一种基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器

摘要

本发明公开一种基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器，体现在将修饰有适体2的纳米级羟基磷灰石(HAP)作为信号探针和修饰有适体1的磁性微球在有目标物凝血酶存在的条件下能够形成超灵敏的均相电化学适体传感器。氧化石墨烯通过电沉积的方式在玻碳电极表面生成还原氧化石墨烯，石墨烯在此起到信号放大的作用。带有目标物凝血酶的三明治结构中的HAP与钼酸钠溶液在石墨烯表面形成具有氧化还原电活性的磷钼酸盐沉淀。通过电化学方法进行检测和表征。结果表明在均相溶液中，对于凝血酶的检测具有灵敏的效果。在最优检测环境下，对于凝血酶的响应呈现出一个线性范围，范围从1nM到1fM，检出限是1.3aM。

说明书

技术领域

本发明涉及电化学检测技术领域，具体涉及一种基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器。

背景技术

由于电化学方法具有高灵敏度，低成本，响应速度快，操作简单等潜在优点，在各个领域得到应用。然而，现在大多数电化学实验在多相溶液中进行测定，但是将识别单元在电极界面的固定比较费力，耗时。与在多相溶液中测定相比，免固定的均相电化学适体传感器表现出许多优点，不仅包括高结合效率，而且由于低空间位阻也加强了信号电流。此外，均相的电化学适体传感器允许识别单元在电极和溶液之间的界面上自由移动，这可以提高识别单元对其基底的结合效率提高信号电流。最重要的是，在分析物的定量检测中应用均相的电化学适体传感器十分有效。

由于石墨烯独特的电学，光学和机械性能，近些年来其在电子，超级电容器，传感器和复合材料等各个领域的潜在用途受到了极大的关注。

众所周知，凝血酶在人类生命中起着重要的作用，它是血液中的丝氨酸蛋白酶，可以实现可溶性纤维蛋白原向不溶性纤维蛋白的转化。此外，它还与许多疾病有关，例如心血管疾病，炎症反应，血栓栓塞性疾病和止血药物治疗。因此定量检测凝血酶在临床研究和诊断方面有很大的意义。

发明内容

针对以上现有技术，本发明目的是提供一种基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器以及在检测凝血酶中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供了一种用于检测凝血酶浓度的检测探针，包括修饰有凝血酶适体1的磁性微球(简称MNP-TAB1)和修饰有凝血酶适体2的羟基磷灰石(简称HAP-TAB2)，其中，所述修饰有凝血酶适体的磁性微球(简称MNP-TAB1)和修饰有凝血酶适体的羟基磷灰石(简称HAP-TAB2)能够与目标物凝血酶形成MNP-TAB1-凝血酶-HAP-TAB2的三明治结构。

本发明的第二个方面，提供一种用于检测凝血酶浓度的检测探针的制备方法，包括以下步骤：

磁性微球与凝血酶适体反应得到修饰有凝血酶适体的磁性微球；

羟基磷灰石与凝血酶适体反应得到修饰有凝血酶适体的羟基磷灰石。

本发明的第三个方面，提供一种基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器，所述电化学适体传感器包括上述用于检测凝血酶浓度的检测探针和与所述探针相配合使用的检测电极，该检测电极为通过电沉积方法得到的还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极(edGO/GCE)；其中，三明治结构中的HAP与钼酸盐溶液在edGO/GCE表面生成磷钼酸盐沉淀，形成的复合体即为基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器。

本发明的第四个方面，提供一种用于检测凝血酶浓度的检测探针在制备基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相检测凝血酶电化学适体传感器中的应用。

本发明的第五个方面，提供一种基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器在检测凝血酶中的应用。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：

本发明提出了一种用凝血酶适体修饰纳米颗粒与目标物凝血酶形成三明治结构，并用HAP作信号探针成功制备了一种超灵敏的均相电化学适体传感器。该传感器检测目标物质凝血酶表现出卓越的性能，具体表现在灵敏度高，选择性强，稳定性好、理想化的回收等方面，在临床领域具有潜在应用；对于凝血酶的响应呈现出一个线性范围，范围从1nM到1fM，检出限是1.3aM。

本发明提出了用HAP纳米颗粒做信号探针，因其能与钼酸盐反应生成具有氧化还原电活性的沉淀，实现了对凝血酶在均相溶液中检测，提高了检测的灵敏度。

附图说明

构成本发明的一部分说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明的原理图；

图2是本发明检测凝血酶的线性关系图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

本发明中所使用的仪器及试剂是：

(1)仪器：CHI-660C电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；采用饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝电极为对电极；扫描电子显微镜(JEOL JSM-7001F)；透射电子显微镜(JEOL JEM-2100)。

(2)试剂：凝血酶，凝血酶适体链，石墨，羟基磷灰石，Fe₃O₄磁性微球，钼酸钠，其他试剂为分析纯，实验用水为二次水。

术语解释：

室温：指的是室内温度，本文中优选15～37℃。

正如背景技术所介绍的，针对凝血酶的检测，现有技术中亟需研究一种灵敏度高、选择性好、检出限低的新型均相电化学适体传感器，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种用于检测凝血酶浓度的检测探针，包括修饰有凝血酶适体的磁性微球(MNP-TAB1)和修饰有凝血酶适体1的羟基磷灰石(HAP-TAB2)，其中，所述修饰有凝血酶适体2的磁性微球(MNP-TAB1)和修饰有凝血酶适体的羟基磷灰石(HAP-TAB2)能够与目标物凝血酶形成MNP-TAB1-凝血酶-HAP-TAB2的三明治结构。

在本发明优选的实施方案中，凝血酶适体链的序列如下：TBA1(适体链1)TTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGG，如SEQ ID NO：1所示。

TBA2(适体链2)TTTTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT，如SEQ ID NO：2所示。

适体是指通过体外选择过程从随机核酸文库中分离的单链DNA或RNA寡链核苷酸。能够特异性识别目标物质。凝血酶的适体：当凝血酶存在的时候能够特异性识别凝血酶。凝血酶的适体链具有特定的序列，以上两条序列就是从上述所说的随机从核酸文库中分离的，但并不仅仅限于以上两条序列。

在本发明优选的实施方案中，本发明还提供一种用于检测凝血酶浓度的检测探针的制备方法，包括以下步骤：

磁性微球(MNP)与凝血酶适体(TAB1)反应得到修饰有凝血酶适体的磁性微球(MNP-TAB1)；

羟基磷灰石(HAP)与凝血酶适体(TAB2)反应得到修饰有凝血酶适体的羟基磷灰石(HAP-TAB2)。

MNP-TBA1与HAP-TBA2在目标物凝血酶存在的情况下得到三明治结构：将MNP-TBA1，与不同浓度的目标物质凝血酶，HAP-TBA2混合，并在室温下反应2h，磁分离得到三明治结构。

优选的，MNP-TBA1制备步骤如下：清洗MNP，然后浸入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合液，磁分离后，将MNP浸入TBA1溶液中反应，然后磁分离，得到MNP-TBA1。

进一步优选的，MNP-TBA1制备具体步骤如下：用PBS缓冲液清洗MNP，然后浸入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合液40min，磁分离后，将MNP浸入TBA1溶液中水浴锅37℃下过夜(即8h～16h)，然后磁分离，得到MNP-TBA1，置于4℃下贮存待用。

优选的，HAP-TBA2制备步骤如下：HAP浸入聚醚酰亚胺(PEI)溶液中一定时间，离心清洗后，浸入戊二醛溶液中一定时间，离心清洗后，浸入TBA2的溶液中进行反应，得到HAP-TBA2。

进一步优选的，HAP-TBA2制备具体步骤如下：HAP浸入1w/w％的PEI溶液中1h，离心清洗后，浸入0.25w/w％的戊二醛溶液中30min，离心清洗后，浸入TBA2的溶液中反应1h，得到HAP-TBA2，置于4℃下贮存待用。

在本发明优选的实施方案中，还提供一种基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器，所述电化学适体传感器包括上述用于检测凝血酶浓度的检测探针和与所述探针相配合使用的检测电极，该检测电极为通过电沉积方法得到的还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极(edGO/GCE)；其中，三明治结构中的HAP与钼酸盐(优选钼酸钠)溶液在edGO/GCE表面生成磷钼酸盐沉淀，该复合体即为基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器。

优选的，所述检测电极是通过以下方法制备得到的：

(1)将氧化石墨烯完全浸入到PBS缓冲溶液中，超声得到分散良好的氧化石墨烯胶体溶液；

(2)将玻碳电极抛光成镜面，经乙醇和二次水超声清洗，干燥得到处理后的玻碳电极；

(3)将处理后的玻碳电极浸入氧化石墨烯胶体溶液中，通过电沉积方法得到还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极(edGO/GCE)。

步骤(1)中，所述石墨烯与PBS缓冲溶液的添加量比例为5mg：(5～10)ml；超声时间为5～10min。

步骤(2)中，将玻碳电极按顺序在麂皮上用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉打磨；超声时间为20～60s；干燥为在氮气吹干。

步骤(3)中，电沉积电位为-1.5V-0.5V，扫速为25mV/s，扫描圈数为20圈。

优选的，在修饰有还原氧化石墨烯的玻碳电极(edGO/GCE)表面滴涂含有三明治结构的混合液和钼酸盐溶液，反应一定时间(优选1h)，清洗玻碳电极表面后即得到基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器。

在本发明优选的实施方案中，还提供一种用于检测凝血酶浓度的检测探针在制备基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器中的应用。

在本发明优选的实施方案中，还提供一种基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器在检测凝血酶中的应用。

其中，检测步骤为：

(1)将含有不同浓度凝血酶的上述电化学适体传感器在H₂SO₄溶液作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构成三电极系统，用伏安法检测，得到不同浓度凝血酶检测标准电极的伏安曲线，将不同浓度凝血酶的伏安曲线的峰电流对其浓度的对数做线性回归方程；

(2)将待测凝血酶样品的上述电化学适体传感器在H₂SO₄溶液作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构成三电极系统，用伏安法检测，得到该待测凝血酶样品的伏安曲线，将该待测凝血酶样品的伏安曲线的峰电流带入步骤(1)中的线性回归方程即可得到待测凝血酶样品的浓度。

伏安法包括循环伏安法(CV)或方波伏安法。

优选的，伏安法检测的电位范围为0V～0.5V，扫速为100mV/s，室温下进行。

综上，本发明设计了一种基于信号放大策略的均相电化学适应传感器，以敏感地测量凝血酶的活性。使用以Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂为基础的天然矿物形式的磷灰石羟基磷灰石(HAP)纳米颗粒作为信号探针，结合凝血酶的适体。由于其与金属纳米颗粒相比具有低成本，易于合成，易于用生物分子功能化以及生物相容性好的优点，HAP纳米颗粒已广泛应用于药物递送，分子成像，组织工程，生物传感等不同领域。在这项工作中，由羟基磷灰石(HAP)产生的磷酸盐离子可与钼酸盐反应，在电极表面形成氧化还原钼磷酸盐沉淀，将目标物浓度转化为电流，达到定量检测目标物质凝血酶的目的。另外，与石墨烯电化学合成的以往策略相比，比如通过两个步骤进行，首先通过氧化石墨烯胶体溶液涂覆电极，然后进行电化学还原。在这项工作中，实现了氧化石墨烯通过电沉积直接还原，比以前的方法更简单，更快速。在这个专利中，我们发明了一种新颖的基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器，该电化学适体传感器具有以下优点：快速的电流响应，低的检出限和宽的线性范围。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

(1)将5mg氧化石墨烯完全浸入到5mlPBS缓冲溶液中，超声得到分散良好的氧化石墨烯胶体溶液。

(2)将玻碳电极按顺序在麂皮上用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉打磨，然后用乙醇和二次水超声洗净，超声时间为20～40s，在室温下晾干。

(3)将处理后的玻碳电极浸入氧化石墨烯胶体溶液中，通过电沉积得到还原氧化石墨烯修饰电极(edGO/GCE)，电沉积电位为-1.5V-0.5V，扫速为25mV/s，扫描圈数为20圈。

(4)用PBS缓冲液清洗MNP，然后浸入EDC与NHS混合液40min，磁分离后，将MNP浸入TBA1溶液中水浴锅37℃下过夜，然后磁分离，得到MNP-TBA1，置于4℃下贮存待用。

(5)HAP浸入1％的PEI溶液中1h，离心清洗后，浸入0.25％的戊二醛溶液中30min，离心清洗后，进入TBA2的溶液中反应1h,得到HAP-TBA2，置于4℃下贮存待用。

(6)将MNP-TBA1，与不同浓度的目标物质凝血酶，HAP-TBA2混合，并在室温下反应2h，磁分离得到三明治结构。

(7)在修饰有还原氧化石墨烯的电极表面滴涂含有三明治结构的混合液和钼酸钠溶液，反应时间为1h，清洗电极表面，即为检测凝血酶的传感器。

其中，本实施例中的TBA1如SEQ ID NO：1所示，TBA2如SEQ ID NO：2所示，但并不仅仅限于以上序列。

实施例2

(1)将5mg氧化石墨烯完全进入到10mlPBS缓冲溶液中，超声得到分散良好的氧化石墨烯胶体溶液。

(2)将玻碳电极按顺序在麂皮上用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉打磨，然后用乙醇和二次水超声洗净，超声时间为40～60s，在室温下晾干。

(3)将处理后的玻碳电极浸入氧化石墨烯胶体溶液中，通过电沉积得到还原氧化石墨烯修饰电极(edGO/GCE)，电沉积电位为-1.5V-0.5V，扫速为25mV/s,扫描圈数为20圈。

(4)用PBS缓冲液清洗MNP，然后浸入EDC与NHS混合液40min，磁分离后，将MNP浸入TBA1溶液中水浴锅37℃下过夜，然后磁分离，得到MNP-TBA1，置于4℃下贮存待用。

(5)HAP浸入1％的PEI溶液中1h，离心清洗后，浸入0.25％的戊二醛溶液中30min，离心清洗后，进入TBA2的溶液中反应1h,得到HAP-TBA2，置于4℃下贮存待用。

(6)将MNP-TBA1，与不同浓度的目标物质凝血酶，HAP-TBA2混合，并在室温下反应2h，磁分离得到三明治结构。

(7)在修饰有还原氧化石墨烯的电极表面滴涂含有三明治结构的混合液和钼酸钠溶液，反应时间为1h，清洗电极表面，即为检测凝血酶的传感器。

其中，本实施例中的TBA1如SEQ ID NO：1所示，TBA2如SEQ ID NO：2所示，但并不仅仅限于以上序列。

实施例1-2中制备的超灵敏均相电化学适体传感器在检测凝血酶中的应用，步骤如下：将上述传感器作为工作电极浸没到0.50M H₂SO₄溶液中，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构成三电极系统，进行循环伏安法(CV)检测。CV检测的电位范围为0.0V～0.5V，扫速为20～100mV/s，在室温下进行。

将上述传感器浸没到0.5M H₂SO₄溶液中作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构成三电极系统，用方波伏安法进行检测。检测电位为0V～0.5V，在室温下进行。

对凝血酶的检测结果显示，其峰电流与凝血酶的浓度成线性关系，线性回归方程为i＝0.0542lgc+0.9701(R＝0.9961)，对凝血酶的检测检出限低至1.3aM(1aM＝10^-18M)，性能灵敏，快速，有效。

上述实施例为本发明较佳的是实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变你、修饰、替代、组合简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛大学

<120> 一种基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感

器

<130> 2017

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