葡萄果实无核主效QTL位点SDL的SNP分子标记及应用

摘要

本发明属于葡萄分子育种领域，具体提供了一种葡萄果实无核主效QTL位点的分子标记及应用。利用RAD‑seq法测序并构建母本‘红地球’和 父本‘森田尼无核’的联合遗传连锁图谱，结合葡萄果实表型鉴定，并利用区间作图法进行QTL分析，在联合遗传连锁图的第18连锁群检测到主效QTL位点SDL的存在，该主效QTL位点的贡献率为77.9％，与该位点紧密连锁的两个SNP标记为SDL1和SDL2，其遗传距离为124kb。本发明所获得的葡萄果实无核主效QTL位点的SNP分子标记，可用于葡萄果实无核性状的早期筛选，对于提高育种效率具有重要的理论和实践指导意义。

说明书

技术领域

本发明属于葡萄分子遗传育种领域，具体涉及一种葡萄果实无核主效QTL位点SDL的SNP分子标记和应用。

背景技术

葡萄（Vitis> L.）是我国重要的经济作物，栽培面积和产量均居世界首位。葡萄果实营养价值高，含糖量高，富含花色苷和白藜芦醇，并具有一定的保健功能，受到广大消费者的喜爱。无核是葡萄果实性状的重要因素，无核葡萄食用方便，尤其适合老人儿童和女士，另外，无核葡萄品种的产量和经济效益较高。因此，培育无核品种成为了葡萄育种的重要目标之一。

葡萄是多年生藤本植物，世代周期长，结果晚。传统育种中，利用果实表型性状对葡萄基因型进行选择，这种方法需要结实以后才能判断，周期长，效率低。随着分子育种技术的发展，通过分子标记构建高密度遗传连锁图谱并对果实无核进行QTL（Quantitativetrait loci，数量性状基因座）分析和定位成为现实，也为提高目标数量性状优良基因选择的准确性和预见性奠定了基础。利用分子标记定位数量性状QTL，其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间的交换率，来确定QTL的具体位置。基于获得的标记基因型分离与数量性状之间的关系，可直接确定控制数量性状的位点，开发可应用于分子标记辅助选择育种的技术，这已在许多重要农作物上取得了成功的应用。

目前有关葡萄数量性状的QTL定位研究已有一定的进展，针对病害、生长性状和果实部分性状QTL定位及分子标记的研究已有报道。针对葡萄果实无核的QTL定位目前多限于‘无核白’这一亲本（Nilo Mejía等，2011），其实用性仍受限于单一亲本的F1代杂交群体。因此，开展不同群体遗传连锁图谱构建，并进行葡萄无核的QTL定位是拓宽分子标记应用范围的必要手段。

SNP是继RFLP、SSR之后的又一种新的分子标记，通常具双等位基因多态性。国内外目前尚无利用SNP分子标记进行葡萄果实无核性状的QTL定位研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄果实无核主效QTL位点SDL的分子标记以及该分子标记的引物对。

本发明的另一目的是提供一种葡萄果实无核主效QTL位点SDL的分子标记的筛选方法。

本发明的又一目的是提供一种检测与葡萄果实无核主效QTL位点SDL连锁的分子标记SDL1和SDL2的方法。

本发明的再一目的是提供分子标记SDL1和SDL2在葡萄果实无核分子辅助育种中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种葡萄果实无核主效QTL位点SDL的分子标记SDL1和SDL2，所述分子标记SDL1的核苷酸序列如SEQ>

上述分子标记SDL1和SDL2是以葡萄品种‘森田尼无核’的基因组DNA为底物进行PCR扩增所得，两个标记之间的遗传距离为124kb，它们位于葡萄基因组第18号染色体26835846～26960426的位置。

本发明还提供了一种上述分子标记SDL1和SDL2的引物对，分子标记SDL1的引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示，分子标记SDL2的引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了一种上述分子标记SDL1和SDL2的筛选方法，包括以下步骤：

a.以葡萄品种‘红地球’作母本，‘森田尼无核’作父本，杂交获得F1代群体单株；

b.利用RAD-seq法对两个亲本及其F1代群体测序，统计分析亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型，获得多态性标记位点，然后采用Jionmap4.0作图软件对其进行连锁分析，构建‘红地球’和 ‘森田尼无核’联合遗传连锁图谱；

c.对母本‘红地球’和父本 ‘森田尼无核’的F1代群体单株的果实有无核情况进行表型鉴定；

d.利用MapQTL5.0作图软件的区间作图法，将F1代群体中每个无核单株与步骤b构建的‘红地球’和 ‘森田尼无核’联合遗传连锁图谱中的分子标记进行连锁和QTL分析，在联合遗传连锁图谱的第18连锁群上检测到无核QTL位点SDL，其LOD值为26.3，该位点贡献率为77.9％，是主效QTL；

e.根据步骤d得到的主效QTL位点所在区域，选择与其连锁距离小于200kb且能对F1代群体果实无核性状进行良好分型的SNP分子标记SDL1和SDL2，作为葡萄果实无核主效QTL位点SDL的分子标记。

本发明还提供了一种检测与葡萄果实无核主效QTL位点SDL连锁的分子标记SDL1和SDL2的方法，包括以下步骤：以葡萄基因组DNA作为模板，用上述分子标记SDL1和SDL2的引物对进行PCR扩增，扩增产物进行一代TA克隆测序，如SDL1的引物对扩增的146bp长的DNA序列第73位碱基为A，同时SDL2的引物对扩增的150bp长的DNA序列第75位碱基为C，则表示存在与葡萄果实无核主效QTL位点SDL连锁的分子标记SDL1和SDL2。

本发明还提供了上述分子标记SDL1和SDL2在葡萄果实无核分子辅助育种中的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用的母本‘红地球’为有核葡萄，父本‘森田尼无核’为无核葡萄，其杂交后代果实无核、有核性状进行了很好的分离，分离比为1:1，因此，可确保葡萄果实无核性状QTL位点检测的准确性和可重复性。

(2)本发明采用了SNP标记对葡萄果实无核性状进行筛选，SNP标记在分子标记辅助育种中操作更为准确、重复性更好、技术要求低、准确度高，是共显性和锚定标记，更加容易在分子标记辅助育种中应用。

(3)本发明确定了葡萄果实无核主效QTL位点，该位点对葡萄无核这一数量性状贡献率较高，为77.9％，因此，基于此位点筛选连锁分子标记对葡萄无核性状判断的准确性较好，鉴别准确性较高。

(4)目前普遍认可的应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的距离需 ≤5.0cM，本发明的分子标记SDL1和SDL2位于SDL位点两侧，两个标记之间的遗传距离为124kb，远远小于该值，且连锁很紧密，有效提高了利用分子标记选择葡萄果实无核主效QTL位点的准确性和葡萄无核品种的选育效率，因此，本发明开发的葡萄果实无核主效QTL位点及分子标记具有良好的应用价值，可加快对葡萄果实无核性状的改良。

附图说明

图1为葡萄果实无核主效QTL位点SDL在‘红地球’和>SDL表示的是葡萄果实无核主效QTL位点的名称。

图2为葡萄果实无核主效QTL位点SDL在‘红地球’和>SDL。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 葡萄果实无核主效QTL位点SDL及其分子标记SDL1和SDL2的获得

a.利用母本‘红地球’和父本‘森田尼无核’杂交，获得129株F1代群体；

b.用RAD-seq（限制性酶切位点关联DNA测序）法对包含2个亲本在内的131个个体基因组进行测序；首先提取131个个体的基因组DNA，利用Nanodrop、Gel-Electrophotometric等对样品DNA进行检测，检测合格的样品，用超声打断，然后用T4 DNA聚合酶和Klenow聚合酶修复末端，制备平末端，在DNA片段3’末端加上A碱基，配置T4 DNA连接酶反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间使adapter和加“A”产物连接，琼脂糖凝胶纯化260-450bp的DNA片段，配置PCR反应体系对上一步的切胶回收产物进行扩增，其中PCR酶选用PhusionDNA Polymerase；对筛选的DNA序列进行测序，测序仪为xren PE150；最终得到39.99Gb原始数据，平均每个个体300.73Mb。

运用SOAP比对软件将测序序列比对到参考基因组序列（NCBI_GCF_000003745.3_12X）上；覆盖到参考基因组的平均覆盖度为3.84%，覆盖到的区域平均测序深度为8.71X。

根据 SOAP 比对结果，使用 samtools 软件生成 CaSFS 软件所需的 pileup 和glf 文件；利用CaSFS 软件鉴定群体中每个SNP位点的情况，获得SNP共33072个，因为SNP数量比较多，所以采用窗口滑动的方法，选择以每15个SNP为一个窗口，每次滑动一个SNP，确定每个窗口的基因型以及每个个体的交换位点，得到每个个体的基因型并生成bin（SNP簇）图；最后筛选到红地球纯合森田尼杂合的bin有1476个，森田尼纯合红地球杂合的bin有860个。

对生成的bin图采用拟测交的方式，利用Jionmap4.0作图软件进行连锁分析，构建了一张‘红地球’和 ‘森田尼无核’联合遗传连锁图谱；采用Kosambi’s函数计算图距。

c.在果实成熟期，调查母本‘红地球’和父本‘森田尼无核’F1代有无核情况；根据整理调查的有无核性状，使用MapQTL 5.0软件通过置换检验（Permutation Test）确定阈值，置换检验次数>1000，采用区间作图（Interval Mapping）检测出LOD峰值的标记位点；以LOD值 ≥ 3为标准，大于3说明存在一个QTL位点。

d.结果表明，在‘红地球’和 ‘森田尼无核’联合遗传连锁图谱的第18连锁群上检测到一个无核QTL位点，LOD值为26.4，贡献率为77.9％，该位点为主效QTL，命名为SDL，其位于葡萄基因组第18号染色体26835846～26960426的位置。

e.根据上述步骤得到的主效QTL位点所在区域，选择与其连锁距离小于200kb且能对F1代群体果实无核性状进行良好分型的两个SNP分子标记，命名为SDL1和SDL2，作为葡萄果实无核主效QTL位点SDL的分子标记。

实施例2 与葡萄果实无核主效QTL位点SDL连锁的分子标记SDL1和SDL2的检测

以葡萄基因组DNA为模板，以分子标记SDL1和SDL2的引物对进行PCR扩增，扩增产物进行TA克隆测序，若SDL1 的引物对扩增的146bp长的DNA序列第73bp处碱基为A，同时SDL2的引物对扩增的150bp长的DNA序列第75bp处碱基为C，则表示与葡萄果实无核主效QTL位点SDL连锁的分子标记SDL1和SDL2存在。

上述引物使用primer5设计，设计原理为：引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对，退火温度55-60℃，无引物二聚体；上述分子标记SDL1的引物对的正向引物序列SEQ ID NO.3 为：5'-GGCTTCTGGTTGGGTTTCATTCT-3'；反向引物序列SEQ ID NO.4为：5'-CTCTCTCCTAGGCGCCATCATCAGA-3'；上述分子标记SDL2的引物对的正向引物序列SEQ IDNO.5 为：5'-AGCTTTGGAATTTTTACAGTCTTTAT-3'；反向引物序列SEQ ID NO.6为：5'-GGATGCTGCAGGAGAATTCTACAGG-3'。

上述PCR扩增体系为20μL：10×Buffer(Mg²⁺plus)>

上述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸10min。

实施例3 分子标记SDL1和SDL2在葡萄果实无核分子辅助育种中应用

a.以‘红地球’为母本，‘森田尼无核’为父本构建F1代杂交群体，获得129株F1代群体单株；

b.对所获得的129株F1代单株进行SDL1和SDL2标记的检测，具体方法为：以葡萄基因组DNA为模板，以分子标记SDL1和SDL2的引物对进行PCR扩增，扩增产物用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，TA测序；如果SDL1引物对扩增的146bp长的DNA序列第73bp处碱基为A，同时SDL2引物对扩增的150bp长的DNA序列第75bp处碱基为C，说明该单株存在分子标记SDL1和SDL2，预测果实无核；测序结果显示：在‘红地球’和 ‘森田尼无核’杂交得到的129株F1代群体中，有66个子代个体，其SDL1引物对扩增的146bp长的DNA序列第73bp处碱基为A，同时SDL2引物对扩增的150bp长的DNA序列第75bp处碱基为C；有63个子代个体，其SDL1引物对扩增的146bp长的DNA序列第73bp处碱基为T，同时SDL2引物对扩增的150bp长的DNA序列第75bp处碱基为A。

c.果实成熟期，对F1代群体的果实表型进行检测，结果显示，上述66个同时检测到分子标记SDL1和SDL2的个体中，有62个果实无核，有4个果实有核；分子标记SDL1和SDL2预测果实无核性状正确率为93.94%；由此可以看出，用分子标记SDL1和SDL2预测葡萄果实无核性状具有较好的效果。

上述分子标记SDL1的引物对的正向引物序列SEQ ID NO.3 为：5'-GGGCTTCTGGTTGGGTTTCATTCT-3'；反向引物序列SEQ ID NO.4为：5'-CTCTCTCCTAGGCGCCATCATCAGA-3'；上述分子标记SDL2的引物对的正向引物序列SEQ IDNO.5 为：5'-AGCTTTGGAATTTTTACAGTCTTTAT-3'；反向引物序列SEQ ID NO.6为：5'-GGATGCTGCAGGAGAATTCTACAGG-3'。

上述PCR扩增体系为20μL：10×Buffer(Mg²⁺>

上述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸10min。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 葡萄果实无核主效QTL位点SDL的SNP分子标记及应用

<130> 无

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggcttctgg ttgggtttca ttctcctttg tttgggttcg ttctctcttt cgacttcatt 60

tcttcctttt ttacttttct gatggcgcct aggagagaga cgactgcctc tagggctcag 120

ggcaagcgcc ctgctaagcc atttca 146

<210> 2

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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gttcaagaca gatccgcatg tgcacccctg agtggctcaa agatgacccc atccacaact 120

cgaagcctgt agaattctcc tgcagcatcc 150

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggcttctgg ttgggtttca ttct 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

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ctctctccta ggcgccatca tcaga 25

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<212> DNA

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<400> 5

agctttggaa tttttacagt ctttat 26

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggatgctgca ggagaattct acagg 25