蓝光在影响神经干细胞增殖分化中的应用

摘要

本发明涉及蓝光在影响神经干细胞增殖分化中的应用。本发明通过对培养获得的高纯度小鼠神经干细胞在特定条件下蓝光照射后，正常培养，发现神经干细胞增殖速率明显增加，而向神经元分化的细胞数显著减少。本发明首次仅通过特定条件下的蓝光照射达到提高神经干细胞增殖速度、降低神经干细胞分化程度的目的，不添加任何其他物质，非侵入非接触，对细胞毒副作用低；未对神经干细胞进行侵入性或修饰性操作；单纯通过物理条件，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及蓝光在影响神经干细胞增殖分化中的应用，属于神经干细胞培养技术领域。

背景技术

神经干细胞(neural stem cell，NSC)是指具有分化为神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新，通过不对称分裂产生除自身以外的其他细胞，并足以提供大量脑组织细胞的干细胞。神经干细胞具有位置特异性的分化潜能，其增殖、分化和迁移，与细胞外基质(ECM)有非常密切的关系。神经干细胞的主要生物学特性有：(1)多向分化潜能并处于高度未分化状态：可分化构成神经系统3种主要细胞，即神经元细胞、星型胶质细胞及少突胶质细胞。(2)自我更新，终生具有增殖分化能力：神经干细胞具有高度增殖和自我更新能力，通过对称性或非对称性分裂产生新NSCs，以此来维持干细胞库的稳定。(3)低免疫原性：神经干细胞是未分化的原始细胞，呈巢蛋白(nestin)阳性，缺乏已分化细胞的抗原标志，不表达成熟细胞的抗原，具有低免疫原性。

在干细胞生物学中，探究细胞增殖和分化之间的关系具有重要意义。NSC是第一个在体外无限增殖的体细胞干细胞，以形成神经球作为增殖方式。神经干细胞体外培养可以来自发育过程中或者成年的大脑，也可以来自胚胎干细胞的诱导分化，并且在体外神经干细胞能够分化为三种细胞系：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

由于神经干细胞具有不断分裂增殖的能力、能与宿主细胞发生神经整合、便于基因操作等诸多优点。其在临床上得到了大量的应用。比如：对中枢神经系统的损伤部位实行细胞移植治疗：中枢神经系统损伤后其功能难以恢复，如脑瘫、帕金森病等，成为临床治疗一大难题。研究表明可用“细胞治疗”来治疗中枢神经系统退行性病变和功能重建，通过将新的细胞移植到中枢神经系统内来替代因损伤或疾病而缺失的神经细胞具有十分重要的意义。神经干细胞由于具有增殖和分化的可塑性，可以成为神经系统细胞移植的良好来源。移植后的神经干细胞可以在神经系统良好存活，且大量增殖、迁移到不同部位而分化成相应的细胞类型。比如：神经退行性疾病主要是指一类神经元的结构和功能进行性损失的疾病，包括帕金森病(Parkinsons disease,PD)，阿尔兹海默病(Alzheimeis disease,AD)，亨廷顿病(Huntingtons disease,HD)，这类患者大脑神经元持续丢失或者破坏，并无大量神经元再生代替。例：在PD研究中曾对NSC进行了基因修饰，在体外转入Foxa2和Narri1基因，结果现实二者都能协同促进NSC的分化和存活，并能增强其功能，这正是NSC移植治疗PD的关键。除此之外，神经干细胞移植还用来治疗缺血性脑损伤疾病，脑创伤、遗传代谢性疾病等。神经干细胞还可以用来基因治疗：神经干细胞在体外经分离培养、体外扩增或用永生化的细胞系使之成为进行核移植或基因转移的靶细胞，将这些携带有特殊基因或进行了基因修饰的干细胞移植到中枢神经系统后完成其双重功能，即携带基因的神经干细胞能够与宿主的神经元建立突触联系和发挥其功能，又可提供所携带的靶基因表达的产物(如缺陷的酶)，进而达到基因治疗的目的。如将转染TH基因的神经干细胞移植给患帕金森病动物，可产生宿主所缺少的多巴胺，从而起到替代性治疗作用。

光是一种辐射能，可引起光化学效应，光电效应，荧光效应和热效应等。光不仅维持人类的基本生命活动，而且在治疗某些疾病方面(如尖锐湿疣、牛皮癣、鲜红斑痣、类风湿关节炎、眼底黄斑病变、中重度痤疮、血管成型术后再狭窄)也发挥着重要作用。光疗法不同于传统的治疗手段，它对靶组织及损伤程度都具有可选择性，可减少对正常组织的损伤。与常规治疗手段相比，光疗法主要优点有：1、创伤很小；2、毒性低微；3、选择性好；4、适用性好；5、可重复治疗；6、可协同手术提高疗效；7、可消灭隐性病灶；8、可保护容貌及重要器官功能。

蓝光是可见光中能量较高的一种，波长范围在400～480纳米之间。目前发现，蓝光照射是治疗新生儿黄疸的一种简便、疗效好、见效快的方法。蓝光能够有效分解胆红素，将脂溶性的胆红素氧化成为一种水溶性的产物，从胆汁或尿液排出体外，从而降低血清中非结合胆红素浓度，达到治疗黄疸的作用。另外，蓝光对维生素B2也有一定的分解作用。

蓝光对神经细胞的分化也有影响。2015年9月，东京大学研究生院教授河西春郎领导的研究小组通过基因操作，培育出一种老鼠。当它们的大脑受到蓝光照射时，脑神经细胞的树突棘就会缩小，成功消除了老鼠的一种运动记忆。这一发现有助于研究具有类似症状的认知障碍。树突是神经细胞上形似树枝般的突起，而树突棘是树突继续分岔而形成“零件”。树突棘上有特定受体，能与神经细胞间传递刺激信息的“中转站”——突触相互结合。此前有研究显示，个头儿大的树突棘上有较多受体，因此与突触结合得更紧密，而小树突棘则与突触结合得弱一些。随着记忆和学习活动增多，部分树突棘会增生变大。

而神经干细胞表达多种感光蛋白，所以其能接受光调控。在所有的神经干细胞的表达的多种感光蛋白中，OPN4的表达量最大，而OPN4蛋白的光谱分析显示其在460nm也就是蓝光有最大的吸收峰。

目前诱导神经干细胞的增殖和分化主要通过生长因子或化学物质的刺激，如中国专利文献CN103343108A公开了牛磺酸诱导神经干细胞向神经元分化，中国专利文献CN1923195A公开了香豆素类化合物诱导神经干细胞定向分化为少突胶质细胞，中国专利文献CN 103060271A公开了柚皮苷有利于神经干细胞向神经元分化，中国专利文献CN102181396A公开了物理牵张刺激和特定化学分子RA联合作用可将神经干细胞诱导分化为具有功能的感觉神经元细胞等。以上技术方案都存在成本高、细胞毒性大等问题。

光遗传学(optogenetics)是结合遗传工程与光来操作个别神经细胞的活性，发现脑部如何产生γ波(gamma oscillations)，并为它们在调控脑部功能中的角色提供新证据。光遗传学技术主要原理是采用基因操作技术将光感基因(如ChR2，eBR，NaHR3.0，Arch或OptoXR等)转入到神经系统中特定类型的细胞中进行特殊离子通道或GPCR的表达。光感离子通道在不同波长的光照刺激下会分别对阳离子或者阴离子的通过产生选择性，从而造成细胞膜两边的膜电位发生变化，达到对细胞选择性地兴奋或者抑制的目的。

但目前尚未有蓝光对神经干细胞增殖速度和分化程度具有相关影响的报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供蓝光在影响神经干细胞增殖分化中的应用。该应用可解决神经干细胞体外培养时干性退化问题。

本发明技术方案如下：

蓝光在提高神经干细胞增殖速度、降低神经干细胞分化程度中的应用。

根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：

在光波长为400～480nm、光强度为95～105μw/cm²的条件下，通过准直镜用蓝光照射准直镜下95～105mm处的神经干细胞0.8～1.2小时。

根据本发明进一步优选的，步骤如下：

在光波长为455nm、光强度为100μw/cm²的条件下，通过准直镜用蓝光照射准直镜下100mm处的神经干细胞1小时。

根据本发明优选的，所述神经干细胞为采用如下步骤处理的细胞：

取分离的神经干细胞，接入神经干细胞增殖培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养5-6天，每天增添1/5原有体积的细胞增殖培养基，然后进行传代处理。

根据本发明进一步优选的，所述细胞增殖培养基，组分如下：

Neurobasal Medium 50mL、B27 1mL、20mg/mL的bFGF 50μL、浓度20mg/mL的EGF 50μL、浓度10万U/mL的青霉素50μL、浓度10万U/mL的链霉素50μL、浓度200mM的谷氨酰胺500μL。

更进一步优选的，所述的神经干细胞为取自孕13.5天C57BL/6小鼠胚胎脑中的神经干细胞。

有益效果

本发明首次仅通过特定条件下的蓝光照射达到提高神经干细胞增殖速度、降低神经干细胞分化程度的目的，不添加任何其他物质，非侵入非接触，对细胞毒副作用低；未对神经干细胞进行侵入性或修饰性操作；单纯通过物理条件，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1、为蓝光照射平台示意图：

图中：A为光源发射器；B为光源发射器发射出的光束；C为支柱；D为准直镜；E为放置培养皿(瓶)的位置；

图2、为获得的神经干细胞悬液照片：

图中：A为放大200倍后神经干细胞的光镜照片；B为放大200倍后神经干细胞增殖后形成的神经球的光镜照片；

图3、是放大400倍后神经干细胞和神经球表达干性蛋白标记物的光镜照片：

图中：A为放大400倍的神经干细胞和神经球表达干性蛋白NestinB的光镜照片；B为放大400倍的神经干细胞和神经球表达干性蛋白Sox2的光镜照片；

图4、是放大400倍后神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的光镜照片：

图中：A为放大400倍在非定向培养基中分化为MAP2阳性的神经元细胞；B为放大400倍在非定向培养基中分化为GFAP阳性的星形胶质细胞；C为放大400倍在非定向培养基中分化为O4阳性的少突胶质细胞；

图5、神经球的光镜照片；

图中：A为放大100倍后对照组神经干细胞增殖5天后形成的神经球的光镜照片；B为本申请神经干细胞增值5天后形成的神经球的光镜照片；

图6、Tuj1免疫荧光照片；

图中：A为放大400倍后对照组神经干细胞分化5天后Tuj1免疫荧光照片；B为放大400倍后本申请神经干细胞分化5天后Tuj1免疫荧光照片。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的技术方案进行详细的说明，但本发明所保护范围不限于此。

试剂来源

Neurobasal Medium(Invitrogen公司)；

生长因子bFGF、EGF(PeproTech公司)；

B27(Invitrogen公司)；

谷氨酰胺(Invitrogen公司)；

青霉素、链霉素(山东鲁抗医药公司)；

trypLE酶(Invitrogen公司)。

实施例

一、胎鼠全脑神经干细胞的分离和培养

1、取孕13.5天C57BL/6小鼠，断颈处死，用体积百分比浓度为75％的酒精全身消毒后，转入超净台。

2、剖腹取出胚胎，置于预冷的PBS中清洗胚胎，之后操作在冰上进行。

3、剥离胚胎颅骨取出全脑，PBS清洗后，充分剪碎，获得细胞浆液。

4、用200目筛网过滤细胞浆液，过滤到含有10ml神经干细胞增殖培养基(表1)的10cm培养皿中，混匀后，于37℃、5％CO₂恒湿恒温培养箱中培养。

5、每天向培养皿中添加2ml神经干细胞增殖培养基，以维持细胞生长所需营养。

表1：增殖培养基组成成分

二、神经干细胞的传代

1、培养4-6天后，长成较大神经球时，即可传代。

2、收集神经球转入15ml离心管中，900rpm离心5分钟。

3、去除上清，用1-2ml trypLE酶消化神经球3-5分钟，轻柔吹打细胞成单细胞悬液。

4、将细胞悬液转入20ml神经干细胞增殖培养基中终止消化，混匀后，以10ml/皿分装到10cm培养皿中，于37℃、5％CO2恒湿恒温培养箱中培养。

三、蓝光照射平台的搭建

1、将光源固定在300mm的支柱上，并在下方安装厚度为10mm的准直镜，且光源和准直镜均能在支柱上自由活动，打开电源，利用准直镜度光源光束进行准直，准直后焦距为40mm，如图1所示。

2、利用Sanwa Laser Power Meter LP1型光强度计测定准直镜下100mm处的光强度，调节电源输出功率直到光强度为100μw/cm²，此时电源输出功率为25mw。

3、固定光源和准直镜高度，锁定电源输出功率，备用。

四、蓝光照射细胞

1、取刚传代的神经干细胞悬液进行细胞计数，细胞密度以10万/ml为宜，将细胞悬液种入6孔板中，每孔2ml。

2、将实验组细胞置于光强度为100μw/cm²的波长为455nm的蓝光照射平台中进行1小时照射，对照组细胞置于相同环境下的暗盒中1小时。

五、增殖实验

1、将实验组和对照组细胞置于37℃、5％CO2恒湿恒温培养箱中培养。

2、培养5天后，吹散神经球，在倒置显微镜下进行图像采集。

3、统计神经球的直径以及直径大于50μm神经球的个数。

六、分化实验

1、蓝光照射前，将细胞种入含有清洁盖玻片的6孔板中。

2、照射完成后，将实验组和对照组中的培养基更换为神经干细胞非定向分化培养基(表2)中。

3、分化5天后，进行免疫荧光实验。

表2：非定向分化培养基组成成分

七、免疫荧光实验

1、用1×PBS清洗两次，除去PBS。

2、加入4％多聚甲醛500μl固定细胞，室温孵育20-30分钟。1×PBS清洗3次，除去PBS。

3、加入含0.2％triton-X-100的PBS(以下简称PBST)，室温作用15-20分钟。

4、除去PBST，用含5％山羊血清的PBS封闭1-2小时。4℃一抗孵育过夜。

5、PBST清洗3次，每次10min，二抗孵育1小时。

6、PBST清洗4次，每次5min，DAPI染色5分钟。

7、PBS清洗3次，取出飞片，倒扣于含抗淬灭剂的载玻片上，封片。

八、结果

1、神经干细胞的分离和培养

分离孕13.5天C57BL/6小鼠全脑神经干细胞，获得神经干细胞悬液(图2A)，在增殖培养基中培养五天，获得神经球(图2B)。

2、神经干细胞的鉴定和分化

本申请获得的神经干细胞和神经球表达干性蛋白Nestin(图3A)和Sox2(图3B)，并且可以在非定向培养基中分化为MAP2阳性的神经元(图4A)、GFAP阳性的星形胶质细胞(图4B)和O4阳性的少突胶质细胞(图4C)。

3、蓝光促进神经干细胞的增殖

与对照组相比(图5A)，在光强度为100μw/cm²的蓝光照射平台中处理1小时，神经干细胞神经干细胞的增殖能力明显增强(图5B)。培养五天后，与对照相比，实验组神经球的个数增加了73.20％，平均直径增加了36.56％。

4、蓝光抑制神经干细胞向神经元分化

与对照组相比(图6A)，在光强度为100μw/cm²的蓝光照射平台中处理1小时，神经干细胞神经干细胞向神经元分化的能力明显下降(图6B)。在非定向培养基中处理五天后，与对照相比，实验组Tuj1阳性细胞数下降了74.09％，并且阳性细胞的神经突触发育异常。