一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法

摘要

本发明提供了一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，直接利用分离方法简单、来源丰富的人外周血单个核细胞(即PBMCs)，经过能符合临床药品生产质量管理规范(GMP)的简便诱导方法，在短期内将PBMCs诱导并扩增成为包含CD4+CD25+CD127dim和CD8+CD25+CD127dim两种调节性T细胞在内的复合型Treg。这种复合型Treg纯度高、兼具两种Treg的调节功能、具有抗原非特异性，有广泛应用于致病抗原不明确、难治性T细胞介导的自身免疫性疾病治疗的前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法。

背景技术

在很多自身免疫性疾病的发生发展过程中，T细胞针对自身抗原的异常激活发挥关键的作用。调节性T细胞对异常免疫应答具有强大的免疫调节作用，如能体外扩增足够数量的自体抗原非特异性调节性T细胞进行体内回输，将很可能抑制体内发生的异常免疫应答，从而使自身免疫性疾病得到控制。此外，自体调节性T细胞回输体内后不会发生针对异己的免疫性破坏，因而可能存活和发挥较长时间的作用。在器官移植的情况下，器官捐献者(供者)与接受移植者(受者)是遗传背景不同的个体，因此，不可避免会发生急、慢性免疫排斥反应，而这正是影响移植治疗效果最主要的原因。介导免疫排斥反应的主体是受者体内的效应性淋巴细胞，它们识别外来移植物抗原后活化、增殖并分泌大量效应分子，直接和/或间接地导致移植物损伤，目前，需要终身使用免疫抑制剂来控制效应细胞的功能，但是，长期服用免疫抑制剂会带来感染、恶性肿瘤、心血管疾病、肝肾毒性等毒副作用，而且还无法阻止慢性排斥所导致的移植物功能丧失。因此，人们正努力寻找新的控制排斥反应的方法，以替代这些化学药物。大量实验研究表明，人体内存在一类具有免疫负性调节功能的细胞，能有效抑制效应细胞的功能，其中最重要的是调节性T细胞(Treg)。获得足够数量Treg的方法主要分两类，一类是分离出天然存在于机体内的Treg，然后在体外扩增，由于天然Treg的数量极少，需要进行多个周期的增殖培养(每6～7天为一个周期)，然而在此过程中，Treg的调节能力容易丢失；另一类方法是分离出机体内大量存在的静息T细胞(naive T细胞)，然后在体外利用抗原呈递细胞诱导培养出Treg，其具有抗原特异性，只能抑制能与供者抗原起作用的效应细胞，从而避免广泛的免疫抑制，尽管该类方法有众多的诱导方案，但几乎都受到诱导条件的限制(如抗原呈递细胞不易获取、价格昂贵、操作复杂、不符合临床标准等)而仅适合于实验研究，不利于临床开展。

发明内容

基于调节性T细胞(即Treg)具有良好的抑制免疫应答作用，体外诱导扩增的Treg可能应用于治疗T细胞介导的自身免疫性疾病或应用到器官移植领域诱导同种抗原免疫耐受。与抗原特异性Treg相比，抗原非特异性Treg应用适应症可能更为广泛，但目前现有技术存在的最大问题是体外诱导调节性T细胞成本昂贵、耗时长、诱导效率较低、表型及调节作用不稳定等。本发明利用物极必反原理，采用文献从未报道过的全新方法，直接利用分离方法简单、来源丰富的人外周血单个核细胞(即PBMCs)，经过能符合临床药品生产质量管理规范(GMP)的简便诱导方法，在短期内将PBMCs诱导并扩增成为包含CD4⁺CD25⁺CD127^dim和CD8⁺CD25⁺CD127^dim两种调节性T细胞在内的复合型Treg。这种复合型Treg纯度高、兼具两种Treg的调节功能、具有抗原非特异性，因此有可能广泛应用于致病抗原不明确、难治性T细胞介导的自身免疫性疾病的治疗。

本发明提供了一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，步骤包括：

S1、从人外周血中分离出外周血单个核细胞PBMCs；

S2、将PBMCs重悬于含5～10％AB型人血清或自体血清的AMI-V CTS培养基，计数细胞总量，加入1～2倍细胞数量的抗CD3/CD28磁珠或抗CD3/CD28抗体、和终浓度为500～2000U/ml的rhIL-2，刺激培养6～7天诱导结束，培养过程中每68～76h补加一次rhIL-2；

S3、计数获得的活细胞量，取部分诱导后的T细胞进行表型和纯度的鉴定；

S4、将剩余诱导后的T细胞重悬于含5～10％人血清的AMI-V CTS培养基，加入终浓度为100～200U/ml的rhIL-2，培养22～26h以静息诱导后的T细胞；分选活细胞后，取部分细胞进行混合淋巴细胞培养，其余细胞用生理盐水重悬。

本发明的有益效果是：本发明的诱导来源细胞是外周血中含量丰富的PBMCs，其数量是nTreg的33～100倍，经过一个周期(6～7天)的诱导培养，即可获得足够治疗剂量的Treg，从而能及时输注体内，这对灵活应用于各种临床治疗方案非常有利。PBMCs包含有CD4⁺与CD8⁺两种T细胞，能同时诱导出CD4⁺CD25⁺CD127^dim>+CD25⁺CD127^dim>+Treg)，这种复合型Treg的调节功能更为强大和全面。由于不需要像传统扩增nTreg的方法那样需要多个周期(5～6个周期)的培养，本发明诱导的Treg表型和调节功能稳定，而且极大降低了由于长期体外培养可能出现的细胞活力减弱、微生物污染等事件的发生率。另外，本发明所用的PBMCs无需分选，成本较nTreg的获取大为降低，而且操作简单、稳定高效、重复性好、使用的所有试剂材料都能符合临床使用规范，质控方法特异快速，非常适合于临床应用。

附图说明

图1为直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞方法的流程图；

图2为实施例1中PBMCs诱导培养前后，细胞群中CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞的各种表型分子变化的流式细胞术分析结果；

图3为实施例1中PBMCs诱导培养前后，细胞群中的T淋巴细胞(CD3⁺细胞)与B淋巴细胞(CD19⁺细胞)、T淋巴细胞群中的CD4⁺亚群与CD8⁺亚群数量比例的改变；

图4为实施例1中PBMC经过诱导培养后，所得活性良好的Treg细胞数量增殖倍数的结果；

图5为实施例1MLR反应体系中，加入不同比例的诱导Treg，其抑制CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞增殖的流式细胞术分析结果；

图6为实施例1MLR反应体系中，加入不同比例的诱导Treg时，其抑制两种T细胞增殖的效率的统计结果；

图7为实施例2中PBMCs诱导培养前后，细胞群中CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞的各种表型分子变化的流式细胞术分析结果；

图8为实施例2中PBMCs诱导培养前后，细胞群中的T淋巴细胞(CD3⁺细胞)与B淋巴细胞(CD19⁺细胞)、T淋巴细胞群中的CD4⁺亚群与CD8⁺亚群数量比例的改变；

图9为实施例2中PBMC经过诱导培养后，所得活性良好的Treg细胞数量增殖倍数的结果；

图10为实施例2MLR反应体系中，加入不同比例的诱导Treg，其抑制CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞增殖的流式细胞术分析结果；

图11为实施例2MLR反应体系中，加入不同比例的诱导Treg时，其抑制两种T细胞增殖的效率的统计结果；

图12为实施例3中PBMCs诱导培养前后，细胞群中CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞的各种表型分子变化的流式细胞术分析结果；

图13为实施例3中PBMCs诱导培养前后，细胞群中的T淋巴细胞(CD3⁺细胞)与B淋巴细胞(CD19⁺细胞)、T淋巴细胞群中的CD4⁺亚群与CD8⁺亚群数量比例的改变；

图14为实施例3中PBMC经过诱导培养后，所得活性良好的Treg细胞数量增殖倍数的结果；

图15为实施例3MLR反应体系中，加入不同比例的诱导Treg，其抑制CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞增殖的流式细胞术分析结果；

图16为实施例3MLR反应体系中，加入不同比例的诱导Treg时，其抑制两种T细胞增殖的效率的统计结果。

具体实施方式

目前有文献报道的抗原非特异性Treg制备方法仅有一种，即抽取人外周血后，通过密度梯度离心法分离出PBMCs，利用磁珠分选试剂盒或流式细胞分选术，分选出单个核细胞中的天然调节性T细胞(即nTreg)，在体外，利用包被有抗CD3/CD28抗体的磁珠和大剂量rhIL-2扩增多个周期(每6～7天为一个周期)，以获得大量抗原非特异性Treg。

通过nTreg体外扩增抗原非特异性Treg的方法扩增周期长，Treg表型不易维持，调节作用不够强。由于健康人外周血nTreg的比例很低(占外周血单个核细胞的1～3％)，能分离得到的nTreg数量非常有限(每100ml健康人外周血仅能分选出1～4.5×10⁶个nTreg)，而临床治疗级的抗原非特异性Treg的输注量为1×10⁷个/kg。因此体外扩增得到能用于临床免疫治疗的、足够数量的、且能保持调节功能的Treg十分困难，而且成本昂贵。此外，自身免疫性疾病的患者往往存在nTreg的数量减少或功能异常，因而从患者的nTreg扩增得到的抗原非特异性Treg可能治疗效果不理想。

现有技术是在分离数量稀少的外周血nTreg的基础上体外扩增抗原非特异性Treg，而本发明是直接分离出外周血中含量十分丰富的PBMCs，直接进行体外诱导，使其中T细胞的比例从50％提高至约90％，并且实现T细胞表型从CD127^high到CD127^dim的转化，且数量还能得到一定倍数的增加。

本发明提供了一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，步骤包括：

S1、从人外周血中分离出外周血单个核细胞PBMCs；

S2、将PBMCs重悬于含5～10％AB型人血清或自体血清的AMI-V CTS培养基，计数细胞总量，加入1～2倍细胞数量的抗CD3/CD28磁珠或抗CD3/CD28抗体、和终浓度为500～2000U/ml的rhIL-2，刺激培养6～7天诱导结束，培养过程中每68～76h补加一次rhIL-2；

S3、计数获得的活细胞量，取部分诱导后的T细胞进行表型和纯度的鉴定；

S4、将剩余诱导后的T细胞重悬于含5～10％人血清的AMI-V CTS培养基，加入终浓度为100～200U/ml的rhIL-2，培养22～26h以静息诱导后的T细胞；分选活细胞后，取部分细胞进行混合淋巴细胞培养，其余细胞用生理盐水重悬。

优选的，步骤S4所述混合淋巴细胞培养为：以步骤S1所述PBMCs为反应细胞，以不同个体的灭活PBMCs为刺激细胞或者将抗CD3/CD28抗体作为刺激源提供T细胞激活的第一及第二信号，进行混合淋巴细胞培养，在混合淋巴细胞培养体系中加入步骤S4所述分选的活细胞共同培养3～6天，通过流式细胞术检测反应细胞的增殖水平，以确定Treg的免疫调节功能、调节效率和抗原特异性。该步骤是明确Treg功能效价的重要质控步骤，对预测体内输注治疗效果具有重要参考价值。

更加优选的，所述反应细胞与分选的活细胞添加量之比为1:1～1:0.125。

优选的，步骤S1所述分离出外周血单个核细胞PBMCs的方法为Ficoll分离法或采用血细胞分离机及配套管路采集PBMCs。

更加优选的，所述Ficoll分离法步骤包括：向人外周血中加入等体积生理盐水稀释并混匀后，利用人Ficoll淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞。

优选的，步骤S2所述刺激培养在37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中进行。

优选的，步骤S4所述表型和纯度的鉴定包括通过流式细胞术检测CD3、CD19、CD4、CD8、CD27、CD95、CD45RA、GITR、CD127、CD25、Foxp3、CTLA-4、CD62L、CXCR3分子的表达。该步骤是重要的质控步骤，用来检验诱导细胞的质与量能否满足输注治疗的需要。

优选的，步骤S4所述生理盐水含2％人血清白蛋白或自体血清。

下面将结合具体实施例对本发明提供的一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法予以进一步说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

实施例1

本实施例提供了一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，方法流程图如附图1所示，具体步骤包括：

1：征集自愿受试者，抽取10ml外周血，加入等体积生理盐水稀释并混匀后，利用人Ficoll淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心法分离得到1.25×10⁷个PBMCs，取3.00×10⁶个PBMCs重悬于4ml含5％自体血清的AMI-V>

2：诱导结束后，磁场去除抗CD3/CD28的磁珠，通过台盼蓝拒染法计数，获得的活细胞总量为4.2×10⁶个，细胞增殖1.4倍。取2×10⁶个诱导的Treg细胞进行表型和纯度的鉴定(检测分子同步骤1)，这是重要的Treg表型质控步骤，以CD127⁺细胞比例降至10％以下、同时CD25⁺细胞比例增加至80％以上作为Treg诱导成功的标准，检测结果如图2-4所示。结果显示，经过一个周期的诱导培养，细胞增殖了1.4倍，B细胞(即CD19⁺细胞)的比例显著下降至1.83％，CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞的相对比例无明显改变；两种T细胞的表型分子CD127、胞外CTLA-4的表达比例均明显下降，CD25、CD95与胞内CTLA-4的表达比例均明显升高，符合诱导型Treg的表型特征。将剩余细胞重悬于新鲜的AMI-V>

3：MLR：将冻存的自愿受试者的PBMCs复苏，作为反应细胞(其中包含CD4⁺与CD8⁺两种T细胞)，以抗CD3/CD28抗体作为刺激源，进行混合淋巴细胞培养试验，在MLR体系中加入不同比例的诱导所得Treg(1:1～1:0.125)，置于37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中，共同培养3天后，通过流式细胞术检测反应细胞的增殖水平，以确定Treg的免疫调节功能和调节效率。这是重要的检测诱导Treg功能的质控步骤，结果如图5-6所示。结果显示，在1:1、1:0.5、1:0.25、1:0.125四种比例组中，诱导的Treg均表现出免疫调节功能，当诱导Treg的比例降为0.5时，其抑制两种T细胞增殖的效率仍然大于60％，明显强于传统方法扩增的抗原非特异性Treg。

本实施例建立了一种全新的诱导人Treg的简单方法，即直接分离来源丰富的人外周血单个核细胞(即PBMCs)，在体外利用一种刺激因子和抗CD3/CD28磁珠的刺激，在6～7天内培养出包含CD4⁺CD25⁺CD127^dim和CD8⁺CD25⁺CD127^dim两种调节性T细胞在内的复合型Treg。该方法能使T细胞增殖1～2倍，其中80％以上具有Treg表型特征，而且抑制效应细胞反应的效价较高(与效应细胞的数量比例为1:2时，仍然能发挥50％-90％的抑制效率，显著高于由nTreg扩增培养出的细胞)。这种Treg是各种抗原特异性克隆的组合体，输注受者体内后，在存在供者抗原刺激的免疫微环境的影响下，其中供者抗原特异性克隆将会得到优势存活机会甚至扩增，从而逐步发挥特异性的免疫调节作用，这与免疫抑制药物的长期广泛抑制作用有着根本的不同，这也使得受者既可以输注自身的Treg，也可以在不宜抽血的情况下，接受健康人的Treg。这种诱导Treg的方法成本较低、操作简单、稳定高效、重复性好、使用的所有试剂材料都能符合临床使用规范，且PBMCs来源丰富，易于获得治疗量的Treg，目前国内外均未见相同的报道。该方法诱导的Treg不仅可以用于实体器官移植，而且能应用于骨髓移植、自身免疫性疾病的治疗，将具有良好的临床应用前景。

实施例2

本实施例提供了一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，步骤包括：

1：征集自愿受试者，抽取10ml外周血，分离得到2.1×10⁷个PBMCs，取3.0×10⁶个PBMCs重悬于4ml含5％自体血清的AMI-V>

2：诱导结束后，磁场去除抗CD3/CD28的磁珠，通过台盼蓝拒染法计数，获得的活细胞总量为3.2×10⁶个，细胞增殖1.07倍。取2×10⁶个诱导的Treg细胞进行表型和纯度的鉴定(检测分子同步骤1)，这是重要的Treg表型质控步骤，检测结果如图7-9所示。结果显示，经过一个周期的诱导培养，细胞增殖了1.07倍，B细胞(即CD19⁺细胞)的比例显著下降至3.95％，，CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞的相对比例无明显改变；两种T细胞的表型分子CD127、胞外CTLA-4的表达比例均明显下降，CD25、CD95与胞内CTLA-4的表达比例均明显升高，符合诱导型Treg的表型特征。将剩余细胞重悬于新鲜的AMI-V>

3：MLR：将冻存的自愿受试者的PBMC复苏，作为反应细胞(其中包含CD4⁺与CD8⁺两种T细胞)，以抗CD3/CD28抗体作为刺激源，进行混合淋巴细胞培养试验，在MLR体系中加入不同比例的诱导所得Treg(1:1～1:0.125)，置于37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中，共同培养3天后，通过流式细胞术检测反应细胞的增殖水平，以确定Treg的免疫调节功能和调节效率。这是重要的检测诱导Treg功能的质控步骤，结果如图10-11所示。结果显示，在1:1、1:0.5、1:0.25、1:0.125四种比例组中，诱导的Treg均表现出免疫调节功能，当诱导Treg的比例降为0.25时，其抑制两种T细胞增殖的效率仍然大于50％，明显强于传统方法扩增的抗原非特异性Treg。

实施例3

本实施例提供了一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，步骤包括：

1：征集自愿受试的系统性红斑狼疮患者，抽取20ml外周血，分离得到1.7×10⁷个PBMCs，取3.00×10⁶个PBMCs重悬于4ml含5％自体血清的AMI-V>

2：诱导结束后，磁场去除抗CD3/CD28的磁珠，通过台盼蓝拒染法计数，获得的活细胞总量为6.03×10⁶个，细胞增殖2.01倍。取2×10⁶个诱导的Treg细胞进行表型和纯度的鉴定(检测分子同步骤1)，这是重要的Treg表型质控步骤，检测结果如图12-14所示。结果显示，经过一个周期的诱导培养，细胞增殖了1.07倍，B细胞(即CD19⁺细胞)的比例显著下降至2.7％，，CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞的相对比例无明显改变；两种T细胞的表型分子CD127、胞外CTLA-4的表达比例均明显下降，CD25、foxp3与胞内CTLA-4的表达比例均明显升高，符合诱导型Treg的表型特征。将剩余细胞重悬于新鲜的AMI-V>

3：MLR：将冻存的病人的PBMCs复苏，作为反应细胞(其中包含CD4⁺与CD8⁺两种T细胞)，以抗CD3/CD28抗体作为刺激源，进行混合淋巴细胞培养试验，在MLR体系中加入不同比例的诱导所得Treg(1:1～1:0.125)，置于37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中，共同培养3天后，通过流式细胞术检测反应细胞的增殖水平，以确定Treg的免疫调节功能和调节效率。这是重要的检测诱导Treg功能的质控步骤，结果如图15-16所示。结果显示，在1:1、1:0.5、1:0.25、1:0.125四种比例组中，诱导的Treg均表现出免疫调节功能，当诱导Treg的比例降为0.5时，其抑制两种T细胞增殖的效率仍然大于43％，明显强于传统方法扩增的抗原非特异性Treg。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。