FBN1基因在制备检测先天性单纯性晶状体异位制品中的应用

摘要

本发明的目的是提供一种FBN1基因在制备检测先天性单纯性晶状体异位诊断制品中的应用，本发明提供了FBN1基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行先天性单纯性晶状体异位疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行FBN1基因突变位点的快速检测。

说明书

技术领域

本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种原纤维蛋白1(FBN1)在制备检测先天性单纯性晶状体异位基因诊断制品中的应用。

发明背景

先天性单纯性晶状体异位以晶状体悬韧带部分或全部缺损或离断，引起对晶状体的悬挂力不平衡或丧失，导致晶状体离开正常的生理位置为特征。有较明显的遗传倾向，多为常染色体显性遗传，少数为常染色体隐性遗传，常为双眼对称性发病。根据悬韧带缺损或离断的程度(部分或完全)，晶状体异位分为不全脱位和全脱位。晶状体不全脱位产生的症状取决于晶状体移位的程度。如果晶状体的轴仍在视轴上，则仅出现由于悬韧带松弛、晶状体弯曲度增加引起的晶状体性近视。如果晶状体轴发生水平性、垂直性或斜性倾斜，可导致用眼镜或接触镜难以矫正的严重散光。更常见的不全脱位是晶状体纵向移位可出现单眼复视。晶状体全脱位比不全脱位后果更严重，晶状体完全离开瞳孔区后，视力相当于无晶状体眼视力，前房变深虹膜震颤，脱位的晶状体早期可随着体位的改变发生移动。如果晶状体脱入前房，则沉于变深的前房下方。晶状体通过瞳孔脱入前房过程中可发生瞳孔阻滞，引起急性青光眼。更常出现晶状体反复与角膜及虹膜睫状体接触引起严重的虹膜睫状体炎、角膜营养不良和急性青光眼。

晶状体异位的治疗是困难的。因为摘除异位的晶状体比一般白内障摘除风险大，盲目手术可能导致视力的损害甚至眼球的丧失。因此应慎重决定治疗方案。晶状体异位的治疗取决于晶状体的位置、晶状体的硬度、患眼的视力和对侧眼的视力、年龄、有无先天异常、有无出现并发症及手术的条件等。晶状体异位造成视力下降的原因是多方面的，如屈光间质混浊、继发性青光眼、先天性眼底异常等，因此晶状体摘除术后并不一定能改善视力。建立先天性单纯性晶状体异位的相关的基因突变检测系统，并应用于临床工作和优生优育，有助于遗传性先天性单纯性晶状体异位的基因诊断和相应的基因治疗，有助于突变基因携带者的检出，有助于通过产前检查降低疾病的发生率，有助于有效地控制这种疾病的发生。

发明内容

本发明的目的是提供一种FBN1基因在制备检测先天性单纯性晶状体异位诊断制品中的应用，从而弥补现有技术的不足。

申请人从一个4代呈常染色体显性遗传的先天性单纯性晶状体异位家系中，对该家系全部成员进行了FBN1基因的测序，找到了该家系的致病基因FBN1存在遗传上的致病突变，从而促成了本发明。

本发明首先提供FBN1基因新的用途，是在制备用于检测先天性单纯性晶状体异位诊断制品中的应用；

所述的检测，是用于检测FBN1基因上与先天性单纯性晶状体异位疾病相关的SNP位点，为FBN1基因c.2420(E21)至IVS20-8位的碱基。

上述的诊断制品，作为实施例的优选，是检测先天性单纯性晶状体异位的引物或探针。

所述的检测，是通过引物对扩增待检测的样品，进行测序确定是否存在上述的SNP位点；

所使用的引物对，其引物信息如下：

本发明还提供一种用于检测先天性单纯性晶状体异位的试剂盒，包含有上述的引物对中一种或以上。

其中用于检测上述SNP位点的引物信息如下：

FBN1-21-22F:AGCCCAGCTTTACTGTGTGGSEQ ID NO:39

FBN1-21-22R:TTTGACACTTCTTATTTCCCATTCSEQ ID NO:40。

本发明提供了FBN1基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行先天性单纯性晶状体异位疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行FBN1基因突变位点的快速检测。

附图说明

图1：实施例1的先天性单纯性晶状体异位家系内患者FBN1测序图，其中第一列：参考序列；第二列：先证者序列。该家系中6名患者FBN1基因c.2420(E21)至IVS20-8:缺失TCTGAAACA插入CGAAAC。

具体实施方式

申请人在一个先天性单纯性晶状体异位家系中发现FBN1基因的突变位点，并证实该基因的突变是该病的致病基因，从而促成了本发明。

FBN1基因位于染色体15q21.1，可转录成大约11695bp的mRNA(NCBI登录号为NM_000138)，直接翻译形成2871个氨基酸组成的蛋白质。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：从先天性单纯性晶状体异位家系中筛选FBN1基因的突变位点

1、提取外周血基因组DNA：

在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取家系成员外周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，加入等体积TE(pH8.0)，混匀，4℃，10000rpm离心10分钟，弃上清。

加入180μL TE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混匀，置于37℃水浴过夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚(约300μL)，充分混匀，室温下10000rpm离心10分钟，吸取上清液(约300μL)至一新离心管中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。

加入等体积的Tris饱和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。

加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(酚、氯仿、异戊醇各100μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。

加入l/10体积3mol/L、pH5.2醋酸钠(约30μL)，2倍体积预冷100％乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底，弃上清。

向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。

对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。

2、直接测序法寻找该家系内患者FBN1基因的突变

PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：

(1)PCR反应条件：94℃3min；94℃40sec，53℃40se，72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。

(2)反应体系：(TAKARA LA Taq polymerase)

应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与该FBN1引物的扩增反应。

PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，其中应用引物对

FBN1-21-22F:AGCCCAGCTTTACTGTGTGG，FBN1-21-22R:TTTGACACTTCTTATTTCCCATTC，在该家系中六名患者FBN1基因c.2420(E21)至IVS20-8:缺失TCTGAAACA插入CGAAAC(图1)。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。该突变为一新生突变。该突变不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)，表明该突变非常罕见，经预测该突变导致了FBN1蛋白长度截短，从而引起了患者先天性单纯性晶状体异位的发生。而在200例正常当地人群的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。

通过上述的分析，证明FBN1基因可以用来检测患者是否具有潜在患先天性单纯性晶状体异位的危险。通过将检测者的FBN1基因的各外显子片段于正常的对应片段比较，确定待检测者的患病风险。

根据FBN1的基因组序列设计扩增其各外显子的引物对，其正反引物的序列信息如下：

FBN1-2F:AGAAGGCGGGAGGAGCC

FBN1-2R:CTTGCCAAGGAGTCTTCCAC

FBN1-3F:TTGGCCATCTCTTCCTCTTC

FBN1-3R:GCCACATTCTAAGGCTCCC

FBN1-4F:ctcattTGAGGATTGGTCCC

FBN1-4R:TGCAGGAAAGAGGAAAGCC

FBN1-5F:CAACTCCTGTGAGCTGTTGC

FBN1-5R:GAAAATCCATCAGCACTTATCTC

FBN1-6F:TCCTTCCAGAGGACCACAAG

FBN1-6R:GTAGCCATGCAGACCCAATG

FBN1-7F:TTCCTCTGCATGATGGTTCC

FBN1-7R:TGGCTCTCCAGAGCAAATAAG

FBN1-8F:TGATGGACAAATAACTCACCG

FBN1-8R:TTCACAGGGATGACAAAGACAG

FBN1-9F:GAGTCCTTCTACTGACGAATGG

FBN1-9R:GAAAGTTGTTTGTTATGGAACTGAC

FBN1-10F:GAAGTATGGAGCTGCTCGG

FBN1-10R:GGCTTGTGAGGGCTGGG

FBN1-11F:ATGGGAATCCAGTCAGTTGG

FBN1-11R:TGCAATAGGAAAATTGAGACATAC

FBN1-12F:CCTCTTTCCTTTCTGATTCAAC

FBN1-12R:GCAATAGAAAACCAGTAGAGTCAAGG

FBN1-13F:GAAAGTCTTAGAATTATGAGGTATTGC

FBN1-13R:AACTCCTTTGAAGCCAACCC

FBN1-14F:AGTTTGCAAATGGAGGGAG

FBN1-14R:TCACTCATTATTTGGTCTTGTTAAAG

FBN1-15F:ATCCAGATTGGTTTCCTTCG

FBN1-15R:ACCTCTAAACAACATAAGGAGGAG

FBN1-16F:TCCTATCTTCCCCATTTTCAAG

FBN1-16R:CCATTGGGCTTTATTGAGTG

FBN1-17F:GCCCTCTTCAACTTTGACTTG

FBN1-17R:AAAGACCTCAATGGTGGCAG

FBN1-18F:AAGGGCAGGATCTACCTGTTC

FBN1-18R:ACCCACAAGAAAGCCTGATG

FBN1-19F:TCCTCCTGTAGCTCCTAAGGTC

FBN1-19R:AAGTGTCCATTTGCCCAGTC

FBN1-20F:AAGTAGATACAGGCAAAGTTTGGG

FBN1-20R:TGGCATAACTGTCTAAAATACAGGAG

FBN1-21-22F:AGCCCAGCTTTACTGTGTGG

FBN1-21-22R:TTTGACACTTCTTATTTCCCATTC

FBN1-23F:TGTCAGAACTGCAAAGTCTGG

FBN1-23R:TGACAGCTTTATCCAGTCCG

FBN1-24F:TTACCAGGTTCAAAATGGGG

FBN1-24R:TGTCTGTACCTGAAGCTAAGTGC

FBN1-25F:CAGAGTGTTGGCAGTTTGGG

FBN1-25R:CCATGCTGGGATGATCAAG

FBN1-26-27F:GAGACCTCCTGACTGCTTGC

FBN1-26-27R:CAGCAGGAAGAACCTGGAAC

FBN1-28-29F:GTCTGGTGGAGGAGATGAGG

FBN1-28-29R:TCAGAGTACATAGAGTGTTTTAGGGAG

FBN1-30F:GGCCCTGCCTCTTAAATAGTG

FBN1-30R:AAGCCTGCTTGACTCCAAAG

FBN1-31F:GGCTAAGTTTATTTGACTGCGG

FBN1-31R:TGGAATCTTTCTATCACTGACCC

FBN1-32F:CTAAACTCAGCATGGAGCCC

FBN1-32R:GAAGGGCCATGAATATTTGG

FBN1-33-34F:ATGGGAAGTTTGAAGGCAAG

FBN1-33-34R:TGAGAAATGTGGAATGCCTG

FBN1-35F:TTATGCCAAAACATTGCTGC

FBN1-35R:AAATGAAGCTAAAACACACCTCAG

FBN1-36F:GCCCAGATTGGTGTTAGATACTC

FBN1-36R:CTTGTGTAGTCCCAGGGAGG

FBN1-37F:TGATGTCTGCCTACACTGGC

FBN1-37R:GGTGCTGTTTTCAAAATAATACACAG

FBN1-38F:TGAACAGTTCCTGAAGTGGG

FBN1-38R:GAAAGGAGAACTGGCTGGAG

FBN1-39-40F:TCAGACGGGCAGAGTAACAAC

FBN1-39-40R:GGTTTTGCAGGTCAGTTCTTG

FBN1-41F:GGCCATTCCAAAATGTGAAG

FBN1-41R:TGAACTTGTGAGCTCTCTTCCTC

FBN1-42F:GATTTCCCACATGGCATCAC

FBN1-42R:TCGCTAAGACTGATTTCCCC

FBN1-43F:GACAAATACCTTTCAAGAATGCTTAC

FBN1-43R:GGTGTTTGCACAGTTTGTTTC

FBN1-44F:CCATCTTGTCTTACCCTGCAC

FBN1-44R:GCCAAGTGTGTATCAAGTAGCTC

FBN1-45F:GGCTTTGTTGACTGGACACC

FBN1-45R:TGAAAATATCTCATCCAGAAAGAGG

FBN1-46F:CTCCTGAGAATGATAGCTAGAAGTAAG

FBN1-46R:ATCCATATTTAGAATCAAATGAAGC

FBN1-47F:CCTGGTGAACCCTAAAATGC

FBN1-47R:GCACATTGTATTTGACAAGTCCC

FBN1-48F:TGCTGGGATTATGACATCTTTG

FBN1-48R:AGACTGCATGATTCCTTGAGTG

FBN1-49F:TTTGATGGAAGTCATGCCAG

FBN1-49R:CCTTGCATTTGTTTCTGATAAAG

FBN1-50F:CCCTTTGTGTGTCCACATTG

FBN1-50R:TCTTCCTGTTCACAAAGAAACAG

FBN1-51F:TTTGCTATGGTGCAATACGG

FBN1-51R:TTACATCATGGCCAGTCTGC

FBN1-52-53F:GCACAGCATGTAGCAATTTTC

FBN1-52-53R:AACTTATTTCAGTGCCATCTTGG

FBN1-54F:AACAAAATTACAGTTTAAAATCCTCTG

FBN1-54R:ATCAACCAATTGTTCCCAGG

FBN1-55F:GGTTCCCTTTTGTTGCTGTC

FBN1-55R:AGGGACATCTCCCCTCACAG

FBN1-56F:AGCAGAAGGAAATACAGCCAG

FBN1-56R:ATCCCAAGAACTCAGAGCCC

FBN1-57F:TCCATCCTCTATAAAATGGTCAG

FBN1-57R:AAGTCTGGGTTTCCAGCATC

FBN1-58F:TTCTCACCCAGGGTAAAGTG

FBN1-58R:GTGCAATTCAACCTAGGCAC

FBN1-59-60F:TTAGTATTTACACTGAAGTGACCCC

FBN1-59-60R:AATGCAGCCATGTGTCAGG

FBN1-61F:GCTTCCCTGATCCTGTTTTG

FBN1-61R:TCCCAACAGCAGAGGAAATAG

FBN1-62F:CTTATTTGGCCTTTTCCGAG

FBN1-62R:TGATGAAGGTGCCAATAGCC

FBN1-63F:AGAATCCATCTGGCTTCAGAG

FBN1-63R:AGCAAGCAGTGTTTTGCTTC

FBN1-64F:GGCCAGATCCAATGTCCTC

FBN1-64R:TCTGCTAGGACAGGTAATTTTGAG

FBN1-65F:ACCACCTACCTTGTCTTCCC

FBN1-65R:TGGAGGAAACCACAGGAATC

FBN1-66F:GCAGCATAAGGCAGAAAATTG

FBN1-66R:TGATATGATGATTCTGATTGGG

分别应用上述的每一对引物进行FBN1基因的检测。

另在山东地区收集诊断明确的先天性单纯性晶状体异位散发患者一名，提取其外周血基因组DNA，应用该患者的DNA模板与FBN1-21-22F和FBN1-21-22R引物进行PCR扩增，应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，该患者的FBN1基因存在本发明中发现的SNP突变，即FBN1基因c.2420(E21)至IVS20-8:缺失TCTGAAACA插入CGAAAC。通过上述的分析，证明FBN1基因可以用来检测患者是否具有潜在患先天性单纯性晶状体异位的危险。通过将检测者的FBN1基因的扩增片段于正常的对应片段比较，确定待检测者的患病风险。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省眼科研究所

<120> FBN1基因在制备检测先天性单纯性晶状体异位制品中的应用

<130>

<160> 116

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

agaaggcggg aggagcc 17

<210> 2

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<212> DNA

<213> 2

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cttgccaagg agtcttccac 20

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<211> 20

<212> DNA

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ttggccatct cttcctcttc 20

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<212> DNA

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gccacattct aaggctccc 19

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<212> DNA

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ctcatttgag gattggtccc 20

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<212> DNA

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tgcaggaaag aggaaagcc 19

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<211> 20

<212> DNA

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caactcctgt gagctgttgc 20

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<212> DNA

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<400> 8

gaaaatccat cagcacttat ctc 23

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<211> 20

<212> DNA

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tccttccaga ggaccacaag 20

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<211> 20

<212> DNA

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gtagccatgc agacccaatg 20

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<211> 20

<212> DNA

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ttcctctgca tgatggttcc 20

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<212> DNA

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tggctctcca gagcaaataa g 21

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<212> DNA

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tgatggacaa ataactcacc g 21

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<212> DNA

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<400> 14

ttcacaggga tgacaaagac ag 22

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<212> DNA

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<400> 15

gagtccttct actgacgaat gg 22

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<212> DNA

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gaaagttgtt tgttatggaa ctgac 25

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gaagtatgga gctgctcgg 19

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ggcttgtgag ggctggg 17

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<212> DNA

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atgggaatcc agtcagttgg 20

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<212> DNA

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tgcaatagga aaattgagac atac 24

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<212> DNA

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<400> 21

cctctttcct ttctgattca ac 22

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<212> DNA

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gcaatagaaa accagtagag tcaagg 26

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<212> DNA

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atccagattg gtttccttcg 20

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tcctatcttc cccattttca ag 22

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<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 34

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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gtctggtgga ggagatgagg 20

<210> 50

<211> 27

<212> DNA

<213> 50

<400> 50

tcagagtaca tagagtgttt tagggag 27

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 51

<400> 51

ggccctgcct cttaaatagt g 21

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 52

<400> 52

aagcctgctt gactccaaag 20

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 53

<400> 53

ggctaagttt atttgactgc gg 22

<210> 54

<211> 23

<212> DNA

<213> 54

<400> 54

tggaatcttt ctatcactga ccc 23

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 55

<400> 55

ctaaactcag catggagccc 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 56

<400> 56

gaagggccat gaatatttgg 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 57

<400> 57

atgggaagtt tgaaggcaag 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 58

<400> 58

tgagaaatgt ggaatgcctg 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 59

<400> 59

ttatgccaaa acattgctgc 20

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> 60

<400> 60

aaatgaagct aaaacacacc tcag 24

<210> 61

<211> 23

<212> DNA

<213> 61

<400> 61

gcccagattg gtgttagata ctc 23

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 62

<400> 62

cttgtgtagt cccagggagg 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 63

<400> 63

tgatgtctgc ctacactggc 20

<210> 64

<211> 26

<212> DNA

<213> 64

<400> 64

ggtgctgttt tcaaaataat acacag 26

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 65

<400> 65

tgaacagttc ctgaagtggg 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 66

<400> 66

gaaaggagaa ctggctggag 20

<210> 67

<211> 21

<212> DNA

<213> 67

<400> 67

tcagacgggc agagtaacaa c 21

<210> 68

<211> 21

<212> DNA

<213> 68

<400> 68

ggttttgcag gtcagttctt g 21

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 69

<400> 69

ggccattcca aaatgtgaag 20

<210> 70

<211> 23

<212> DNA

<213> 70

<400> 70

tgaacttgtg agctctcttc ctc 23

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 71

<400> 71

gatttcccac atggcatcac 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 72

<400> 72

tcgctaagac tgatttcccc 20

<210> 73

<211> 26

<212> DNA

<213> 73

<400> 73

gacaaatacc tttcaagaat gcttac 26

<210> 74

<211> 21

<212> DNA

<213> 74

<400> 74

ggtgtttgca cagtttgttt c 21

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 75

<400> 75

ccatcttgtc ttaccctgca c 21

<210> 76

<211> 23

<212> DNA

<213> 76

<400> 76

gccaagtgtg tatcaagtag ctc 23

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 77

<400> 77

ggctttgttg actggacacc 20

<210> 78

<211> 25

<212> DNA

<213> 78

<400> 78

tgaaaatatc tcatccagaa agagg 25

<210> 79

<211> 27

<212> DNA

<213> 79

<400> 79

ctcctgagaa tgatagctag aagtaag 27

<210> 80

<211> 25

<212> DNA

<213> 80

<400> 80

atccatattt agaatcaaat gaagc 25

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 81

<400> 81

cctggtgaac cctaaaatgc 20

<210> 82

<211> 23

<212> DNA

<213> 82

<400> 82

gcacattgta tttgacaagt ccc 23

<210> 83

<211> 22

<212> DNA

<213> 83

<400> 83

tgctgggatt atgacatctt tg 22

<210> 84

<211> 22

<212> DNA

<213> 84

<400> 84

agactgcatg attccttgag tg 22

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 85

<400> 85

tttgatggaa gtcatgccag 20

<210> 86

<211> 23

<212> DNA

<213> 86

<400> 86

ccttgcattt gtttctgata aag 23

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 87

<400> 87

ccctttgtgt gtccacattg 20

<210> 88

<211> 23

<212> DNA

<213> 88

<400> 88

tcttcctgtt cacaaagaaa cag 23

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 89

<400> 89

tttgctatgg tgcaatacgg 20

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 90

<400> 90

ttacatcatg gccagtctgc 20

<210> 91

<211> 21

<212> DNA

<213> 91

<400> 91

gcacagcatg tagcaatttt c 21

<210> 92

<211> 23

<212> DNA

<213> 92

<400> 92

aacttatttc agtgccatct tgg 23

<210> 93

<211> 27

<212> DNA

<213> 93

<400> 93

aacaaaatta cagtttaaaa tcctctg 27

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> 94

<400> 94

atcaaccaat tgttcccagg 20

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> 95

<400> 95

ggttcccttt tgttgctgtc 20

<210> 96

<211> 20

<212> DNA

<213> 96

<400> 96

agggacatct cccctcacag 20

<210> 97

<211> 21

<212> DNA

<213> 97

<400> 97

agcagaagga aatacagcca g 21

<210> 98

<211> 20

<212> DNA

<213> 98

<400> 98

atcccaagaa ctcagagccc 20

<210> 99

<211> 23

<212> DNA

<213> 99

<400> 99

tccatcctct ataaaatggt cag 23

<210> 100

<211> 20

<212> DNA

<213> 100

<400> 100

aagtctgggt ttccagcatc 20

<210> 101

<211> 20

<212> DNA

<213> 101

<400> 101

ttctcaccca gggtaaagtg 20

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> 102

<400> 102

gtgcaattca acctaggcac 20

<210> 103

<211> 25

<212> DNA

<213> 103

<400> 103

ttagtattta cactgaagtg acccc 25

<210> 104

<211> 19

<212> DNA

<213> 104

<400> 104

aatgcagcca tgtgtcagg 19

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> 105

<400> 105

gcttccctga tcctgttttg 20

<210> 106

<211> 21

<212> DNA

<213> 106

<400> 106

tcccaacagc agaggaaata g 21

<210> 107

<211> 20

<212> DNA

<213> 107

<400> 107

cttatttggc cttttccgag 20

<210> 108

<211> 20

<212> DNA

<213> 108

<400> 108

tgatgaaggt gccaatagcc 20

<210> 109

<211> 21

<212> DNA

<213> 109

<400> 109

agaatccatc tggcttcaga g 21

<210> 110

<211> 20

<212> DNA

<213> 110

<400> 110

agcaagcagt gttttgcttc 20

<210> 111

<211> 19

<212> DNA

<213> 111

<400> 111

ggccagatcc aatgtcctc 19

<210> 112

<211> 24

<212> DNA

<213> 112

<400> 112

tctgctagga caggtaattt tgag 24

<210> 113

<211> 20

<212> DNA

<213> 113

<400> 113

accacctacc ttgtcttccc 20

<210> 114

<211> 20

<212> DNA

<213> 114

<400> 114

tggaggaaac cacaggaatc 20

<210> 115

<211> 21

<212> DNA

<213> 115

<400> 115

gcagcataag gcagaaaatt g 21

<210> 116

<211> 22

<212> DNA

<213> 116

<400> 116

tgatatgatg attctgattg gg 22