SC29 2％，分散剂SP-SC33％，渗透剂有机硅0.5％，菌液上清7％，混合后，制备获得生防制剂，供田间使用。

2、田间施用生防制剂对稻曲病的防治效果

施药地点：温岭时间：水稻破口前5-7d(叶枕距5-7cm)

处理组1：生防制剂，200毫升/亩；

处理组2：430g/L戊唑醇SC，15毫升/亩；

处理组3：不施药对照。

小区面积33m²，4次重复。

调查方法：每小区按照对角线五点取样，每点调查相连的10丛水稻，每小区共调查50丛，记录总穗数和病穗数。

调查时间：施药后25天左右，在水稻黄熟期稻曲病病情稳定时调查一次药效。

药效计算方法：按以下公式计算：

式中：PT：防治效果，单位为百分率(％)；CK₁：空白对照区施药后病穗率；PT₁：药剂处理区施药后病穗率。

表1稻曲病田间药效试验结果的比较

结果如表1所示，上述生防制剂能有效的防治稻曲病的发生，虽防治效果较化学防治略低，但也高达77.3％，但能有效减少化学农药的使用量及抗药性的发生，绿色环保、安全、且协调可持续。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种池生代尔夫特菌及其在水稻稻曲病防治中的应用

<160>3

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>1426

<212>DNA

<213>池生代尔夫特菌(Delftia lacustrisZJU-B1)

<400>1

acttccccca gtcacgaacc ccgccgtggt aagcgccctc cttgcggtta ggctacctac60

ttctggcgag acccgctccc atggtgtgac gggcggtgtg tacaagaccc gggaacgtat 120

tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta gcgattccga cttcacgcag tcgagttgca 180

gactgcgatc cggactacga ctggttttat gggattagct ccccctcgcg ggttggcaac 240

cctctgtacc agccattgta tgacgtgtgt agccccacct ataagggcca tgaggacttg 300

acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca ccggcagtct cattagagtg ctcaactgaa 360

tgtagcaact aatgacaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca 420

cgagctgacg acagccatgc agcacctgtg tgcaggttct ctttcgagca cgaatccatc 480

tctggaaact tcctgccatg tcaaaggtgg gtaaggtttt tcgcgttgca tcgaattaaa 540

ccacatcatc caccgcttgt gcgggtcccc gtcaattcct ttgagtttca accttgcggc 600

cgtactcccc aggcggtcaa cttcacgcgt tagcttcgtt actgagaaaa ctaattccca 660

acaaccagtt gacatcgttt agggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gtttgctccc 720

cacgctttcg tgcatgagcg tcagtacagg tccaggggat tgccttcgcc atcggtgttc 780

ctccgcatat ctacgcattt cactgctaca cgcggaattc catccccctc taccgtactc 840

tagccatgca gtcacaaatg cagttcccag gttgagcccg gggatttcac atctgtctta 900

cataaccgcc tgcgcacgct ttacgcccag taattccgat taacgctcgc accctacgta 960

ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg gtgcttattc ttacggtacc gtcatgggcc1020

ccctgtatta gaaggagctt tttcgttccg tacaaaagca gtttacaacc cgaaggcctt1080

catcctgcac gcggcattgc tggatcaggc tttcgcccat tgtccaaaat tccccactgc1140

tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg tggctggtcg tcctctcaga1200

ccagctacag atcgtcggct tggtaagctt ttatcccacc aactacctaa tctgccatcg1260

gccgctccaa tcgcgcgagg cccgaaggtc ccccgctttc atcctcagat cgttgcggta1320

ttagctactc tttcgagtag ttatccccca cgactgggca cgttccgatg tattactcac1380

ccgttcgcca ctcgtcagcg tccgaagacc tgttaccgtc gactgc 1426

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

agagtttgat cctggctcag20

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

aaggaggtgw tccarcc 17