一种东京四照花抗褐化和组培增殖方法

摘要

本发明公开了一种稳定、高效的东京四照花抗褐化和组培增殖方法，包括以下步骤：1）取材：春季4～5月晴好天气，取当年生无病害、生长健壮的营养枝；2）灭菌：灭菌方法为酒精30s+0.1%升汞7min的组合；3）无菌抗褐化体系建立：消毒后的茎段平摊于已消毒滤纸上晾干，接种于含200mg·L‑1 PVP抗褐化剂的培养基中，待芽长至3～4cm，进行增殖培养；4）增殖培养：将诱导生成的芽接种于增殖培养基（WPM+1.0 mg·L‑16‑BA+0.05 mg·L‑1NAA）中，每隔20～25天继代一次。本发明优化了东京四照花组培增殖的各个阶段，有效降低褐化率到17.87%，提高增殖系数高达3.09。

说明书

技术领域

本发明涉及一种东京四照花抗褐化和组培增殖方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

东京四照花(Dendrobenthamia tonkinensis)属山茱萸科(Cornaceae)四照花属(Dendrobenthamia)植物，为常绿小乔木或灌木。其树形优美，枝条平展，层次分明(Hattaet al，1999)，可春观亮叶，夏赏玉花，秋看红叶红果，被广泛应用于园林绿化、公园造景、盆栽艺术；其叶敷伤口可消肿，根、种子煎水服可补血，具一定药用价值；其果含高脂肪与高钙，可鲜食、制醋和酿酒，是一种具营养价值的野生水果(韩维栋，1993；Vareed，2005)；其木材坚硬，纹理通直细腻，易加工，是良好的用材树种(辛蕾，2009)。综上所述，该树种集观赏、食用、药用和材用价值于一身，是很有开发利用前景的多用途珍贵树种。

东京四照花目前的繁殖方式主要是实生繁殖、嫁接、扦插和组培繁殖。实生繁殖无法保证树种的优良特性，且东京四照花种子具深休眠性，播种两年才能萌发，延长了育苗周期，增大了育苗成本。无性繁殖能保持树种的优良性状，是种群扩繁的常用方法。但扦插繁殖需要一定条件的温度、湿度和营养物质、特殊的活性物质的参与，操作复杂，生根率低；嫁接繁殖繁殖系数低，接穗需求量大，繁殖周期长，生产效率低，以上三种方法均无法满足市场需求，实现东京四照花规模化生产。

发明内容

本发明的目的是为了解决传统东京四照花繁殖方法存在的育苗周期长、繁殖系数低、生产效率低等问题，提供了一种稳定、高效的东京四照花抗褐化和组培增殖方法，通过优化东京四照花取材、消毒、无菌抗褐化体系建立、不定芽诱导、增殖培养等各个阶段的操作，有效提高东京四照花不定芽的抗褐化能力，促使东京四照花在较短时间内产生大量具亲本优良特性的不定芽，为后期东京四照花快繁体系建立奠定基础。

为解决上述技术问题，本发明提供一种东京四照花抗褐化和组培增殖方法，其特征是，包括:

(1)外植体的选取：取样时间为春季4月至5月，选取当年生健康、无病害的带芽茎段；

(2)外植体的灭菌：先用70％～75％酒精浸泡20～30s，无菌水冲洗2～3次后，再用0.08％～0.1％的升汞浸泡7～8min，用无菌水冲洗4～5次后备用；

(3)无菌抗褐化体系建立：将修剪好的茎段插入灭菌的培养基中，用封口膜密封后放入培养室培养，所述培养基为WPM基本培养基，激素组合为6-BA和NAA，浓度分别为1.0～2.0mg·L^-1和0.05～0.2mg·L^-1，添加蔗糖25～30g·L^-1、琼脂粉6.5～7g·L^-1、抗褐化剂PVP100～200mg·L^-1，并调节pH至5.70～5.78；

(4)增殖培养：待腋芽长至3～4cm，选取生长健壮的腋芽材料，将其移至不定芽增殖培养基中进行继代增殖培养，用封口膜密封后放入培养室培养，每隔20～25d继代一次，所述不定芽增殖培养基为WPM基本培养基，激素组合为6-BA和NAA，浓度分别为1.0～2.0mg·L^-1和0.05～0.2mg·L^-1，添加蔗糖25～30g·L^-1、琼脂粉6.5～7g·L^-1、抗褐化剂PVP100～200mg·L^-1，并调节pH至5.70～5.78。

优选地，所述步骤(1)中，外植体选取的具体方法为：在晴好天气下，从东京四照花母树向阳面树体外围，选取当年生健康、无病害的营养枝，从顶端1、2节处剪取长度为3～4cm的带芽茎段，保留1个腋芽，腋芽要求已膨大但芽鳞尚未张开。3～4cm的带芽茎段容易诱导分化出芽，茎段贮存的养分能够在腋芽初期提供养分，本发明的所选取的茎段腋芽形态已基本形成，且有芽鳞保护，不易污染，腋芽生长速度快，适应能力强，遗传性状稳定。

优选地，所述步骤(2)中，酒精浓度为70％，浸泡30s，升汞浓度为0.1％，浸泡7min，是东京四照花茎段消毒的最佳处理组合，污染率和死亡率都最低。

优选地，所述步骤(2)中，外植体灭菌前，修剪茎段上的叶片，保留叶柄和1/5叶片，用自来水冲洗1～2小时，然后将清洗好的茎段在超净工作台上进行消毒处理。灭菌进行茎段的适当修剪有利于减少实验者在超净工作台上的工作量，提高消毒效果和工作效率，流水冲洗能够有效去除茎段所带泥土、灰尘以及伤流液，避免出现因植株内含物质抑制茎段生长的现象。

优选地，所述步骤(3)中，将消毒好的东京四照花茎段平铺于已消毒的滤纸上晾干后再进行接种。经过消毒处理后的茎段体表带有水分，置于已消毒的滤纸上吸干晾干，可以除去茎段表面的水分，防止空气中的细菌以及操作所带来的细菌吸附于茎段表面，影响试验成功率。

优选地，所述步骤(3)中，修剪方法为：用已灭菌的剪刀去除茎段首尾两端和部分叶柄，避免消毒剂未完全从材料伤口处清洗掉，残留的消毒剂会通过外植体伤口转移至外植体其他部位，破坏外植体组织结构，影响外植体的生长状态，同时接触过消毒剂后，外植体伤口表面形成的保护结构会阻碍培养基中的营养成分进入外植体内，影响外植体的正常生长和试验的成功率。

将修剪好的茎段插入灭菌的培养基中时，插入部位深度占茎段长度的1/4，每瓶培养基插入2～3个茎段，茎段的插入深度不宜过深，过深则透气性差，茎段容易死亡；过浅则茎段不易稳定，容易倒伏。茎段内有含促进腋芽生长的特殊物质，每瓶中插入2～3个茎段有利于有益物质的积累。

优选地，所述步骤(3)中，所述培养基为WPM基本培养基，激素组合为6-BA和NAA，浓度分别为1.5mg·L^-1和0.05mg·L^-1，添加蔗糖30g·L^-1、琼脂粉6.5g·L^-1、抗褐化剂PVP200mg·L^-1，并调节pH至5.75。

优选地，所述步骤(4)中，腋芽材料的切取方法为：在超净工作台上用组培刀将腋芽从外植体着生部位切下，剔除腋芽上的褐化组织，剔除褐化组织可以避免褐化现象的进一步发展，有利于腋芽在增殖培养基上的正常生长。

进行继代增殖培养时，每瓶培养基接入3个腋芽材料，腋芽材料内有含促进不定芽生长的特殊物质，每瓶中插入3个腋芽材料有利于有益物质的积累。

优选地，所述步骤(4)中，所述不定芽增殖培养基为WPM基本培养基，激素组合为6-BA和NAA，浓度分别为1.0mg·L^-1和0.05mg·L^-1，添加蔗糖30g·L^-1、琼脂粉6.5g·L^-1、抗褐化剂PVP>-1，并调节pH至5.75。

优选地，所述步骤(3)和步骤(4)中，培养室环境条件为：培养室光照时间为12h/天，光照强度为1500Lx，温度为21±2℃，该环境的光周期和光照强度模拟了东京四照花在自然条件下的光照条件，21±2℃的环境温度适宜于东京四照花组培材料的生长，同时能抑制培养室内的细菌滋生。

本发明所达到的有益效果：

本发明优化了东京四照花组织培养各个阶段的操作方法，有效降低了褐化率，控制了污染，提高了增值系数，具体地：

(1)通过对取样时间、消毒方法的筛选以及抗褐化处理，确定了最佳的采样时间和最适浓度的抗褐化剂；培养基低pH能够抑制褐化，本发明的培养基pH值为5.70～5.78。

(2)温度能够影响植物体内酶活性，本发明不定芽的诱导和增殖培养置于21℃±2℃温度条件下，在保证东京四照花正常生长的前提下抑制酚类物质产生，减轻褐化现象发生。

(3)东京四照花伤口处酚类物质的长期积累会引起褐化发生，本发明中缩短了不定芽继代培养的时间，将继代培养时间定为20～25d。

(4)本发明采用的腋芽萌发配方(WPM+1.5mg·L^-1>-1NAA+30g·L^-1蔗糖+6.5g·L^-1琼脂粉+200mg·L^-1PVP)和不定芽增殖配方(WPM+1.0mg·L^-1>-1NAA+30g·L^-1蔗糖+6.5g·L^-1琼脂粉+200mg·L^-1PVP)，培养获得的东京四照花腋芽萌发率高达77.78％，不定芽增殖系数达3.09，东京四照花不定芽生长速度快，长势较好，颜色正常、无玻璃化现象。

(5)本方法操作简单、重演性强、容易掌握，减少了大量的人力物力消耗。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅为本发明的优选实施例，用于更加清楚地说明本发明的技术方案，并不对本发明的实施范围构成任何限制。

实施例1、污染抗褐化比较

外植体的选取：分别于2014年4、5、7、8、10、11月中旬，在南京林业大学白马基地东京四照花苗圃采集当年生健康、无病害营养枝，从顶端1、2节处剪取长约3～4cm的带芽茎段，保留1个腋芽，置于冰盒内带回实验室备用。

外植体的灭菌：修剪茎段上的叶片，保留叶柄和1/5叶片，用自来水冲洗1～2小时，然后将清洗好的茎段在超净工作台上进行消毒处理，先用70％酒精浸泡30s，无菌水冲洗2～3次后，再用0.1％的升汞浸泡5、7、9、11min，用无菌水冲洗4～5次后备用(见下表1)。

无菌抗褐化体系建立：将消毒好的东京四照花茎段置于已消毒的滤纸(11×11cm)上晾干，用已灭菌的剪刀去除茎段首尾两端和叶腋处部分叶柄，将剪好的茎段插入灭菌的不定芽诱导培养基(培养基配方为WPM+1.5mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1IBA)，抗褐化处理如下表2，pH调节处理如下表3，茎段插入部位深度占茎段长度的1/4，每瓶培养基插入2～3个茎段，一次接种20瓶，重复3次，在此过程中，控制培养室内的环境条件，及时清理被污染和褐化的茎段材料和培养基。

表1取样季节和消毒时间对东京四照花外植体污染率和死亡率的影响

注：本表中小写字母表示注表示在α＝0.05水平有显著性差异，下同。

由上表1可以看出，春季4月至5月适合采集东京四照花茎段，其中4月至5月，酒精处理30s，0.1％升汞处理7min是东京四照花茎段消毒的最佳处理组合，污染率与其他处理时间存在显著差异，仅为12.86％。

表2抗褐化剂种类和浓度对东京四照花茎段褐化率的影响

由上表2可以得出，本发提供的浓度为200mg·L^-1的抗褐化剂PVP对东京四照花组培的抗褐化效果最好，能将东京四照花组培褐化率有效降低至17.87％，与同抗褐化剂不同浓度和不同褐化剂不同浓度相比存在显著差异。

表3 pH值对东京四照花褐化率的影响

pH褐化率(％)萌芽率(％)5.6651.43a32.16c5.7020.17c68.41a5.7420.03c68.55a5.7819.98c68.88a5.8233.08b54.02b

由上表3可以得出，本发明提供的范围在5.70～5.78的pH值对东京四照花组培的抗褐化效果较好，且对外植体正常的生长、分化影响较小。组培中的褐化现象指的是外植体所含酚类化合物和多酚氧化酶在氧气的作用产生的醌类物质，这些醌类物质会沿着培养基向外扩散，抑制其他酶活性，影响植物分化生长。pH值过高过低会导致培养基过硬和过软，植物生长分化受阻，植物生长势低，容易遭受褐化影响，而适宜的pH值能够在一定程度上遏制多酚氧化酶的活性，提高植物的适应能力，增强植物的生长势，提高植物的抗褐化能力。

实施例2、无菌体系萌发率比较

外植体的选取：于2015年4月中旬，在南京林业大学白马基地东京四照花苗圃采集当年生健康、无病害营养枝，从顶端1、2节处剪取长约3～4cm的带芽茎段，保留1个腋芽，置于冰盒内带回实验室备用。

外植体的灭菌：修剪茎段上的叶片，保留叶柄和1/5叶片，用自来水冲洗1～2小时，然后将清洗好的茎段在超净工作台上进行消毒处理，先用70％酒精浸泡30s，无菌水冲洗2～3次后，再用0.1％的升汞浸泡7min，用无菌水冲洗4～5次后备用。

无菌抗褐化体系建立：将消毒好的东京四照花茎段置于已消毒的滤纸(11×11cm)上晾干，用已灭菌的剪刀去除茎段首位两端和叶腋处部分叶柄，将剪好的茎段插入灭菌的腋芽诱导培养基，腋芽诱导培养基中培养基为WPM基本培养基，培养基中添加30g·L^-1蔗糖、6.5g·L^-1琼脂粉和200mg·L^-1PVP，激素组合见下表4，插入部位深度占茎段长度的1/4，每瓶培养基插入2～3个茎段，一次接种20瓶，重复3次，在此过程中，控制培养室内的环境条件，及时清理被污染和褐化的茎段材料和培养基。

表4不同激素配比对东京四照花外植体萌芽率的影响(浓度：mg·L^-1)

由上表4可以看出，本发明中东京四照花无菌体系建立所用的培养基WPM+1.5mg·L^-1>-1NAA+30g·L^-1蔗糖+6.5g·L^-1琼脂粉+200mg·L^-1PVP与其他激素组合相比存在显著差异，外植体萌芽率能高达77.78％。

实施例3、增殖培养配方比较

外植体的选取：分别于2014年4、5、7、8、10、11月中旬，在南京林业大学白马基地东京四照花苗圃采集当年生健康、无病害营养枝，从顶端1、2节处剪取长约3～4cm的带芽茎段，保留1个腋芽，置于冰盒内带回实验室备用。

外植体的灭菌：修剪茎段上的叶片，保留叶柄和1/5叶片，用自来水冲洗1～2小时，然后将清洗好的茎段在超净工作台上进行消毒处理，先用70％酒精浸泡30s，无菌水冲洗2～3次后，再用0.1％的升汞浸泡5、7、9、11min，用无菌水冲洗4～5次后备用。

无菌抗褐化体系建立：将消毒好的东京四照花茎段置于已消毒的滤纸(11×11cm)上晾干，用已灭菌的剪刀去除茎段首位两端和叶腋处部分叶柄，将剪好的茎段插入灭菌的不定芽诱导培养基(培养基配方为WPM+1.5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+6.5g·L^-1琼脂粉+200mg·L^-1PVP)，插入部位深度占茎段长度的1/4，每瓶培养基插入2～3个茎段，一次接种20瓶，重复3次，在此过程中，控制培养室内的环境条件，及时清理被污染和褐化的茎段材料和培养基。

增殖培养：增殖东京四照花茎段经过一段时间的培养，诱导产生了芽，待芽长至3～4cm，选取生长健壮、颜色正常的芽材料，用组培刀将其从外植体着生部位切下，可带有小部分外植体组织，剔除不定芽上褐化的组织，将其移至不定芽增殖培养基(增殖培养基见表5)中进行继代增殖培养，每瓶接入3个茎段，密封后放入培养室培养，每20～25d继代一次，一次接种20瓶，重复3次，增值系数＝单个外植体再生形成的不定芽的总和/60。

表5不同增殖培养基对东京四照花不定芽增殖的影响

由上表5可以看出，本发明提供的增殖配方WPM+1.0mg·L^-1>-1NAA相比于其他三种增殖培养基存在显著差异，增殖系数能达到3.09。

以上实施例中培养基均添加30g·L^-1蔗糖和6.5g·L^-1琼脂粉，pH值调整为5.70～5.78范围内，培养条件为培养室光照时间为12h/天，光照强度为1500Lx，温度为21℃±2℃。

由实施例1、2、3可知，一种稳定、高效的四照花抗褐化和组培增殖方法为：最佳取材时间为春季4～5月，最佳消毒方法为70％酒精30s+0.1％升汞7min，最适宜的抗褐化种类和浓度为200mg·L^-1PVP，腋芽诱导的最佳配方：WPM+1.5mg·L-1>-1和0.05mg·L^-1。

相比于传统的繁殖方法，本发明降低了育苗成本，提高了育苗效率，通过本发明能够有效控制东京四照花组培污染，降低组培褐化率达17.87％，增值系数高达3.09，为后期东京四照花的深入研究提供大量的组培材料，为实现东京四照花工厂化生产奠定基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。