用于预测肝癌患者预后的系统

摘要

本发明公开了一种用于预测肝癌患者预后的系统，包括检测c‑Met、Caspase 8、CXCR4和P‑P21四种蛋白质表达量的系统和蛋白质表达量数据处理系统。检测上述四种蛋白质表达量的系统通过免疫组织化学染色方法测定蛋白质的表达量；蛋白质表达量数据处理系统将来自待预测肝癌患者的癌旁组织中所述四种蛋白质表达量转换为预后分值，根据预后分值预测待肝癌患者的预后。本发明具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及用于预测肝癌患者预后的系统。

背景技术

肝癌是全球第五大常见癌症，癌症相关死亡率仅次于肺癌、胃癌，排在第三位。 世界卫生组织2011年公布的数据表明全世界每年大约有70万人死于肝癌。肝癌的发 病率在全球呈上升趋势，西方国家肝癌的发病率低于发展中国家，但上升趋势也很明 显(美国10年来肝癌发病率增长了一倍)，因此近年来在西方国家肝癌的研究也受到 了极大的重视。综上，肝癌是严重地威胁我国人民健康和生命安全，并制约社会经济 发展的重大疾病。

肝癌与其它恶性肿瘤一样，是一种多因素参与、多步骤发展的全身性、系统性疾病。肝癌的临床治疗也伴随着对肿瘤生物学本质认识的加深，从单一的外科治疗模式 发展为结合手术切除、肝移植、介入治疗、酒精消融、射频消融以及Sorafenib靶向 药使用等多种治疗手段的综合治疗模式。肝癌的预后得到了一定的改善：早期发现后 进行手术切除的患者5年生存率可以提高到40-70％。

制约肝癌患者疗效的一个重要因素是复发和转移。能够准确预判肝癌复发和/或转 移，对不同患者制定最佳的个体化治疗方案，有计划、合理的选择或者联合应用各种 肝癌治疗手段以及支持对症治疗等多种策略，发挥各种方法的优势，避免不恰当或过 度治疗，最大幅度地控制肿瘤，提高总体疗效，改善患者的生活质量，延长生存期， 是肝癌治疗的重要发展方向。但是，由于肝癌具有极大的复杂性和异质性，基于现有 临床分期系统、病理分级并不能准确的预判病人的预后、治疗反应性等，具有相同分 期、相同病理学类型的肝癌常表现为不同的临床特征、治疗反应性和预后。其中肝癌 的临床分期系统已有10余种之多，如TNM分期、Izumi肿瘤转移改进分期、CLIP系统 分期、CUPI预后指数系统分期、BCLC分期等。总之，依据传统标志物、肿瘤大小、组 织病理学分级以及临床分期等指标判断患者预后进而后续指导肝癌治疗有极大局限 性，寻找稳定高效的预后判断标志物是当前肝癌研究的重要任务。临床亟需能够有效 判断肝癌手术切除后复发、转移以及生存期长短的标志物，亟需对肝癌的生物学行为 和本质进行全面系统分析，发展新的分型标准和疗效预后评价策略。目前，肿瘤研究 报道了大量的肿瘤标志物，各种各样的肝癌标志物也层出不穷，但真正能够有效用于 临床的寥寥。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何对肝癌手术后患者的早期复发和生存时间进行 预后预测。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于预测肝癌患者预后的系统，包括检测c-Met、Caspase 8、CXCR4和P-P21这四种蛋白质表达量的系统。

上述用于预测肝癌患者预后的系统中，所述“检测c-Met、Caspase 8、CXCR4和 P-P21这四种蛋白质表达量”可为检测肝癌患者癌旁组织中c-Met、Caspase 8、CXCR4 和P-P21这四种蛋白质表达量。

上述用于预测肝癌患者预后的系统中，所述检测c-Met、Caspase 8、CXCR4和P-P21这四种蛋白质表达量的系统可包括通过免疫组织化学染色方法测定所述四种蛋白质的 表达量所需的试剂和/或仪器。

上述用于预测肝癌患者预后的系统中，所述用于预测肝癌患者预后的系统包括蛋白质表达量数据处理系统，所述蛋白质表达量数据处理系统用于将来自待预测肝癌患 者的癌旁组织中所述四种蛋白质表达量转换为所述待预测肝癌患者的预后分值，根据 所述待预测肝癌患者的预后分值预测所述待预测肝癌患者的预后。

上述用于预测肝癌患者预后的系统中，所述蛋白质表达量数据处理系统内设模块1-a和模块1-b，所述模块1-a用于将来自待预测肝癌患者的癌旁组织中所述四种蛋白 质表达量转换为所述待预测肝癌患者的预后分值，所述模块1-b用于根据所述待预测 肝癌患者的预后分值预测所述待预测肝癌患者的预后。

所述检测c-Met、Caspase 8、CXCR4和P-P21这四种蛋白质表达量的系统在制备 预测肝癌患者预后的系统中的应用也属于本发明的保护范围。

所述检测c-Met、Caspase 8、CXCR4和P-P21这四种蛋白质表达量的系统和蛋白 质表达量数据处理系统在制备预测肝癌患者预后的系统中的应用也属于本发明的保护 范围；所述蛋白质表达量数据处理系统为上述任一所述蛋白质表达量数据处理系统。

上述应用中，所述检测c-Met、Caspase 8、CXCR4和P-P21这四种蛋白质表达量 的系统可包括通过免疫组织化学染色方法测定所述四种蛋白质的表达量所需的试剂和 /或仪器。

上述应用中，所述“检测c-Met、Caspase 8、CXCR4和P-P21这四种蛋白质表达 量”可为检测肝癌患者癌旁组织中c-Met、Caspase 8、CXCR4和P-P21这四种蛋白质 表达量。

上述用于预测肝癌患者预后的系统中，所述四种蛋白质均来自于人(Homosapiens)。

上述用于预测肝癌患者预后的系统中，所述肝癌患者为经手术切除肝癌组织的肝癌患者。

上述用于预测肝癌患者预后的系统中，检测上述四种蛋白质的表达量的系统具体可为免疫组织化学染色方法测定上述四种蛋白质的表达量所需的试剂和/或仪器，如 c-Met的单克隆抗体或多克隆抗体、Caspase 8的单克隆抗体或多克隆抗体、CXCR4的 单克隆抗体或多克隆抗体和P-P21的单克隆抗体或多克隆抗体。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种预测肝癌患者预后的方法。

本发明所提供的预测肝癌患者预后的方法，包括：C、检测来自待预测肝癌患者 的癌旁组织样本的c-Met、Caspase 8、CXCR4和P-P21这四种蛋白质表达量；D、将所 述四种蛋白质表达量转换为所述待预测肝癌患者的预后分值，根据所述待预测肝癌患 者的预后分值预测所述待预测肝癌患者的预后。

上述方法中，所述四种蛋白质表达量可根据免疫组织化学染色方法获得。

上述方法中，所述癌旁组织样本可为来自所述待预测肝癌患者的癌旁组织经过福尔马林固定石蜡包埋制备的样本或来自所述待预测肝癌患者的癌旁组织的冰冻切片。

上述方法中，所述四种蛋白质表达量转换为所述待预测肝癌患者的预后分值的方法可包括将所述四种蛋白质表达量转化为蛋白质表达量向量，将所述蛋白质表达量向 量代入公式1得到f(v)，将f(v)代入公式2，得到所述待预测肝癌患者的预后分值；

所述公式1为：

所述公式1中，v是蛋白质表达量向量，简称向量，sv_coef(i)是支持向量的系数，SV(i)是支持向量；

所述公式2为：

所述公式2中，prob(v)为待预测肝癌患者的预后分值。

所述蛋白质表达量向量以v表示，v＝(x_c-Met,x_{Caspase>,xCXCR4，xP-P21)。}

上述方法中，根据所述待预测肝癌患者的预后分值预测所述待预测肝癌患者的预后可为通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)确定诊断阈值，比较所述待预测肝癌患 者的预后分值和所述诊断阈值的大小，如果所述待预测肝癌患者的预后分值小于或等 于所述诊断阈值，所述待预测肝癌患者的预后不良，如果所述待预测肝癌患者的预后 分值大于所述诊断阈值，所述待预测肝癌患者的预后良好。

所述通过受试者工作特征曲线确定诊断阈值是根据具有统计学意义数量的癌旁组织中所述四种蛋白质表达量和相应的肝癌患者分组信息制作受试者工作特征曲线， ROC曲线上的最优值为阈值；所述分组信息是肝癌患者从手术切除时间开始复发的时 间，2年以上为一组，小于2年为一组；所述最优值是在特异性最大的基础上敏感性 尽可能地大。

为解决上述技术问题，本发明还提供了D1)和/或D2)中的应用：

D1)c-Met、Caspase 8、CXCR4和P-P21四种蛋白质作为标志物在预测肝癌患者 预后中的应用；

D2)c-Met、Caspase 8、CXCR4和P-P21四种蛋白质作为标志物在制备预测肝癌 患者预后的产品中的应用。

本发明还提供了一种产生肝癌相关蛋白质特征谱的方法，包括检测肝癌患者的癌旁组织样本中c-Met、Caspase 8、CXCR4和P-P21四种蛋白质表达量的步骤。

本申请中所述肝癌患者可为BCLC 0&A-C期肝癌患者。进一步，本申请中所述肝癌患者具体可为BCLC 0&A-A期肝癌患者。

本申请中所述预后不良可为从手术切除肝癌组织时开始，复发时间小于2年和/或生存时间小于5年；所述预后良好可为从手术切除肝癌组织时开始，复发时间2年 以上和/或生存时间5年以上。

本申请中所述待预测肝癌患者的癌旁组织可为距肝癌病灶边缘2cm的组织。

本申请中早期复发是指从手术切除肝癌组织时开始，患者两年内复发。

上述任一所述c-Met的Gene ID为4233。上述任一所述Caspase 8的Gene ID为841。上述任一所述CXCR4的Gene ID为7852。上述任一所述P-P21的Gene ID为841 1026。

本发明中，重庆西南医院提供的肝脏肿瘤组织样本及配对癌旁组织样本中，217名肝癌患者病例满足样本入选标准，将其作为肝癌样本群。在肝癌样本群随机选择三 分之二的样本(144例)作为肝癌训练组，另三分之一的样本(73例)作为肝癌测试 组。通过对肝癌训练组样本的组织微阵列进行免疫组化染色，分析了57个在肿瘤发生 发展过程中起关键作用的信号蛋白质的表达水平。通过随机森林算法和支持向量机算 法的结合，得到了肝癌相关蛋白质的特征谱并开发出分类模型，即4-蛋白质模型。然 后用肝癌测试组对P4-HCC(由四个蛋白质c-Met、Caspase 8、CXCR4和P-P21组成的 成套蛋白质)预后肝癌方法进一步进行验证。结果表明，P4-HCC为准确预测肝癌的蛋 白质特征谱。在肝癌测试组中，预后良好组患者早期复发率为43.8％(95％置信区间为 29.8％-58.7％)，而预后不良组患者早期复发率为88.0％(95％置信区间为67.7％-96.8％)， 预后不良组和预后良好组间风险比为2.869(95％置信区间为1.553-3.384)。

Cox回归分析表明，肝癌相关蛋白质的特征谱可作为独立的预后因子。

结果还表明，本发明所提供的P4-HCC预后肝癌方法可准确预测肝癌的临床预后情况，显著提高了肝癌患者的预后预测水平；P4-HCC预后肝癌方法还对BCLC临床分期 早期和极早期(0，A)的肝癌患者进一步区分预后好坏，对患者治疗措施的选择具有重 要的指导意义。

附图说明

图1为P4-HCC预后肝癌方法的确立和效能验证；

其中A为肝癌训练组的ROC曲线；B为肝癌测试组的ROC曲线；C为肝癌训练组的 早期复发率；D为肝癌测试组的早期复发率；E为肝癌训练组的预后分值分布、预后预 测结果、肝癌特征谱及患者实际早期复发状态总图；F为肝癌测试组的预后分值分布、 预后预测结果、肝癌特征谱及患者实际早期复发状态总图；G为肝癌训练组的生存预 后；H为肝癌测试组的生存预后。

图2为P4-HCC预后肝癌方法对临床BCLC分级的肝癌患者的预后；

其中A为BCLC 0&A期肝癌患者的预后；B为BCLC A期肝癌患者的预后；C为BCLC B期肝癌患者的预后；D为BCLC C期肝癌患者的预后。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的名词解释：

预后不良：从手术切除肝癌组织时开始，复发时间小于2年和/或生存时间小于5年。

预后良好：从手术切除肝癌组织时开始，复发时间2年以上和/或生存时间5年以上。

总体生存率：一个群体特定时间点时的存活率。

早期复发：从手术切除肝癌组织时开始，复发时间小于2年。

癌旁组织：距肝癌病灶边缘2cm的组织。

受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，简称ROC 曲线)：是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以灵敏度(真阳性 率)为纵坐标，1-特异性(真阴性率)为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下面积是重 要的试验准确度指标，ROC曲线下面积越大，试验的诊断价值越大。

灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵 敏度越大越好，理想灵敏度为100％。

1-特异性(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率， 特异性越大越好，理想特异度为100％。

实施例1、肝癌相关蛋白质特征谱的发现、组合分子标志物模型、肝癌预后判断、P4-HCC预后肝癌方法及有效性的验证

1、肝癌相关蛋白质特征谱的发现

1.1、病例及样品

经福尔马林固定和石蜡包埋的人肝脏肿瘤组织及配对癌旁组织样本，由重庆西南医院病理科提供。肝脏肿瘤组织及配对癌旁组织的提供者(即患者)在2005年到2008 年期间重庆西南医院接受了肝癌外科手术。本发明不包括以下情况的病例：既往有恶 性肿瘤的病例、在手术前接受过肝癌栓塞化疗等其它手段治疗的病例、以及那些术后 30天内死亡的病例。提供肝脏肿瘤组织及配对癌旁组织的患者对本试验均知情同意。 根据世界卫生组织采用的组织病理学分类系统，所有病例经苏木精-伊红(H&E)染色 的病理切片，都再次进行集中审查，并确认肿瘤类型、组织学分级以及肿瘤转移程度。 临床及随访信息来自于医院的前瞻性病例数据库。

重庆西南医院提供的肝脏肿瘤组织样本及配对癌旁组织样本中，217名肝癌患者病例满足样本入选标准，将其作为肝癌样本群。在肝癌样本群随机选择三分之二的样 本(144例)作为肝癌训练组，另三分之一的样本(73例)作为肝癌测试组。

1.2、制备组织芯片

将肝癌训练组的石蜡包埋的肝脏肿瘤组织样本逐一做切片，H&E染色做形态学观察，将病变的典型位置标记出来作为穿刺点，然后用环钻装置穿刺肝脏肿瘤组织蜡块 (直径1毫米)得到肝脏肿瘤组织蜡芯，每个组织样本选取4个部位制作蜡芯。

将肝癌训练组的石蜡包埋的癌旁组织样本做切片，H&E染色标记出作为穿刺点，然后用环钻装置穿刺癌旁组织蜡块(直径1毫米)得到癌旁组织蜡芯，每个组织样本 选取4个部位制作蜡芯。

将上述肝脏肿瘤组织蜡芯和癌旁组织蜡芯一一配对，转移至受体蜡块的阵列中排列，得到组织芯片。

每个受体蜡块包含一张组织芯片，每张组织芯片包含40个肝癌病例。

1.3、免疫组化染色及化学评分

将上述1.2制备的组织芯片进行免疫组化染色，具体步骤为：A：烘片、脱蜡与洗片：将组织阵列蜡块连续切成4微米厚切片并固定在载玻片上，载玻片经过2小时60℃ 烘烤后，通过二甲苯、梯度乙醇和水依次进行有序浸泡、脱蜡，PBS(pH7.4)洗片3 次，每次3min；B：抗原恢复：将切片95℃进行抗原修复15min；C：加入3％过氧化氢 室温处理30min阻断内源性过氧化物酶活性；D：加入10％正常山羊血清封闭非特异蛋 白质，切片在4℃与57种抗体孵育过夜；E：按照ABC试剂盒(Vector Laboratories 公司产品)步骤进行增强处理、加入二抗以及DAB显色；F：苏木精染色，切片冲洗干 净并封片。免疫组化分析时使用的部分抗体为：抗c-Met的抗体(兔源单抗、出售公 司Epitomics，Cat.#1996-1)、抗Caspase 8的抗体(兔源单抗、出售公司Epitomics， Cat.#3614-1)、抗CXCR4的抗体(兔源单抗、出售公司Epitomics，Cat.#3108-1) 和抗P-P21的抗体(兔源单抗、出售公司Epitomics，Cat.#2674-1)。

免疫组化染色评价采用改良型免疫组织化学评分(组织病理染色评分)系统进行。该系统通过对病理切片的染色强度以及阳性细胞的百分比定量赋分后进行评估，其中 依据染色强度可定义为0分、1分、2分、3分，分别对应于染色阴性、染色弱阳、染 色中阳及染色强阳；同时，统计每个强度阳性细胞的百分比。所有的免疫组化染色切 片均经3位专业的病理学家平行评估，且事先不了解患者的临床信息。若3位病理学 家对切片的解读有分歧，3位病理学家将一起对该切片重新评估，直到达成共识。化 学评分计算公式为：每种蛋白质的表达分值＝1×弱阳性百分率+2×中阳性百分率+3×强 阳性百分率。

1.4、蛋白质表达谱的数据处理

蛋白质特征谱的数据处理：根据上述1.3的方法逐一评估每个蛋白质的表达分值，将表达分值首先归一化处理，缺失值被所有肿瘤中该蛋白质表达的中间值替代，然后 计算出每个蛋白质的分值和肝癌训练组的该蛋白质平均值的表达比，之后表达水平以 表达比的log₁₀(表达比)量化。为了避免对数中0的出现，所有分数都加上0.01。

1.5、肝癌相关蛋白质的特征谱

将肝癌训练组应用随机森林算法得到各个蛋白质的重要性指标。使用袋外数据[out-of-bag(OOB)]误差最小化准则，依次消减最不重要的蛋白质，较小OOB误差的 若干蛋白质即作为肝癌相关蛋白质的特征谱。上述过程是通过在随机森林软件包上使 用RvarSelRF包程序实现的。

支持向量机(SVM)是用来开发带特征谱的训练组的分类模型。选择径向基函数(RBF)内核进行SVM训练，因为当类特征谱与属性之间非线性时，通过非线性映射样 品到高维空间，内核可以处理这些情况。RBF内核的两个参数C和γ都可以使用网格 搜索策略进行调谐。分类模型经SVM的最优C和γ训练而成。在训练阶段，SVM的性 能通过5倍交叉验证精度进行评估。

1.6、统计分析

由于患者的死因难以完全准确定义，使用特定的生存点作为生存终点可能带来潜在偏离，因此以从手术切除肿瘤时间开始的总生存作为分析事件。用Kaplan-Meier 分析患者总体生存率。用双侧对数秩(two-sided log-rank)检验分析预后良好患者 的生存时间和预后不良患者的生存时间。用Kaplan-Meier分析患者的早期复发率。用 双侧对数秩(two-sided log-rank)检验分析预后良好患者的早期复发率和预后不良 患者的早期复发率。

相关的变量，包括肝癌相关蛋白质的特征谱确定、患者年龄、吸烟指数、组织学 类型、肿瘤大小和疾病阶段等，都通过单变量和多变量Cox比例风险分析的结果进行 比较。Wald似然比(Wald likelihood ratio)检验应用于检验单变量和多变量分析， 以评估是否具有统计学意义。所有的统计测试，以预设的双侧α小于0.05视为有统计 学意义。上述分析都是在R编程语言(3.0.2版本)下完成。

根据上述1.1-1.6的方法，本发明以肝癌训练组为样本，通过检测与肿瘤发生发展密切相关的57个信号蛋白质的表达水平发现肝癌相关蛋白质的特征谱。肝癌相关蛋 白质的特征谱包括四种蛋白质，四种蛋白质的名称分别为c-Met、Caspase 8、CXCR4和 P-P21。肝癌相关蛋白质的特征谱以下简称肝癌特征谱。将这四种蛋白质c-Met、 Caspase 8、CXCR4和P-P21组成的成套蛋白质命名为P4-HCC。

2、组合分子标志物模型和肝癌预后判断

2.1、组合分子标志物模型

将发现的肝癌特征谱采用支持向量机算法开发分类模型，该模型全称为组合分子标志物模型，简称为4-蛋白质模型。再对每个患者的预后评分进行计算，预后分值代 表了4-蛋白质模型中每个蛋白质的综合信息。

上述4-蛋白质模型可以十分简单明确的应用于临床。4-蛋白质模型的使用方法为：⑴对于每个肝癌患者使用免疫组化的方法检测4个标志物蛋白质的表达分值；⑵4 个蛋白质分子的表达水平采用下列公式进行归一化：

f_s(x)＝-1+2·(x-lower)/(upper-lower)；

公式中x是质控标准化后蛋白质分子的表达水平。

⑶得到4个蛋白质分子归一化的表达量后，每个患者可以表示为由该4个蛋白质分子组成的蛋白质分子向量v：v＝(x_c-Met,x_{Caspase>,xCXCR4,xP-P21)。}

⑷将患者蛋白质分子向量v代入下列公式计算f(v)：

其中，sv_coef(i)是支持向量的系数，SV(i)是支持向量。

⑸将f(v)代入下列公式计算该患者的预后分值：

2.2、肝癌预后判断

阈值的获得：肝癌特征谱的性能由receiver-operating characteristic(ROC)分析进行评估。根据肝癌训练组每个患者的癌旁组织中P4-HCC的表达分值和相应的 肝癌患者分组信息(分组信息是指患者从手术切除时间开始复发的时间，2年以上为 一组，小于2年为一组；见表1)用SPSS 16.0软件进行ROC曲线分析。肝癌训练组 肝癌特征谱ROC曲线下的面积(AUC)是0.811，表明在肝癌训练组中该肝癌特征谱可 以准确的对预后进行预测(图1中A)。ROC曲线上的最优值即为阈值，综合考虑敏感 性和特异性，是指在特异性最大的基础上灵敏度尽可能地大。基于这个方法，肝癌训 练组ROC曲线的最优值为0.318，即阈值为0.318。在肝癌训练组的这一节点上，肝癌 特征谱显示出0.820的灵敏度和0.287的1-特异性，88.1％的阳性预测值和患者2年 内复发的总体精度为75％。

表1.肝癌训练组肝癌相关蛋白质的表达分值和分组信息

注：“NA”表示无法得到数值。

将步骤2.1得到的预后分值和阈值经比较分析后，得到预后良好或预后不良。比较分析结果判定标准如下：如果所述待测肝癌患者的预后分值小于或等于阈值(即预 后分值为0.318以下)，则判定该肝癌患者预后不良；若预后分值大于阈值(即预后 分值大于0.318)，则判定该肝癌患者预后良好。

3、P4-HCC预后肝癌方法

a、以待测肝癌患者的癌旁组织为检测样本，按照上述步骤1中所述方法进行免疫组化染色和化学评分，得到P4-HCC的表达分值；

b、按照步骤2.1的方法，得到预后分值；

c、将上述步骤b得到的预后分值按照步骤2.2的方法，得到预后良好或预后不良。

Kaplan-Meier生存分析显示在肝癌训练组中预后良好组早期复发率为39.7％(95％ 置信区间为28.3％-52.3％)，而预后不良组早期复发率为88.1％(95％置信区间为78.2％-94.1％)(P<0.0001，图1中C)。

Kaplan-Meier生存分析显示在肝癌训练组中预后良好组总体5年生存率为55.0％(95％置信区间为41.7％-67.7％)，而预后不良组总体5年生存率为19.1％(95％置信 区间为10.1％-30.8％)(P<0.0001，图1中G)。

将肝癌训练组的早期复发预后分值分布、预后预测结果、肝癌特征谱及患者实际早期复发状态进行总结，实验结果见图1中E。结果表明，肝癌特征谱可以预测患者 的预后情况。

4、P4-HCC预后肝癌方法有效性的验证

以肝癌测试组为样本，对步骤3中P4-HCC预后肝癌方法的有效性进行验证。

肝癌测试组肝癌特征谱ROC曲线下的面积(AUC)是0.712(图1中B)。

Kaplan-Meier生存分析显示在肝癌测试组中预后良好组早期复发率为43.8％(95％ 置信区间为29.8％-58.7％)，而预后不良组患者早期复发率为88.0％(95％置信区间为 67.7％-96.8％)P<0.0001，图1中D)。

Kaplan-Meier生存分析显示在肝癌测试组中预后良好组总体生存率为43.8％(95％ 置信区间为29.8％-58.7％)，而预后不良组总体生存率为12.0％(95％置信区间为3.2％-32.3％)(P＝0.0008，图1中H)。

将肝癌训练组的预后分值分布、预后预测结果、肝癌特征谱以及患者实际早期复发状态进行总结，实验结果见图1中F。结果表明，肝癌特征谱可以预测患者的预后 情况。

为了进一步分析肝癌特征谱能否作为一个独立的预后因子，用单变量和多变量Cox回归分析对模型和现有临床风险因子(包括性别、年龄、肿瘤大小、甲胎蛋白含 量、病理分级、门静脉浸润和BCLC临床分期等)的预后价值进行比较。实验结果见表 2和表3。单变量分析结果显示，虽然肝癌特征谱和BCLC临床分期区分患者的预后均 具有显著的统计学差异，但对早期复发率和总体生存率预测来说，肝癌特征谱是一个 相对更好的预后因子；多变量回归分析显示，在消除了BCLC分期、年龄、肿瘤大小等 因素后，肝癌特征谱仍可作为一个独立的预后因子。

表2.肝癌模型在肝癌训练组中的Cox比例风险分析

注：*预后不良组与预后良好组比较；⁺作为连续变量

表3.肝癌模型在肝癌测试组中的Cox比例风险分析

注：^*预后不良组与预后良好组比较；⁺作为连续变量

实施例2、P4-HCC预后肝癌方法对BCLC分级的肝癌患者的进一步预后

对BCLC分级的肝癌患者的进一步预后的方法为：对经BCLC分级的任何级别的肝癌患者(如0&A期肝癌的患者)，按照实施例1的方法获得P4-HCC的表达分值，然后 将该表达分值按照实施例1步骤2.1的方法，得到预后分值；将各预后分值按照实施 例1步骤2.2的方法，判定该肝癌患者预后良好或预后不良。

采用P4-HCC预后肝癌方法能将肝癌测试组中的每个患者在BCLC分级基础上进一步分成预后不良组或预后良好组(0&A期P<0.0001；A期P＝0.0001；B期P＝0.2115； C期P＝0.4242)(图2)。结果表明，P4-HCC预后肝癌方法可在BCLC分级基础上， 对BCLC 0&A和BCLCA期分级的肝癌患者进一步预后。