一种利用肌肉必需脂肪酸组成区分多个地理群体茎柔鱼的方法

摘要

本发明涉及一种利用肌肉必需脂肪酸组成区分多个地理群体茎柔鱼的方法：具体包括(1)提取茎柔鱼肌肉脂肪酸；(2)利用GC‑MS测定脂肪酸；(3)分析肌肉脂肪酸数据；(4)计算多个地理群体茎柔鱼的n‑3和n‑6系列不饱和脂肪酸判别系数和常量；(5)判别：利用上述步骤(1)‑(3)得到待判别的茎柔鱼肌肉n‑3和n‑6系列不饱和脂肪酸含量百分比，和步骤(4)的判别系数和常量计算多个判别函数值，以最大函数值对应的地理区域表示其所属地理群体。本方法的方法具有快速、准确性高的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及水产学领域，更具体地说，涉及一种利用肌肉必需脂肪酸组成区分多个地理群体茎柔鱼的方法。

背景技术

脂肪酸是一种特殊的化合物，主要以三羧酸甘油酯和磷脂的形式存在，其在生物的摄食活动过程中相对稳定不易变化，可用于分析食物来源，是天然生物标志物之一(许强,杨红生.脂肪酸标志物在海洋生态系统营养关系研究中的应用[J].海洋学报,2011,33(1):1-6)。作为生物标志物，脂肪酸有几大优越性：第一，脂肪酸可以通过形成贮存脂，储存在生物体内，从而可反映一段时期内生物的摄食情况，相对于传统的胃含物分析法，减小了判断生物食性的偶然性；第二，在新陈代谢过程中相对稳定，在摄食和同化过程中结构基本保持不变；第三，生物体内三羧酸甘油酯中的脂肪酸主要来自于所摄入的食物(HendersonRJ,Sargent JR.Lipid biosynthesis in rainbow trout,Salmo gairdnerii,fed dietsof differing lipid content[J].Comparative Biochemistry&Physiology Part CComparative Pharmacology,1981,69(1):31-37)。

海洋生物的脂肪酸分成饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸两类。其中n-3和n-6系列高度不饱和脂肪酸只能从饵料中获取，不能自身合成，因此这些脂肪酸被称为必需脂肪酸(Olsen Y.Lipids and Essential Fatty Acids in Aquatic Food Webs:What CanFreshwater Ecologists Learn from Mariculture？[M]//Lipids in FreshwaterEcosystems.Springer New York,1999:161-202)，这些必需脂肪酸常作为海洋食物关系研究中的脂肪酸标志物(Gordon BJ,Tocher DR,Macdonald FM,et al.Effects of dietsrich in linoleic(18:2n-6)and α-linolenic(18:3n-3)acids on the growth,lipidclass and fatty acid compositions and eicosanoid production in juvenileturbot(Scophthalmus maximus L.)[J].Fish Physiology and Biochemistry,1994,13(2):105；Smith GI,Atherton P,Reeds DN,et al.Dietary omega-3fatty acidsupplementation increases the rate of muscle protein synthesis in olderadults:a randomized controlled trial[J].American Journal of ClinicalNutrition,2011,93(2):402-412)。因此可利用脂肪酸标志物法了解茎柔鱼不同地理种群食性和营养地位。

目前利用脂肪酸标志物对茎柔鱼不同地理种群进行摄食生态学研究的文献还未见报道。国内研究主要是对其肌肉和腕足的营养成分分析(杨宪时,王丽丽,李学英等,.秘鲁鱿鱼和日本海鱿鱼营养成分分析与评价[J].现代食品科技,2013,29(9):2247-2251)和食品加工研究(王丽丽.鱿鱼足即食休闲风味食品研究初探[D].大连海洋大学,2014)，国外仅Saito等(Saito H,Sakai M,Wakabayashi T.Characteristics of the lipid andfatty acid compositions of the Humboldt squid,Dosidicus gigas:The trophicrelationship between the squid and its prey[J].European Journal of LipidScience and Technology,2014,116(3):360-366)对秘鲁外海茎柔鱼不同组织和胃含物的脂肪酸组成进行了研究。大量研究发现，利用脂肪酸标志物的示踪作用可以较准确地揭示特定类群在单一或不同生境中的食物来源差异以及某一特定复杂生境中同种类群生物的食物来源情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用肌肉必需脂肪酸组成区分多个地理群体茎柔鱼的方法，该方法具有快速、准确性高的优点。

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案：

一种利用肌肉必需脂肪酸组成区分多个地理群体茎柔鱼的方法，其包括如下步骤：

(1)提取茎柔鱼肌肉脂肪酸，得到含有茎柔鱼肌肉脂肪酸的溶液；

(2)利用GC-MS测定肌肉脂肪酸；

(3)分析肌肉脂肪酸数据：

a.定量分析肌肉脂肪酸含量，获得样品中n种脂肪酸的最终浓度(a₁……a_n)，根据公式：a_n×稀释倍数×原始溶液体积，计算n种脂肪酸的含量，其中原始溶液体积为步骤(1)的含有茎柔鱼肌肉脂肪酸的溶液体积；

b.各脂肪酸的含量除以总脂肪酸含量，计算出各脂肪酸所占含量百分比；

c.筛选出p种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量百分比(W₁……W_p)作为该样品的必需脂肪酸分析结果；

(4)计算多个地理群体茎柔鱼的n-3和n-6系列不饱和脂肪酸判别函数系数和常量：

a.以地理群体作为分组变量，n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量百分比作为自变量，对已知来自多个(1……m)地理群体茎柔鱼的p种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量百分比进行线性判别分析；

b.分析得出多个(1……m)地理群体的p种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸的相应判别系数(K_1-1……K_1-p，K_2-1……K_2-p，K_m-1……K_m-p)和m个地理群体的常量(C₁……C_m)；

其中n，p，m都为整数，

(5)判别：利用上述步骤(1)-(3)得到待判别的茎柔鱼肌肉中p种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量百分比(W₁……W_p)，根据步骤(4)的判别系数和常量计算m个判别函数值(F₁……F_m)，

其中函数值F₁、F₂……F_m的计算方法为：

F₁＝K_1-1×W_1-1+K_1-2×W_1-2+……+K_1-n×W_1-p+C₁，

F₂＝K_2-1×W_2-1+K_2-2×W_2-2+…+K_2-p×W_2-p+C₂，

……

F_m＝K_m-1×W_m-1+K_m-2×W_m-2+……+K_m-p×W_m-p+C_m，

计算得到m个函数值F₁……F_m，以最大函数值对应的地理群体表示其所属地理群体(也就是说如果F₁值最大，则判断该茎柔鱼是第1个地理群体；如果F₂值最大，则判断该茎柔鱼是第1个地理群体，……，如果F_m值最大，则判断该茎柔鱼是第m个地理群体。)。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(1)提取茎柔鱼肌肉脂肪酸包括以下步骤：

i.取样：漏斗锁软骨处剪取肌肉，用超纯水清洗样品表面，再去除皮肤，放入离心管中冷冻保存；

ii.冷冻干燥：将冷冻后的样品放入冷冻干燥机中，-50℃至-60℃冷冻干燥24-48小时；

iii.研磨：干燥后的样品研磨成粉末；

iv.提取脂肪酸：利用三氯甲烷-甲醇(体积比1.5-2.5:1)浸泡上述粉末20-40小时，离心，上清液用0.6-1.5％的氯化钠水溶液洗涤，静置1.5-2.5小时后分液，取下层溶液并除去其中的溶剂，得到的脂肪酸在0.3-0.6mol/L氢氧化钠-甲醇溶液中回流8-12min，再加入三氯化硼-甲醇溶液(10-20％三氯化硼的甲醇溶液)回流25-35min，最后加入正己烷回流1-3min，冷却后加入饱和氯化钠水溶液，混匀后静置20-30min，最后得到含有脂肪酸的正己烷上层。

在本发明的一个更优选实施方案中，步骤ii中，将冷冻后的样品放入冷冻干燥机中，-50℃冷冻干燥。

在本发明的一个更优选实施方案中，步骤iii中，干燥后的样品使用冷冻混合球磨仪MM400(Retsch，德国)

在本发明的一个更优选实施方案中，步骤iv中，所用三氯甲烷-甲醇中三氯甲烷和甲醇的体积比为2:1。在本发明的一个更优选实施方案中，氯化钠水溶液的质量浓度为0.9％。在本发明的一个更优选实施方案中，步骤iv中，氢氧化钠-甲醇溶液为0.5mol/L氢氧化钠的甲醇溶液。在本发明的一个更优选实施方案中，步骤iv中，三氯化硼-甲醇溶液为14％三氯化硼的甲醇溶液。

在本发明的一个更优选实施方案中，步骤iv中，上清液中加入0.9％的氯化钠水溶液静置2小时后分液。在本发明的一个更优选实施方案中，步骤iv中，得到的脂肪酸在氢氧化钠-甲醇溶液(0.5mol/L氢氧化钠的甲醇溶液)中回流10min。在本发明的一个更优选实施方案中，步骤iv中，加入三氯化硼-甲醇溶液(14％三氯化硼的甲醇溶液)回流30min。在本发明的一个更优选实施方案中，步骤iv中，加入正己烷回流2min。

在本发明的一个更优选实施方案中，步骤iv中氢氧化钠-甲醇溶液、三氯化硼-甲醇溶液和正己烷的用量，按体积比计，为1:1:1。

在本发明的一个更优选实施方案中，步骤(2)GC-MS测定脂肪酸利用含有脂肪酸的正己烷溶液，其中加入十九烷酸甲酯内标。

在本发明的一个更优选实施方案中，十九烷酸甲酯与正己烷溶液的体积比是1:1。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(2)GC-MS测定脂肪酸利用7890B/5977A气质联用仪(Agilent，美国)测定，色谱柱为HP-88(60m×0.25mm×0.20μm，Agilent，美国)，测样升温程序为初始125℃，以8℃/min升到145℃，保持26min，以2℃/min升到220℃，保持1min，再以1℃/min升到227℃，保持1min，进样口温度250℃，辅助加热器温度280℃，分流比10：1，载气为氦气。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(3)a采用Masshunter Work Station根据步骤(2)GC-MS测定的肌肉脂肪酸定量分析脂肪酸含量。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(4)使用SPSS软件对p种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量百分比进行线性判别分析。在本发明的一个更优选实施方案中，“使用SPSS软件对p种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量百分比进行线性判别分析”是通过将多个地理群体的n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量数据导入SPSS软件，选择“分析”工具中的“判别”，以地理群体作为分组变量，p种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量(W₁……W_p)作为自变量，“统计量”选项中的“函数系数”选择“Fisher”,“分类”选项中的“输出”模块选择“摘要表”，“图”模块选择“合并组”，其他均为默认设置，得到多个地理群体的p种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸的对应的判别系数和m个地理群体的常量。

在本发明的一个优选实施方案中，n-3和n-6系列不饱和脂肪酸为C18:2n6c、C18:2n6t、C18:3n3、C18:3n6、C20:3n3、C20:3n6、C20:4n6、C20:5n3、C22:2n6和C22:6n3。

本发明中，不同n-3和n-6系列不饱和脂肪酸的判别系数是不同的，并且不同地理群体的同一种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸也是不同的。本发明中“判别系数(K_1-1……K_1-p，K_2-1……K_2-p，K_m-1……K_m-p)”表示不同地理群体的不同n-3和n-6系列不饱和脂肪酸的判别系数。例如，“K_1-1”表示m个地理群体中的第1个地理群体茎柔鱼的p种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸中的第1种不饱和脂肪酸的判别系数，“K_m-p”表示m个地理群体中的第m个地理群体茎柔鱼的p种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸中的第p种不饱和脂肪酸的判别系数。

本发明中，“常量”对一个地理群体来说是不变的，m种地理群体具有m个常量。本发明中“常量(C₁……C_m)”表示m个地理群体的m个常量。例如，“C₁”表示m个地理群体中的第1个地理群体的常量，“C_m”表示m个地理群体中的第m个地理群体的常量。

本发明中，“判别函数值(F₁……F_m)”是由多种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量百分比乘以相应地理群体的判别系数得到的和再加上该地理群体的常量得到的，例如“F₁”是由多种(p种)n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量百分比乘以相应第1个地理群体的判别系数得到的和再加上第1个地理群体的的常量得到的。“F_m”是由多种(p种)n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量百分比乘以相应第m个地理群体的判别系数得到的和再加上第m个地理群体的的常量得到的。

本发明经过大量不同地理群体的茎柔鱼肌肉必需脂肪酸组成比对，创造了一种简单实用的方法，仅通过测量茎柔鱼肌肉必需脂肪酸组成，就能快速，准确地区分鉴别茎柔鱼的地理群体，准确率可高达96％。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一种利用肌肉必需脂肪酸组成区分茎柔鱼地理群体的方法，包括如下步骤：

随机采集来自3个已知地理区域的66尾茎柔鱼，分别为东太平洋赤道海域19尾(0°28'N～1°00'S、115°01'W～119°00'W)、秘鲁外海27尾(9°50'S～15°42'S、79°45'W～85°03'W)和智利外海20尾(37°06'S～38°00'S、79°01'W～83°00'W)。

(1)提取茎柔鱼肌肉脂肪酸：

i.取样：由胴体腹面剪开，在漏斗锁软骨处使用手术剪刀剪取2×2cm肌肉，用超纯水清洗样品表面，再使用镊子去除皮肤，放入10ml离心管中冷冻保存；

ii.冷冻干燥：将冷冻后的样品放入冷冻干燥机中，-55℃冷冻干燥30小时；

iii.研磨：干燥后的样品使用冷冻混合球磨仪MM400(Retsch，德国)研磨成粉末(如果不立即使用，该粉末可装入离心管中，使用真空压缩袋常温保存)；

iv.提取脂肪酸：

取0.2g粉末于15ml离心管中，

加12ml三氯甲烷-甲醇溶液(体积比2:1)，浸泡30小时，

离心后取上清液10ml，加入4ml的0.9％的氯化钠水溶液，静置2小时，

取下层溶液于圆底烧瓶中水浴加热得到脂肪酸，

在圆底烧瓶中加入4ml 0.5mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液，混合后连接水浴回流装置，水浴加热10min，

加入4ml三氯化硼甲醇溶液(14％三氯化硼的甲醇溶液)水浴回流30min，

加入4ml正己烷水浴回流萃取2min，

冷却后加入10ml氯化钠饱和水溶液，摇晃，再继续加入氯化钠饱和水溶液至烧瓶颈部，静置分层30min，分离得到含有脂肪酸的正己烷层(上层)4ml；

(2)利用GC-MS测定肌肉脂肪酸：

取1ml上层溶液用针式过滤器过滤置于进样瓶中，再加入1ml十九烷酸甲酯溶液，混合后进行GC-MS测定，利用7890B/5977A气质联用仪(Agilent，美国)，色谱柱为HP-88(60m×0.25mm×0.20μm，Agilent，美国)，测样升温程序为初始125℃，以8℃/min升到145℃，保持26min，以2℃/min升到220℃，保持1min，再以1℃/min升到227℃，保持1min，进样口温度250℃，辅助加热器温度280℃，分流比10:1，载气为氦气；

(3)分析肌肉脂肪酸数据

a.采用Masshunter Work Station定量分析脂肪酸含量，获得样品中n种脂肪酸的最终浓度(a₁……a_n)，根据公式a_n(mg/L)×稀释倍数×0.004L计算n种脂肪酸的含量；

b.各脂肪酸的含量除以总脂肪酸含量，计算出各脂肪酸所占含量百分比(表1)；

c.筛选出10种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸(C18:2n6c、C18:2n6t、C18:3n3、C18:3n6、C20:3n3、C20:3n6、C20:4n6、C20:5n3、C22:2n6和C22:6n3)的含量百分比作为该样品的必需脂肪酸分析结果；

表1茎柔鱼脂肪酸数据，其中n.d.表示未检测发现。

(4)计算多个地理群体的n-3和n-6系列不饱和脂肪酸的判别函数系数和常量：

a.以地理群体作为分组变量，10种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量(W₁……W>10)作为自变量，使用SPSS软件将已知来自3个地理群体的66尾茎柔鱼的10种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量百分比(W_1-1……W_1-10，W_2-1……W_2-10，W_3-1……W_3-10)进行线性判别分析；

进行线性判别分析的具体操作过程为：将3个地理群体的10种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量数据导入SPSS软件，选择“分析”工具中的“判别”，以地理群体作为分组变量，10种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量(W₁……W₁₀)作为自变量，“统计量”选项中的“函数系数”选择“Fisher”，“分类”选项中的“输出”模块选择“摘要表”，“图”模块选择“合并组”，其他均为默认设置；

b.分析得出3个地理群体茎柔鱼的10种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸的判别系数(K_1-1……K_1-10，K_2-1……K_2-10，K_3-1……K_3-10)和常量(C₁，C₂，C₃)，

其中东太平洋赤道海域的K_1-1至K_1-10分别为24.52、40.85、-23.51、15.89、12.29、-1.13、30.32、13.59、8.96、10.23)，常量C₁为-416.35；秘鲁外海的K_2-1至K_2-10分别为28.20、43.56、-6.51、14.06、6.16、9.51、19.12、11.17、4.88、9.67，常量C₂为-342.23；智利外海的K_3-1至K_3-10分别为14.59、68.39、-17.22、24.31、-11.64、6.49、25.86、11.52、4.96、10.96，常量C₃为-439.81；

3种地理群体茎柔鱼的10种n-3和n-6系列不饱和脂肪酸的判别系数(K_1-1至K_1-10，K_2-1至K_2-10，K_3-1至K_3-10)和常量(C₁，C₂，C₃)参见表2；

(5)为同时证明本发明的鉴别准确率，抓取24尾茎柔鱼(东太平洋赤道海域8尾，秘鲁外海8尾，智利外海8尾)，分别标记其实际地理群体后，再运用本发明的方法进行鉴别区分。利用上述步骤(1)-(3)得到24尾待判别的茎柔鱼肌肉n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量百分比(见表3)，利用每尾茎柔鱼n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量百分比和3个地理群体茎柔鱼的判别系数和常量计算得到3个函数值F₁、F₂和F₃，以最大函数值对应的地理群体表示其所属地理群体。也就是说，如果F₁值最大，则判断该茎柔鱼是东太平洋赤道海域群体；如果F₂值最大，则判断该茎柔鱼是秘鲁外海群体；如果F₃值最大，则判断该茎柔鱼是智利外海群体。

例如编号为1茎柔鱼的三个函数值的计算方法为：

函数值F₁＝1.37(W_1-1)×24.52(K_1-1)+1.76(W_1-2)×40.85(K_1-2)+0.39(W_1-3)×(-23.51)(K_1-3)+0.71(W_1-4)×15.89(K_1-4)+1.73(W_1-5)×12.29(K_1-5)+0.00(W_1-6)×(-1.13)(K_1-6)+4.88(W_1-7)×30.32(K_1-7)+8.11(W_1-8)×13.59(K_1-8)+2.04(W_1-9)×8.96(K_1-9)+39.60(W_1-10)×10.23(K_1-10)+(-416.35)(C₁)＝394.08

函数值F₂＝1.37(W_2-1)×28.20(K_2-1)+1.76(W_2-2)×43.56(K_2-2)+0.39(W_2-3)×(-6.51)(K_2-3)+0.71(W_2-4)×14.06(K_2-4)+1.73(W_2-5)×6.16(K_2-5)+0.00(W_2-6)×9.51(K_2-6)+4.88(W_2-7)×19.12(K_2-7)+8.11(W_2-8)×11.17(K_2-8)+2.04(W_2-9)×4.88(K_2-9)+39.60(W_2-10)×9.67(K_2-10)+(-342.23)(C₂)＝367.95

函数值F₃＝1.37(W_3-1)×14.59(K_3-1)+1.76(W_3-2)×68.39(K_3-2)+0.39(W_3-3)×(-17.22)(K_3-3)+0.71(W_3-4)×24.31(K_3-4)+1.73(W_3-5)×(-11.64)(K_3-5)+0.00(W_3-6)×6.49(K_3-6)+4.88(W_3-7)×25.86(K_3-7)+8.11(W_3-8)×11.52(K_3-8)+2.04(W_3-9)×4.96(K_3-9)+39.60(W_3-10)×10.96(K_3-10)+(-439.81)(C₃)＝354.71

对比编号为1茎柔鱼3个判别函数值可知，函数值F₁(394.08)>函数值F₂(367.95)>函数值F₃(354.71)，即1号茎柔鱼属于东太平洋赤道海域。

表2n-3和n-6系列不饱和脂肪酸、相应地理群体的判别系数和常量

从上述结果看，24只茎柔鱼，有23只茎柔鱼所属地理区域判别正确，判别准确率达96％。可见本发明的方法可以为渔业生产和管理机构提供快速、可靠的鉴别方法。所以，渔业生产者在销售或相关管理部门检测茎柔鱼时，只需要从大批量的茎柔鱼中测量其必需脂肪酸含量，即可判别其所属的地理群体。

已经根据本发明的优选生产形态通过实例对本发明进行了没有限制的描述，但是应当理解，在所附权利要求书定义的范围内，专家可以做变化和/或变型，而不脱离相关的保护范围。