一种观察月季黑斑病侵染过程的石蜡切片染色方法

摘要

本发明涉及一种观察月季黑斑病侵染过程的石蜡切片染色方法，在切片脱蜡至水后，先用1％结晶紫水溶液进行染色，再利用碘液进行媒染，最后用95％酒精进行脱色。选择上述两种染液和脱色方法，可将组织细胞染为蓝色，将菌丝染色为红色，为观察黑斑病病程发展过程的观察的提供了方法。而且本发明的方法通过改进的染色方法，大大缩短了利用石蜡切片观察月季黑斑病侵染叶片进程的染色时间，提高了试验效率。

说明书

技术领域

本发明涉及植物显微技术领域，具体是一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法

背景技术

植物叶部真菌病害往往造成植物叶部病斑、黄化、早期落叶，严重者直接导致植物死亡，影响了植物正常生长发育，增加了栽培管理养护成本。

月季是四大切花之首，是蔷薇科蔷薇属多年生木本花卉，具有花期长、花色丰富、株型各异等优点。而月季黑斑病是一种庭院栽培中发生率极高且破坏性极强的真菌病害，常造成叶片表面着生黑斑、黄化、脱落等症状。该病害一般爆发于高温多雨季节，严重影响了观赏效果。该病害由蔷薇盘二孢(Marssonina rosae)引起，该真菌能够侵入寄主的叶片造成病害，该病原真菌在生活史后期能产生大量的分生孢子，扩张非常快。在月季的抗病研究中，为测验品种的抗病性等，经常将月季黑斑病作为研究对象。此外，在园林植物病原菌和寄主互作的领域，月季黑斑病的研究价值很高。尽管月季黑斑病在月季的病害研究中占有重要的地位，但有关该病害的组织病理学还不清楚，制约了月季黑斑病研究的开展。本发明为包括月季黑斑病在内的植物叶部病害组织病理学的研究直接提供了可靠方法，为解决病理学研究的关键内容提供了技术支持。

对于叶部真菌病害的组织病理学入侵过程的研究，传统的研究方法有很多，包括透明胶带粘贴、漂白观察和组织整体透明等方法。但这些方法在月季叶片真菌病害研究中有一定的局限性，在月季黑斑病研究过程中，通过传统方法只能获得一些寄主表面的病原菌结构，不能清晰地展现植物组织内部的真菌，并对其进行染色。本发明能够很好地弥补这些不足，在技术层面上解决科研难题。

发明内容

本发明的目的是解决常规切片技术制备的侵染叶片中植物细胞壁着蓝色、植物细胞核以及病原菌共同着红色，导致无法明确区分真菌与植物细胞核的问题，提供一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法。本发明的染色过程快捷方便、质量好，能够为相关科学研究提供技术支持。

本发明的方法为，在切片脱蜡至水后，先用1％结晶紫水溶液进行染色，再利用碘液进行媒染，最后用95％酒精进行脱色。

优选的，本发明的方法包括如下步骤：

1)切片脱蜡至水后，将切片置于1％的结晶紫水溶液中染色5～10min；

2)用蒸馏水冲去染色后的切片表面的结晶紫；

3)用碘液处理冲洗后的切片30～60s，进行媒染；

4)用95％酒精清洗媒染后的切片15～60s，进行脱色；

5)用无水乙醇脱水5～10s。

上述操作中，用蒸馏水冲去染色后切片表面的结晶紫，可避免结晶紫持续染色，实现适度染色，用95％的酒精清洗媒染后的切片，可脱去与植物组织结合的染液，实现真菌菌丝着红色，植物组织为蓝色的效果。

优选的，所述步骤2)中的具体操作为用蒸馏水快速冲洗载玻片两次，每次5s。

优选的，所述步骤3)中的媒染时间为30s。

在操作的过程中，本发明的方案在选择上述的两种优选条件后，可优化真菌菌丝着红色，植物组织为蓝色的染色效果。

优选的，所述步骤1)中将切片脱蜡至水后，将切片置于1％的结晶紫水溶液中染色5min；

优选的，所述步骤4)中用95％酒精快速清洗媒染后的切片60s，清洗2次。

在选择上述两种优选条件后，可进一步优化染色的效果。

优选的，所述1％的结晶紫水溶液由如下方法制备得到，将1g的结晶紫溶于100ml蒸馏水中，充分溶解后，于滤纸中进行过滤，即得。

优选的，所述碘液由如下方法制备得到，取碘和碘化钾各1g溶于100ml 80％酒精中，充分溶解，即得。

最优选的，本发明的方法包括如下步骤：

1)切片脱蜡至水后，将切片置于1％的新鲜配制的过滤后的结晶紫水溶液中染色5min；

2)用蒸馏水快速冲洗染色后的切片5s，冲洗2次；

3)用碘液处理冲洗后的切片60s，进行媒染；

4)用95％酒精快速清洗媒染后的切片5s，清洗2次；

5)用无水乙醇脱水5～10s。

采用上述最优的方案，形成的石蜡切片纹理轮廓清晰分明，且仅有真菌菌丝着红色，植物组织为蓝色，能明显辨别真菌状态。

本发明的另一目的是保护一种观察月季黑斑病侵染过程的石蜡切片的制备方法，其步骤为：将样品进行固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与展片、脱蜡、染色以及封片处理；

所述染色采用本申请所述的方法进行；

所述封片的操作为：

将脱水完毕后的切片在光学显微镜下用透明液进行透明，当观察到真菌和寄主组织显示清楚时，用二甲苯进行处理，进行封片。

优选的，所述透明液由丁子香油、无水乙醇和二甲苯按体积比50：25：25配制而成。

本发明的最后一个目的是保护采用本申请所述方法制备得到的石蜡切片。

本发明的方法具有如下有益效果：

(1)本发明利用优化的酒精脱色时间能够保证附着在植物组织上的多余的结晶紫染液脱色完成，并不影响对真菌的染色效果，实现了真菌侵染的叶片中病原菌的单一染色，为观察黑斑病病程发展过程的观察的提供了方法。

(2)大大缩短了利用石蜡切片观察月季黑斑病侵染叶片进程的时间，提高了试验效率。

附图说明

图1为本发明实施例1的石蜡切片图

图2为本发明实施例2的石蜡切片图

图3为本发明实施例3的石蜡切片图

图4为本发明实施例4的石蜡切片图

图5为本发明实施例5的石蜡切片图

图6为本发明实施例6的石蜡切片图

图7为对比例1的石蜡切片图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

实验方法：

1、制片所用样品及来源：样品为蔷薇盘二孢菌液人工喷施后12dpi的叶片病斑部位。来源：植物来源为由北京林业大学人工杂交后代，病原菌来源为利用组织分离法于国家花卉工程中心小汤山基地黑斑病发病植株上分离获得的单一菌株。

2、固定方法：用的酒精消毒的刀片或者手术刀，将接种的叶片切成长约10mm，宽约5mm左右的小块样品。固定于体积浓度为70％酒精配置的FAA固定液中，抽真空后固定24h，保存于4℃冰箱待用。FAA固定液由体积浓度为70％的酒精：冰醋酸：甲醛体积比为90:5:5配制而成。

3、脱水：将材料从FAA固定液中取出，滤纸吸干多余FAA固定液，放入带橡胶塞青霉素小瓶中，加入体积浓度为80％酒精中，真空抽气10分钟，静置10分钟；随后更换85％、90％、95％、100％、100％的酒精，每次更换后都进行相同的真空抽滤和静置过程。

4、透明：更换无水酒精为1/3体积比的二甲苯/酒精，静置30min后；更换2/3体积比的二甲苯/酒精，静置30min；更换纯二甲苯后，静置20min，此过程重复二次后，完成透明。

5、浸蜡：将透明后的样品置于提前于60℃烘箱中加热的液体石蜡与二甲苯以体积比1:1混匀后的1/2石蜡中，塞好瓶塞，放入45℃恒温箱中过夜；次日样品置于60℃烘箱中，打开瓶塞，待二甲苯完全挥发之后，换入已融化的溶点为56℃的石蜡，在60℃恒温箱中放置4h；然后再次换入相同的石蜡，如此重复3次；最后一次更换石蜡后，静置2h后即可进行包埋。

6、包埋：从恒温箱中取出盛有样品的玻璃小瓶，将存有样品的石蜡倒入盛有相同温度石蜡的包埋小盒中，并用经预热的镊子调整样品位置，按照切片方向放好，静置冷却。待表面凝固后放入水盆中，待完全凝固后，去除包埋盒，室温晾干，储藏备用。

7、切片与展片：将包埋盒固定在切片机上，调好切片厚度为8-10μm进行切片，用小拇指涂极少量明胶粘片剂在载玻片上，将载玻片放置在42士1℃展温台上，在玻片上加3-5滴蒸馏水，取盖玻片长度1/5-2/5的蜡带放在载玻片的水面上使之迅速平展，吸水纸吸去多余水分再置于展温台上,做好标记，放入42℃烘箱中烘烤天后才可进行下一步。

8、脱蜡：将要染色的片子分两次放入100％二甲苯中，每次30min，脱去石蜡。

9、复水：将完成脱蜡的片子依次1/2二甲苯+1/2酒精、100％酒精、95％二甲苯、90％二甲苯、80％二甲苯、70％二甲苯、50％二甲苯、水中，每环节3min。

10、染色封片：

将完成复水的片子置于经过滤的新鲜配制的1％结晶紫水溶液中染色5min；随后，用蒸馏水快速冲洗载玻片，每次5s，共两次；经碘液媒染30s后，取95％酒精进行脱色15s；随即取无水乙醇快速脱水。脱水后，于光学显微镜下，用透明液进行适当透明，当真菌和寄主组织显示清楚时，用二甲苯处理。随后用香脂进行封片，所述透明剂由丁子香油、无水乙醇和二甲苯按体积比50：25：25配制而成。

实施例2：

在实施例1的染色封片阶段，将完成复水的片子置于经过滤的新鲜配制的1％结晶紫水溶液中染色5min；随后，用蒸馏水快速冲洗载玻片，每次5s，共两次；经碘液媒染30s后，取95％酒精进行脱色30s；随即取无水乙醇快速脱水。脱水后，于光学显微镜下，用透明液进行适当透明，当真菌和寄主组织显示清楚时，用二甲苯处理。随后用香脂进行封片。

实施例3：

在实施例1的染色封片阶段，将完成复水的片子置于经过滤的新鲜配制的1％结晶紫水溶液中染色5min；随后，用蒸馏水快速冲洗载玻片，每次5s，共两次；经碘液媒染30s后，取95％酒精进行脱色60s；随即取无水乙醇快速脱水。脱水后，于光学显微镜下，用透明液进行适当透明，当真菌和寄主组织显示清楚时，用二甲苯处理。随后用香脂进行封片。

实施例4：

在实施例1的染色封片阶段，将完成复水的片子置于经过滤的新鲜配制的1％结晶紫水溶液中染色10min；随后，用蒸馏水快速冲洗载玻片，每次5s，共两次；经碘液媒染30s后，取95％酒精进行脱色15s；随即取无水乙醇快速脱水。脱水后，于光学显微镜下，用透明液进行适当透明，当真菌和寄主组织显示清楚时，用二甲苯处理。随后用香脂进行封片。

实施例5：

在实施例1的染色封片阶段，将完成复水的片子置于经过滤的新鲜配制的1％结晶紫水溶液中染色10min；随后，用蒸馏水快速冲洗载玻片，每次5s，共两次；经碘液媒染30s后，取95％酒精进行脱色30s；随即取无水乙醇快速脱水。脱水后，于光学显微镜下，用透明液进行适当透明，当真菌和寄主组织显示清楚时，用二甲苯处理。随后用香脂进行封片。

实施例6：

在实施例1的染色封片阶段，将完成复水的片子置于经过滤的新鲜配制的1％结晶紫水溶液中染色10min；随后，用蒸馏水快速冲洗载玻片，每次5s，共两次；经碘液媒染30s后，取95％酒精进行脱色60s；随即取无水乙醇快速脱水。脱水后，于光学显微镜下，用透明液进行适当透明，当真菌和寄主组织显示清楚时，用二甲苯处理。随后用香脂进行封片。

对比例1

对比例1中的染色方法为常规泛红-固绿染色法，具体操作为，将脱蜡至水的切片置于以50％乙醇为溶剂的0.5％番红溶液中4-5h，而后依次于50％、70％、80％、90％、95％的乙醇中进行脱水，每次1min；随后在以95％宜春为溶剂的0.3％固绿中进行复染30s后，置于100％乙醇中进一步脱水2次，每次30s。脱水完成后，分别于等体积比的二甲苯：酒精、纯二甲苯中进行透明，每次3min，其中纯二甲苯透明进行2次。则完成透明。此后进行常规封片。

为了说明本发明的效果，申请人用常规石蜡切片染色方法作为对照组，再取实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6以及对比例1制得的石蜡切片，将上述7组材料分别于莱卡生物显微镜下观察拍照，分别得到图1(实施例1)、图2(实施例2)、图3(实施例3)、图4(实施例4)、图5(实施例5)、图6(实施例6)及图7(对照组)。由图可以看出，图1、图2植物组织脱色较弱，植物组织着有蓝色；图4、图5及图6染色较深，且真菌结果部分着有蓝色；图3石蜡切片纹理轮廓清晰分明，且仅有真菌菌丝着红色，植物组织为蓝色，能明显辨别真菌状态。

而由图7与图3相比可以看出，图3中仅有菌丝单一着色，而图7中菌丝及植物细胞和均着红色，且植物细胞壁着蓝色，无法清晰的区分辨别真菌与植物细胞细胞核。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。