一种可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的SNP标记及其应用

摘要

本发明公开了一种可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的SNP标记，所述SNP标记为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的第82位，其碱基为T/T、C/T或C/C。该SNP标记能鉴定乌鳢遗传性别和超雄鱼，还公开了可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的SNP标记的引物对，以及鉴定乌鳢遗传性别和超雄鱼的方法和SNP标记在乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定中的应用，该引物对能扩增待测样品的基因组DNA，可鉴定遗传性别，并将伪雌鱼与普通雄鱼后代家系中超雄鱼鉴定出来，该方法简单快速且准确率高。

说明书

技术领域

本发明属于鱼类性别分子鉴定技术领域，具体涉及一种可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的SNP标记及其应用。

背景技术

鳢是我国重要的淡水优质经济鱼类，具有骨刺少、肉鲜嫩、营养丰富的特点，有去瘀生新，滋补调养等功效，深受消费者喜爱，易于加工，是我国重要水产品之一，全国年产量超过51万吨，是我国第八大淡水养殖品种，每年苗种需求数十亿尾，市场巨大。鳢是存在显著雌雄二形性的鱼类，雄性个体生长速度是雌性的两倍，全雄鳢养殖将提高整体生长速度达30％，效益非常显著，同时促进鳢养殖产业转型升级，提质增效。所以市场迫切需求全雄苗种。而遗传性别鉴定是开展全雄鱼培育的关键技术，极大加快培育进程。

目前我国江南及华南地区主要养殖为杂交鳢，黄河及以北主要养殖乌鳢。以乌鳢为父本、斑鱧为母本的斑乌杂交鳢生长速度快、制种技术简单，苗种市场占有率大，是目前的主要养殖品种。培育超雄斑乌杂交鳢市场前景非常广阔。斑乌杂交鳢是以乌鳢为父本，所以筛选到乌鳢可直接用于伪雌鱼和超雄鱼鉴定的分子标记是技术关键，将加快全雄斑乌杂交鳢培育速度，具有巨大产业价值和科学价值。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的SNP标记，该SNP标记能鉴定乌鳢遗传性别和超雄鱼。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的SNP标记的引物对，该引物对能扩增待测样品的基因组DNA，可鉴定遗传性别，并将伪雌鱼与普通雄鱼后代家系中超雄鱼鉴定出来。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种鉴定乌鳢遗传性别和超雄鱼的方法，该方法简单快速且准确率高。

本发明所要解决的第四个技术问题是提供上述可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的SNP标记在乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定中的应用。

本发明所要解决的上述第一个技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的SNP标记，所述SNP标记为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的第82位，其碱基为T/T、C/T或C/C。

当碱基为T/T纯合子时，样品为雌性，当样品为C/T杂合时样品为雄性；以伪雌鱼和普通雄鱼繁殖后代中，基因型为T/T纯合时为雌性，C/T杂合时为雄性，C/C纯合时为雄性且为超雄鱼，其中伪雌鱼为雌激素性逆转，基因型为C/T杂合，普通雄鱼基因型为C/T杂合。

具体如下：

雌鱼：

CAGTGTGTGAGTTTGAGGATGTCAACAAATGCATAAAGTT/CGCATAAAAACTGCTGAGCTGGGCTCTTCGATGCAATCAGGT/TGCTGGTCTCAGCTCATATACTTG

雄鱼：

CAGTGTGTGAGTTTGAGGATGTCAACAAATGCATAAAGTT/CGCATAAAAACTGCTGAGCTGGGCTCTTCGATGCAATCAGGC/TGCTGGTCTCAGCTCATATACTTG

超雄鱼：

CAGTGTGTGAGTTTGAGGATGTCAACAAATGCATAAAGTT/CGCATAAAAACTGCTGAGCTGGGCTCTTCGATGCAATCAGGC/CGCTGGTCTCAGCTCATATACTTG

加粗斜体碱基为SNP位点，当碱基为T/T纯合子时，样品为雌性，当样品为C/T杂合时样品为雄性；以伪雌鱼(雌激素性逆转，基因型为C/T杂合)和普通雄鱼(C/T)繁殖后代中，基因型为T/T纯合时为雌性，C/T杂合时为雄性，C/C纯合时为雄性且为超雄鱼。

本发明的所要解决的上述第二个技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的SNP标记的引物对，其包括上游引物对F和下游引物对R，所述上游引物对F的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其下游引物对R的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

上游引物对F(Primer F)：5'AGTGTGTGAGTTTGAGGATGTC 3'；

下游引物对R(Primer R)：5'CAAGTATATGAGCTGAGACCAG 3'。

本发明的所要解决的上述第三个技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种鉴定乌鳢遗传性别和超雄鱼的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测乌鳢的基因组DNA；

(2)以待测乌鳢的基因组DNA为模板，利用上述上游引物对F和下游引物对R，进行PCR扩增反应和熔解曲线收集；

(3)反应完成后进行分析，确定样品基因型，鉴定性别。

在上述鉴定乌鳢遗传性别和超雄鱼的方法中：

步骤(2)中PCR扩增反应时采用的反应体系为20μL，包括：ABI Meltdoctor mix 10μL，primer F 0.6μL，primer R 0.6μL，DNA模板1μL，无菌水7.8μL。

步骤(2)中PCR扩增反应时PCR扩增程序为：50℃ 2min，95℃ 10min；然后进行40个循环，包括95℃15s，58℃ 1min；然后95℃解链15s，60℃ 1min后以0.3℃/s速度升温至95℃，同时收集荧光信号，最后60℃保持15s结束。

步骤(3)中利用HRM软件选择75℃～77.5℃区间进行熔解曲线分型分析，确定样品基因型，鉴定性别。

本发明的所要解决的上述第四个技术问题是通过如下技术方案来实现的：上述的可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的SNP标记在乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定中的应用。

本发明具有以下优点：

(1)利用本发明提供的引物扩增待测样品的基因组DNA，再通过基于荧光定量PCR仪的高分辨率熔解曲线分析，可鉴定遗传性别，基因型与表型的一致性为98％，家系中准确率100％，并能将伪雌鱼与普通雄鱼后代家系中超雄鱼鉴定出来；

(2)本发明鉴定方法整个检测过程可在一天内完成，简单快速且准确率高；

(3)本发明的SNP位点和检测方法是目前唯一能够对乌鳢同时进行普通性别鉴定和超雄鱼鉴定的分子标记方法。

附图说明

图1是实施例3中利用HRM软件对不同性别乌鳢进行基因分型。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供的可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的SNP标记，该SNP标记为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3(分别对应SNP标记1、SNP标记2、SNP标记3)所示的核苷酸序列的第82位，其碱基为T/T、C/T或C/C。

具体如下：

雌鱼：

CAGTGTGTGAGTTTGAGGATGTCAACAAATGCATAAAGTT/CGCATAAAAACTGCTGAGCTGGGCTCTTCGATGCAATCAGGT/TGCTGGTCTCAGCTCATATACTTG

雄鱼：

CAGTGTGTGAGTTTGAGGATGTCAACAAATGCATAAAGTT/CGCATAAAAACTGCTGAGCTGGGCTCTTCGATGCAATCAGGC/TGCTGGTCTCAGCTCATATACTTG

超雄鱼：

CAGTGTGTGAGTTTGAGGATGTCAACAAATGCATAAAGTT/CGCATAAAAACTGCTGAGCTGGGCTCTTCGATGCAATCAGGC/CGCTGGTCTCAGCTCATATACTTG。

加粗斜体碱基为SNP位点，当碱基为T/T纯合子时，样品为雌性，当样品为C/T杂合时样品为雄性；以伪雌鱼(雌激素性逆转，基因型为C/T杂合)和普通雄鱼(C/T)繁殖后代中，基因型为T/T纯合时为雌性，C/T杂合时为雄性，C/C纯合时为雄性且为超雄鱼。

实施例2

本实施例提供的可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的SNP标记的引物对，其包括上游引物对F和下游引物对R，其中上游引物对F的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，下游引物对R的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

具体为：

上游引物对F(Primer F)：5'AGTGTGTGAGTTTGAGGATGTC 3'；

下游引物对R(Primer R)：5'CAAGTATATGAGCTGAGACCAG 3'。

实施例3

本实施例提供的鉴定乌鳢遗传性别和超雄鱼的方法，包括以下步骤：

(1)样品DNA提取

提取样品的基因组DNA可以采用本领域的常规技术手段提取，包括酚-氯仿法和各种DNA提取试剂盒，提取总DNA后用无菌水稀释至20ngμL。

(2)利用以下引物扩增包含SNP位点的序列：

引物为(序列中下划线部分)：

Primer F：5'AGTGTGTGAGTTTGAGGATGTC 3'

Primer R：5'CAAGTATATGAGCTGAGACCAG 3'

扩增序列为：

雌鱼：

CAGTGTGTGAGTTTGAGGATGTCAACAAATGCATAAAGTT/CGCATAAAAACTGCTGAGCTGGGCTCTTCGATGCAATCAGGT/TGCTGGTCTCAGCTCATATACTTG

雄鱼：

CAGTGTGTGAGTTTGAGGATGTCAACAAATGCATAAAGTT/CGCATAAAAACTGCTGAGCTGGGCTCTTCGATGCAATCAGGC/TGCTGGTCTCAGCTCATATACTTG

超雄鱼：

CAGTGTGTGAGTTTGAGGATGTCAACAAATGCATAAAGTT/CGCATAAAAACTGCTGAGCTGGGCTCTTCGATGCAATCAGGC/CGCTGGTCTCAGCTCATATACTTG。

加粗斜体碱基为SNP位点，当碱基为T/T纯合子时，样品为雌性，当样品为C/T杂合时样品为雄性；以伪雌鱼(雌激素性逆转，基因型为C/T杂合)和普通雄鱼(C/T)繁殖后代中，基因型为T/T纯合时为雌性，C/T杂合时为雄性，C/C纯合时为雄性且为超雄鱼。

(3)PCR扩增和高分辨率熔解曲线分析

将样品DNA模板、Primer F、Primer R、meltdoctor master mix按说明书规定准备反应混合液，再将反应板在stepone plus实时定量PCR仪上进行扩增和熔解曲线收集，反应完成后利用HRM软件进行分析，确定样品基因型，从而鉴定性别。

其中PCR反应体系为20μL，包括：

ABI Meltdoctor mix 10μL，primer F 0.6μL，primer R 0.6μL，DNA模板1μL，无菌水7.8μL。反应在定量PCR专用96孔板中进行，高透光封板模覆盖密封。

扩增和检测条件为：

按上述反应体系配制好试剂后，将反应板置于ABI stepone plus实时定量PCR仪中，设置以下程序：50℃ 2min，95℃ 10min；然后进行40个循环，包括95℃ 15s，58℃ 1min；然后95℃解链15s，60℃ 1min后以0.3℃/s速度升温至95℃，同时收集荧光信号，最后60℃保持15s结束。

(4)使用仪器为ABI stepone plus进行PCR扩增和信号收集，反应结束后利用仪器软件stepone 2.3进行初步分析，保存文件；再利用ABI高分辨率熔解曲线分析软件HRM打开上述保存的文件，选择75℃～77.5℃区间进行熔解曲线分型。

结果：利用HRM分析后，样品的基因型即可鉴别，如图1中所示，其中variant 1为(T/C)杂合型，鉴定为雄鱼；variant 2为(TT)纯合型，鉴定为雌鱼，variant 3为(CC)纯合型，鉴定为超雄鱼。

应用实施例一

利用上述SNP标记的引物和检测方法对乌鳢100尾亲鱼(已繁殖，生理性别确定，其中雌鱼50尾，雄鱼50尾)进行性别验证。

(1)将试验鱼剪取鳍条提取基因组DNA

利用酒精消毒的剪刀剪取乌鳢部分尾鳍约0.5×0.5cm，放入无水乙醇保存，常温下带回实验室；将无水乙醇保存的鳍条样品用无菌双蒸水洗去酒精，利用omega动物组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA；提取的DNA经1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，NanoQ^TM微型分光光度计(博奥)检测浓度，并用去离子水稀释至终浓度20ng/μL。

(2)配制HRM分型反应混合液

ABI Meltdoctor mix 10μL，primer F 0.6μL，primer R 0.6μL，DNA模板1μL无菌水7.8μL。反应在ABI stepone plus定量PCR专用96孔板中进行，高透光封板模覆盖密封。

(3)上机检测

使用ABI stepone plus实时定量PCR仪，软件为stepone 2.3，参数按说明书设置，运行程序为50℃ 2min，95℃ 10min；然后进行40个循环，包括95℃ 15s，58℃ 1min；然后95℃解链15s，60℃ 1min后以0.3℃/s速度升温至95℃，同时收集荧光信号，最后60℃保持15s结束。

(4)结果

经过程序运行完毕后，利用stepone 2.3软件初步分析，保存文件。再将保存的文件用HRM3.0.1软件打开，选择温度区间进行分析，50尾雌性亲鱼个体中TT基因型50尾；50尾生理雄性个体中T/C基因型为48尾，TT型2尾。

应用实施例二

利用上述SNP标记的引物和检测方法对同一家系乌鳢200尾幼鱼(家系母本为雌激素性逆转鱼，且经鉴定为T/C基因型；父本为普通雄鱼，经鉴定为T/C基因型)，进行基因型鉴定。

(1)DNA提取、生理性别鉴定、PCR扩增及HRM分型方法均与应用实施例一相同。

(2)结果经过HRM软件分型，200尾个体中T/C基因型103尾，T/T基因型51尾；C/C基因型为46尾，符合后代中普通雄鱼、超雄鱼和雌鱼的2:1:1的预期，说明本发明的标记可同时用于三种鱼的鉴定。

上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。

〈110〉中国水产科学研究院珠江水产研究所

〈120〉一种可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的SNP标记及其应用

〈210〉1

〈211〉106

〈212〉DNA

〈223〉SNP标记1

〈400〉1

CAGTGTGTGA GTTTGAGGAT GTCAACAAAT GCATAAAGTT CGCATAAAAA CTGCTGAGCT 60

GGGCTCTTCG ATGCAATCAG GTTGCTGGTC TCAGCTCATA TACTTG 106

〈210〉2

〈211〉106

〈212〉DNA

〈223〉SNP标记2

〈400〉2

CAGTGTGTGA GTTTGAGGAT GTCAACAAAT GCATAAAGTT CGCATAAAAA CTGCTGAGCT 60

GGGCTCTTCG ATGCAATCAG GCTGCTGGTC TCAGCTCATA TACTTG 106

〈210〉3

〈211〉106

〈212〉DNA

〈223〉SNP标记3

〈400〉3

CAGTGTGTGA GTTTGAGGAT GTCAACAAAT GCATAAAGTT CGCATAAAAA CTGCTGAGCT 60

GGGCTCTTCG ATGCAATCAG GCCGCTGGTC TCAGCTCATA TACTTG 106

〈210〉4

〈211〉22

〈212〉DNA

〈223〉上游引物对F

〈400〉4

AGTGTGTGAG TTTGAGGATG TC 22

〈210〉5

〈211〉22

〈212〉DNA

〈223〉下游引物对R

〈400〉5

CAAGTATATG AGCTGAGACC AG 22