诱导前列腺癌细胞凋亡的多肽及其应用

摘要

本发明涉及一种诱导前列腺癌细胞凋亡的多肽及其在治疗受试者中前列性癌的药物的制备中的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一种诱导前列腺癌细胞凋亡的多肽及其在治疗受试者中前列性癌的药物的制备中的用途。

背景技术

前列性癌是发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，发病率高，死亡率高，是男性最常见的恶性肿瘤之一。前列腺癌的病因目前尚不明确，可能与遗传、环境等多种因素有关。和人类其他的肿瘤一样，炎症和免疫抑制在前列性癌发生、发展过程中扮演了重要角色。

目前的研究认为与肿瘤相互作用的宿主成分可能会参与形成前列腺癌发生、发展的免疫抑制微环境，大量证据显示前列腺癌是免疫性相关的，前列腺内存在的一些肿瘤相关性抗原进一步证实了它的可行性，这些相关抗原主要有前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺肝细胞抗原(PSCA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)等。针对这些相关抗原来设计分子靶向药物，可以选择性的杀伤或抑制肿瘤细胞，而又不损伤正常细胞，因此具有重要的研究意义和广泛的应用前景。

PSMA是存在于前列腺上皮细胞胞膜的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要有三部分组成：胞外部分(707个氨基酸)、跨膜部分(24个氨基酸)和胞内部分(19个氨基酸)。PSMA基于这种跨膜结构而参与信号传导，使得细胞表面蛋白的信号可以传递到细胞内，并具有受体功能发挥内吞作用，以及具有促进细胞迁移和叶酸水解酶以及羧肽酶的特性。

由于PSMA在前列腺癌上皮细胞中高表达，而在正常组织内皮细胞中不表达或低表达，特别是晚期前列腺癌及转移性前列腺癌患者中，PSMA升高尤为明显，这使得它成为前列腺癌诊断和治疗的一个重要靶分子。自1987年Horoszewicz等第一个研发出了PSMA的单克隆抗体7E11-C5后，J415、J591、J533等一系列针对PSMA的单克隆抗体被分离纯化出来。早期的7E11只能识别PSMA细胞内的抗原决定簇，不能结合活的细胞。而J591不但可以识别PSMA胞外的抗原决定簇，还可以结合有PSMA表达的活细胞。这主要是因为PSMA的胞外区可以通过基序MXXXL内陷增加细胞对J591的结合、吸收。

以这些抗体为基础衍生出来的特异性杀伤前列腺癌细胞为靶向治疗前列腺癌提供了重要的研究思路。特别是近年来，在PSMA的胞内区和胞外区已经发现多个可与多肽结合的表位。可以与表位结合的多肽、特别是与胞外区表位结合的多肽类药物对于前列腺癌的治疗具有重要意义。

基于PSMA在膜外的一个能与药物识别的结构域，有研究人员设计合成了一系列能被PSMA激活的甲氨蝶呤类偶合物，促使PSMA发挥外肽酶作用，释放出甲氨蝶呤，发挥杀瘤作用，但可能由于偶合物分子过大和甲氨蝶呤毒性等原因，没有达到预期效果。

另一方面，自噬相关基因Beclin1的缺失是肿瘤细胞自噬作用降低、抗凋亡能力增强的机制所在。增加Beclin1的表达有助于增强肿瘤细胞的自噬作用，降低肿瘤细胞的抗凋亡能力。Beclin1蛋白也包含三个部分，分别是BH3(Bcl-2-homology-3)、中央螺旋区(central coiled-coil domain，CCD)及进化保守区(evolutionary conserved district，ECD)三个结构域。其中ECD结构域对Beclin1发挥调节自噬和抑制肿瘤的功能至关重要。有研究表明，含有Beclin1ECD结构域的融合蛋白可以显著提高前列腺癌细胞的凋亡率，且凋亡细胞随着ECD融合蛋白浓度的增大而逐渐增加。

我们在对Beclin1的氨基酸序列进行分析的基础上并结合J591特异识别PSMA的高变区序列，研究并设计能特异识别PSMA，并使PSMA阳性细胞加速凋亡的多肽。

发明内容

本发明的目的在于提供能够通过PSMA诱导前列腺癌细胞凋亡的多肽以及相关药物。

在第一方面，本发明提供了一种诱导前列腺癌细胞凋亡的多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1

(WTKALKFMXXXLKWGLAWVSHFSVGS)，其中X为任意氨基酸。

在本发明的实施方案中，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

在本发明的实施方案中，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：2～10中的任一个，具体序列如下：

SEQ ID NO：2：WTKALKFMLTNLKWGLAWVSHFSVGS；

SEQ ID NO：3：WTKALKFMLNTLKWGLAWVSHFSVGS；

SEQ ID NO：4：WTKALKFMAHILKWGLAWVSHFSVGS；

SEQ ID NO：5：WTKALKFMGCPLKWGLAWVSHFSVGS；

SEQ ID NO：6：WTKALKFMSTMLKWGLAWVSHFSVGS；

SEQ ID NO：7：WTKALKFMDQWLKWGLAWVSHFSVGS；

SEQ ID NO：8：WTKALKFMYKKLKWGLAWVSHFSVGS；

SEQ ID NO：9：WTKALKFMFVSLKWGLAWVSHFSVGS；

SEQ ID NO：10：WTKALKFMRTELKWGLAWVSHFSVGS。

在第二方面，本发明提供了如第一方面中所述的多肽在治疗受试者中前列性癌的药物的制备中的用途。

在本发明的实施方案中，所述药物能够被口服、静脉内注射、动脉内注射、皮下注射或肌内注射而施用。

在本发明的实施方案中，所述药物被制成固体或生理上可接受的液体载体。

有益效果：

相对于目前已经存在的能够抑制PSMA的一系列单克隆抗体、多肽和化合物等，本发明的多肽诱导前列腺癌细胞凋亡的能力更强，对于前列腺癌的治疗效果更好。

附图说明

通过以下参照附图对本发明实施例的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：

图1显示不同质量浓度的SEQ ID NO：2多肽对前列腺癌细胞株LNcap的细胞凋亡诱导结果。

图2显示不同质量浓度的SEQ ID NO：2多肽对前列腺癌细胞株LNcap的迁移的抑制作用。

图3显示不同质量浓度的SEQ ID NO：2多肽对前列腺癌细胞株LNcap中凋亡抑制基因Bcl-2和自噬相关基因Atg5表达的调控作用。

图4显示不同质量浓度的SEQ ID NO：2多肽对前列腺癌细胞株LNcap细胞中p-AKT表达水平的调控作用。

图5显示不同质量浓度的SEQ ID NO：2多肽以及J591单抗对前列腺癌小鼠中肿瘤的抑制作用。

具体实施方式

以下基于实施例对本发明进行描述，但是本发明并不仅仅限于这些实施例。

实施例1多肽合成

多肽氨基酸序列为SEQ ID NO：2：WTKALKFMLTNLKWGL AWVSHFSVGS

委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。DMSO溶解后-80℃保存备用。

实施例2

将前列腺癌细胞株LNcap细胞以5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，37℃、5％CO2条件下培养24h后分别加入不同质量浓度(0、2、10、50、100μg/mL)多肽。继续培养48h后收集细胞，离心、PBS洗2次后AnnexinⅤ-FITC结合液重悬细胞，加入AnnexinⅤ-FITC轻轻混匀，室温避光孵育、离心、弃上清，加入AnnexinⅤ-FITC结合液重悬细胞，加入PI染色液，BDFACSCalibur流式细胞仪检测。

如图1所示，LNcap细胞的凋亡率随着多肽浓度的增高而增加。多肽浓度为100μg/mL时，LNcap细胞凋亡率大于50％。

实施例3

取LNcap细胞，将细胞浓度调整为1x10⁶个/ml。在Cornng>6个/ml的LNcap细胞，并分别加入不同质量浓度(0、2、10、50、100μg/mL)多肽。下室加入500μl含40％FBS的RPMI1640培养基，种板后置于培养箱培养18h，取出下室并弃掉上室中培养基，4％多聚甲醛溶液固定，结晶紫染色后在倒置显微镜下放大200倍计数取景框中移至微孔膜下层的细胞。平均每个小室计数10个视野。取平均值分析细胞的迁移能力。

如图2所示，本发明的多肽可以有效抑制LNcap细胞的迁移能力，且成剂量依赖，随着多肽浓度的升高，LNcap细胞的迁移能力逐步降低。

实施例4

将LNcap细胞以5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，37℃、5％CO2条件下培养24h后分别加入不同质量浓度(0、2、10、50、100μg/mL)多肽。继续培养48h后收集细胞，抽提RNA，并逆转录成cDNA，以GAPDH为内参，qPCR检测凋亡抑制基因Bcl-2和自噬相关基因Atg5的表达。

引物序列分别为：

GAPDH Forward:5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，

GAPDH Reverse:GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；

Bcl-2Forward:GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3’，

Bcl-2Reverse:CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3’；

Atg5Forward:5’-AAAGATGTGCTTCGAGATGTGT-3’,

Atg5Reverse:5’-CACTTTGTCAGTTACCAACGTCA-3’。

结果如图3所示，本发明的多肽可以通过下调凋亡抑制基因Bcl-2表达，上调自噬相关基因Atg5表达来加速LNcap细胞的凋亡。

实施例5

PSMA可以通过上调AKT磷酸化水平而激活PI3K/AKT信号通路，增加前列腺癌细胞的增殖和转移。

将前列腺癌细胞株LNcap细胞以5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，37℃、5％CO2条件下培养24h后分别加入不同质量浓度(0、2、10、50、100μg/mL)多肽，继续培养48h后收集细胞。

用4℃预冷的PBS充分洗涤3次后，加入4℃的含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液200μL重悬细胞，冰上裂解20min。离心收集上清蛋白液，并取150μl蛋白液加入37.5μl 5×蛋白buffer，100℃煮沸5min，4℃保存备用。

将制备好的蛋白液加入凝胶中电泳，先用电压60V电泳5min，再用80V电压电泳60min。电泳结束后进行转膜，100V，2h。结束后将膜从电转槽中取出，TBST稍加漂洗，浸没于封闭液(含5％脱脂奶粉)中缓慢摇荡1h。将含有目的蛋白的膜分别转入装有4ml一抗(Rabbit Phospho-AKT1(Ser473)Antibody)的自封袋中，水平摇床上50rpm 1h，转到4℃过夜。第二天将膜取出，用TBST漂洗四次。将转有目的蛋白的膜和内参蛋白的膜分别放在2号自封袋中，加入稀释(1：5000)对应一抗的二抗(Goat anti-Rabbit IgG(H+L)SecondaryAntibody)，室温轻摇一小时，一抗和二抗均购自eBioscience。二抗孵育结束后，用PBST漂洗膜四次。避光加入显色剂显色拍照。

结果如图4所示，随着多肽浓度的升高，LNcap细胞p-AKT的表达水平逐渐下降。说明本发明的多肽可以通过抑制AKT的磷酸化而抑制PI3K/AKT信号通路，从而抑制PSMA的增殖和转移。

实施例6

动物模型检测多肽在体内的肿瘤抑制作用。取6～8周龄雄性C57BL/6裸鼠42只，将处于对数生长期的LNcap细胞浓度调整为2x10⁷个/ml，每只100ul接种于C57BL/6裸鼠右前肢腋部皮下。1～2周后裸鼠肿瘤体积长到50～100mm³时，裸鼠随机分成6组，每组7只。分别为0、2、10、50、100μg/kg多肽组和100μg/kg的J591单抗组。0μg/kg组作为阴性对照组，以等体积DMSO代替。各组多肽和J591均以生理盐水稀释至200ul，经尾静脉注射。2天一次，连续给药4次后，观察裸鼠存活数量，计数存活率。

如图5所示，随着多肽浓度的升高，裸鼠存活时间逐渐延长，多肽浓度为100μg/kg时小鼠存活时间最长。本发明的多肽与J591单抗组相比，在同为100μg/kg的浓度时，多肽的效果比J591单抗的效果更好。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳泰华细胞工程有限公司

<120> 诱导前列腺癌细胞凋亡的多肽及其应用

<130> 20170806

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(11)

<223> Xaa 可以是任何自然存在的序列

<400> 1

Trp Thr Lys Ala Leu Lys Phe Met Xaa Xaa Xaa Leu Lys Trp Gly Leu

1 5 1015

Ala Trp Val Ser His Phe Ser Val Gly Ser

2025

<210> 2

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Trp Thr Lys Ala Leu Lys Phe Met Leu Thr Asn Leu Lys Trp Gly Leu

1 5 1015

Ala Trp Val Ser His Phe Ser Val Gly Ser

2025

<210> 3

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Trp Thr Lys Ala Leu Lys Phe Met Leu Asn Thr Leu Lys Trp Gly Leu

1 5 1015

Ala Trp Val Ser His Phe Ser Val Gly Ser

2025

<210> 4

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Trp Thr Lys Ala Leu Lys Phe Met Ala His Ile Leu Lys Trp Gly Leu

1 5 1015

Ala Trp Val Ser His Phe Ser Val Gly Ser

2025

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Trp Thr Lys Ala Leu Lys Phe Met Gly Cys Pro Leu Lys Trp Gly Leu

1 5 1015

Ala Trp Val Ser His Phe Ser Val Gly Ser

2025

<210> 6

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Trp Thr Lys Ala Leu Lys Phe Met Ser Thr Met Leu Lys Trp Gly Leu

1 5 1015

Ala Trp Val Ser His Phe Ser Val Gly Ser

2025

<210> 7

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Trp Thr Lys Ala Leu Lys Phe Met Asp Gln Trp Leu Lys Trp Gly Leu

1 5 1015

Ala Trp Val Ser His Phe Ser Val Gly Ser

2025

<210> 8

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Trp Thr Lys Ala Leu Lys Phe Met Tyr Lys Lys Leu Lys Trp Gly Leu

1 5 1015

Ala Trp Val Ser His Phe Ser Val Gly Ser

2025

<210> 9

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Trp Thr Lys Ala Leu Lys Phe Met Phe Val Ser Leu Lys Trp Gly Leu

1 5 1015

Ala Trp Val Ser His Phe Ser Val Gly Ser

2025

<210> 10

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Trp Thr Lys Ala Leu Lys Phe Met Arg Thr Glu Leu Lys Trp Gly Leu

1 5 1015

Ala Trp Val Ser His Phe Ser Val Gly Ser

2025