一种基于OCTS技术的前列腺癌CAR‑T治疗载体及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种基于OCTS技术的前列腺癌CAR‑T治疗载体，包括慢病毒骨架质粒、人EF1α启动子(SEQ ID NO.14)、OCTS嵌合受体结构域和PDL1单链抗体；OCTS嵌合受体结构域包括：CD8 leader嵌合受体信号肽(SEQ ID NO.15)、PSMA单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.16)、PSMA单链抗体重链VH(SEQ ID NO.17)、PDL1单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.18)、PDL1单链抗体重链VH(SEQ ID NO.19)、抗体内铰链Inner‑Linker(SEQ ID NO.20)、单链抗体间铰链Inter‑Linker(SEQ ID NO.21)、CD8 Hinge嵌合受体铰链(SEQ ID NO.22)、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区(SEQ ID NO.23)、TCR嵌合受体T细胞激活域(SEQ ID NO.26)以及嵌合受体共刺激因子区域。此外，本发明还公开了该载体的构建方法及其在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于医学生物领域，具体涉及一种载体，尤其涉及一种基于OCTS技术的前列腺癌CAR-T治疗载体。此外，本发明还涉及该载体的构建方法和应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。1950年代，Burnet和Thomas提出了“免疫监视”理论，认为机体中经常会出现的突变的肿瘤细胞可被免疫系统所识别而清除，为肿瘤免疫治疗奠定了理论基础[Burnet FM.Immunological aspects of malignant disease.Lancet,1967；1:1171-4]。随后，各种肿瘤免疫疗法包括细胞因子疗法、单克隆抗体疗法、过继免疫疗法、疫苗疗法等相继应用于临床。

2013年一种更先进的肿瘤免疫疗法---CAR-T疗法成功用于临床，并表现了前所未有的临床疗效。 CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。该疗法是通过转基因的手段，将启动子、抗原识别区、共刺激因子、效应区等共同组成的嵌合分子，导入T细胞基因组内，从而使T细胞对靶细胞的识别、信号转导、杀伤等功能融为一体，实现了对靶细胞的特异性杀伤[Eleanor J.Cheadle,etal.CAR T cells:driving the road from the laboratory to the clinic.Immunological Reviews 2014.Vol.257:91–106]。CAR-T疗法在临床上最领先的有诺华的CLT019，采用 CLT019治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者，六个月的肿瘤无进展生存率达到67％，其中最长的应答时间达到两年多。总部位于中国上海的上海优卡迪生物医药科技有限公司与医院合作，截止到2017年2月，共治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者36例，其中完全24例，缓解比例达到66.6％。这是抗癌研究的颠覆性突破。CAR-T细胞疗法可能是最有可能治愈癌症的手段之一，并被《Science》杂志评为2013年度十大科技突破之首。

CAR-T目前在治疗B-淋巴细胞白血病等几种类型的血液肿瘤方面疗效显著，但是也存在一些局限性，目前一个嵌合抗原受体只能识别一种抗原靶标，肿瘤细胞是个复杂的群体，含有相应抗原的肿瘤细胞被清除以后，不含相应抗原的肿瘤细胞会迅速增殖，一段时间后导致肿瘤复发。那么要使CAR-T识别能同时识别两种抗原，就有两个方案可选：一是将两组嵌合抗原受体构建进入一个慢病毒转基因载体，一次性将两组嵌合抗原受体转导进入原代T淋巴细胞；二是用两个慢病毒转基因载体分两次转导，将两组嵌合抗原受体分别转导进入原代T淋巴细胞。

方案一的缺点在于占用慢病毒转基因载体的宝贵容量，不利于装载其它功能元件；转基因载体包装效率低；基因转导效率非常低，很难转导进入原代T淋巴细胞内。

方案二的缺点在于需要经过两次转导，两次转导的综合效率较低，转导周期时间长，原代细胞容易衰老，导致增殖能力衰退，杀伤功能下降，影响肿瘤清除疗效。

PSMA在前腺癌中具有特异的高度表达。在用7El l-C5所检测的所有184份前列腺标本中，Bostwick等 [Bostwick DG，Pacelli A，Blute M，et al.Prostate specificmembrane antigen expression in prostatic intraepithelial neoplasia andadenocarcinoma.Cancer.1998；82(11)：2256-2261]从中均发现了阳性免疫反应，良性上皮组织和前列腺癌高度恶性细胞，阳性率分别为69.5％和80.2％，其中在癌组织中染色强度最强，他们还在另外200份前列腺标本的队列研究中也获得了类似结果。

PD-L1在多数癌症组织中过量表达，包括NSCLC、黑色素瘤、乳腺癌、胶质瘤、淋巴瘤、白血病及各种泌尿系肿瘤、消化道肿瘤、生殖系肿瘤等[Intlekofer AM,ThompsonCB.At the bench:preclinical rationale for CTLA-4 and PD-1 blockade as cancerimmunotherapy[J].J Leukoc Biol,2013,94(1):25-39.].Parsa在鼠和人的肿瘤细胞中，发现T细胞异常分泌的IFN-γ，IFN-γ可以诱导肿瘤细胞上的PD-L1高表达[Ding H,Wu X,Wu J,et al.Delivering PD-1 inhibitory signal concomitant with blocking ICOSco-stimulation suppresses lupus-like syndrome in autoimmune BXSB mice[J].ClinImmunol,2006,118(2/3):258-267.]。PD-L1高表达，可以通过抑制RAS及PI3K/AKT信号通路，进而调控细胞周期检查点蛋白和细胞增殖相关蛋白表达，最终导致T细胞增殖的抑制[11]。Dong等体外实验和小鼠模型还发现，PD-1/PD-L1信号通路的激活可以诱导特异性CTL调亡，使CTL的细胞毒杀伤效应敏感性下降，促使肿瘤细胞发生免疫逃逸[Dong H,StromeSE,Salomao DR,et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis:apotential mechanism of immune evasion[J].Nat Med,2002,8(8):793-800.]。

目前，尚未有克服上述缺点针对PSMA、PD-L1两种抗原的CAR-T治疗的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种基于OCTS技术的前列腺癌CAR-T治疗载体。首先，其仅需要一次转导，转导效率高，不影响CAR-T治疗的疗效；其次，其不占用慢病毒转基因载体的宝贵容量，利于装载其它功能元件。第三，能有效封闭PDL1，阻断免疫负调节信号通路，临床上可用于抑制肿瘤的免疫逃脱，提高CAR-T细胞免疫治疗的疗效。

本发明要解决的技术问题之二是提供该载体的构建方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供该载体的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供一种基于OCTS技术的前列腺癌CAR-T治疗载体，包括慢病毒骨架质粒、人 EF1α启动子、OCTS嵌合受体结构域和PDL1单链抗体；

所述慢病毒骨架质粒包括：用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQ ID NO.1 所示；用于质粒复制的原核复制子pUC Ori序列，如SEQ ID NO.2所示；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40 Ori序列，如SEQ ID NO.3所示；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；ZsGreen1绿色荧光蛋白，如SEQ ID NO.11所示；IRES核糖体结合序列，如SEQ ID NO.12所示；用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如SEQ ID NO.13所示；

所述人EF1α启动子的序列如SEQ ID NO.14所示；

所述OCTS嵌合受体结构域包括：如SEQ ID NO.15所示的CD8 leader嵌合受体信号肽、如SEQ ID NO.16 所示的PSMA单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.17所示的PSMA单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.18所示的PDL1单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.19所示的PDL1单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.20所示的抗体内铰链Inner-Linker、如SEQ ID NO.21所示的单链抗体间铰链Inter-Linker、如SEQ ID NO.22所示的CD8 Hinge嵌合受体铰链、如SEQ ID NO.23所示的CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、如SEQ ID NO.26所示的TCR嵌合受体T细胞激活域以及嵌合受体共刺激因子区域；所述嵌合受体共刺激因子区域选自4-1BB、ICOS、CD27、OX40、CD28、MYD88、IL1R1、CD70、TNFRSF19L、TNFRSF27、TNFRSF1OD、TNFRSF13B、 TNFRSF18、CD134等肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF)中的任意一种或多种的组合。

所述慢病毒包装顺式元件可以采用第二代慢病毒载体，也可以采用第三代慢病毒载体。所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体包括：如SEQ ID NO.5所示的慢病毒5terminal LTR、如SEQ ID NO.6 所示的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQID NO.7所示的Gag顺式元件、如SEQ ID NO.8 所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.9所示的env顺式元件、如SEQ ID NO.10所示的cPPT顺式元件。所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体包括：如SEQ ID NO.5所示的慢病毒5terminal LTR、如SEQ ID NO.6所示的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag顺式元件、如SEQ IDNO.8所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.9所示的env顺式元件、如SEQ ID NO.10所示的cPPT顺式元件，以及如SEQ ID NO.4所示的RSV启动子。本发明优选采用第三代慢病毒载体。

优选的，所述如SEQ ID NO.16所示的PSMA单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.17所示的PSMA单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.18所示的PDL1单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.19所示的PDL1单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.20所示的抗体内铰链Inner-Linker、如SEQ IDNO.21所示的单链抗体间铰链 Inter-Linker采用串联连接方式或者转角连接方式；所述串联连接方式具体为：PDL1单链抗体轻链VL 与PSMA单链抗体轻链VL采用单链抗体间铰链Inter-Linker连接，PDL1单链抗体轻链VL与PDL1单链抗体重链VH采用抗体内铰链Inner-Linker连接，PSMA单链抗体轻链VL与PSMA单链抗体重链VH 采用抗体内铰链Inner-Linker连接，即pOCTS-PDL1PSMAs(见图4A和图4C)；所述转角连接方式具体为： PSMA单链抗体轻链VL与PSMA单链抗体重链VH采用抗体内铰链Inner-Linker连接，PDL1单链抗体轻链VL与PSMA单链抗体重链VH采用单链抗体间铰链Inter-Linker连接，PDL1单链抗体重链VH与 PSMA单链抗体轻链VL采用单链抗体间铰链Inter-Linker连接，即pOCTS-PDL1PSMAt(见图4B和图4C)。

优选的，所述PDL1单链抗体的序列如SEQ ID NO.27所示。

优选的，所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变，具体为： g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。

优选的，由所述人EF1α启动子启动整个OCTS结构基因表达，所述CD8 leader嵌合受体信号肽位于OCTS编码序列的N端，用于引导OCTS蛋白定位于细胞膜；所述PSMA单链抗体轻链VL、PSMA单链抗体重链VH、PDL1单链抗体轻链VL、PDL1单链抗体重链VH这两组单链抗体组合成双抗原识别区，用于识别相应靶抗原；所述CD8Hinge嵌合受体铰链用于将scFv锚定于细胞膜外侧；所述CD8 Transmembrane 嵌合受体跨膜区用于将整个嵌合受体固定于细胞膜上；所述CD28嵌合受体共刺激因子用于刺激T淋巴细胞体外激活和体内肿瘤细胞杀伤作用；所述CD134嵌合受体共刺激因子用于促进T淋巴细胞增殖和因子分泌，增强肿瘤免疫，有利于记忆T细胞的长期存活；所述TCR嵌合受体T细胞激活域用于激活下游信号通路的表达；所述PDL1单链抗体，能有效封闭PDL1，阻断免疫负调节信号通路，临床上可用于抑制肿瘤的免疫逃脱，提高CAR-T细胞免疫治疗的疗效；当抗原识别区域与靶抗原结合时，信号通过嵌合受体传递至细胞内，从而产生T细胞增殖、细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟、裂解靶细胞等一系列生物学效应。

优选的，所述嵌合受体共刺激因子区域采用如SEQ ID NO.24所示的CD28嵌合受体共刺激因子以及如SEQ ID NO.25所示的CD134嵌合受体共刺激因子组合。

优选的，所述的PDL1单链抗体轻链VL、PDL1单链抗体重链VH、PDL1单链抗体均经过人源化改造。

在本发明的第二方面，提供一种上述基于OCTS技术的前列腺癌CAR-T治疗载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)将如SEQ ID NO.1所示的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、如SEQ ID NO.2所示的原核复制子 pUC Ori序列、如SEQ ID NO.3所示的病毒复制子SV40Ori序列、用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件、如SEQ ID NO.11所示的ZsGreen1绿色荧光蛋白、如SEQ IDNO.12所示的IRES核糖体结合序列、如SEQ ID NO.13所示的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件存储于慢病毒骨架质粒上；

(2)将如SEQ ID NO.14所示的人EF1α启动子、所述OCTS嵌合受体结构域以及如SEQID NO.27所示的PDL1单链抗体组合成OCTS嵌合受体设计方案，经过酶切、连接、重组反应克隆至慢病毒骨架质粒中，得到第三代OCTS设计的重组慢病毒质粒；

(3)将得到的重组慢病毒质粒分别与慢病毒包装质粒pPac-GP、pPac-R以及膜蛋白质粒pEnv-G共同转染HEK293T/17细胞，在HEK293T/17细胞中进行基因转录表达后，包装成功重组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中，收集包含的重组慢病毒载体的上清液；

(4)将得到的重组慢病毒上清采用抽滤、吸附、洗脱的柱纯化方式进行纯化，分别得到重组慢病毒载体。

优选的，步骤(4)中，所述抽滤步骤要控制上清体积在200ml～2000ml，控制真空度在-0.5MPA～-0.9MPA，防止由于堵孔带来的载体损失；所述吸附步骤要控制溶液的PH值在6～8，防止PH的变化导致载体失活；所述洗脱步骤要控制洗脱液的离子强度在0.5M～1.0M，防止离子强度的变化导致洗脱不完全或者载体失活。

在本发明的第三方面，提供所述的载体在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明所采用的OCTS-CAR-T技术，是在目前传统CAR-T细胞治疗的基础上，通过对嵌合抗原受体(CAR) 结构的优化改造，使得嵌合抗原受体能够识别两种抗原，大大拓展了CAR-T细胞的识别范围，针对肿瘤群体的清除更彻底，疗效更持久；避免分批培养CAR-T细胞，大大节约成本；避免患者多次回输不同靶向CAR-T 细胞，节约了患者的经济支出，降低复发的几率，间接提高患者生存质量。仅需要一次转导，转导效率高，不影响CAR-T治疗的疗效；不占用慢病毒转基因载体的宝贵容量，利于装载其它功能元件，转基因载体包装效率高，基因转导效率高。

OCTS的全称是One CAR with Two ScFvs，通过串联OCTS(Series OCTS)或者转角OCTS(Turn OCTS) 的连接方式，将两段scFv与整合成一个嵌合分子(如图1所示)，赋予T淋巴细胞HLA非依赖的方式识别两种肿瘤抗原的能力，相对于传统的CAR-T细胞能够识别更广泛的目标，进一步扩大了肿瘤细胞的清除范围。OCTS的基础设计中包括两个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区，两个胞内信号转导区和一个效应元件区。scFv区域对于OCTS的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来说是关键的决定因素。随着OCTS-CAR-T的即将进入临床研究阶段标志着CAR-T细胞治疗即将进入2.0时代。

本发明所采用的载体骨架可以应用于第三代慢病毒载体结构上，也可以应用于第二代慢病毒载体结构上。第二代和第三代慢病毒载体在结构上的区别如图2B所示。本发明优选第三代慢病毒载体(如图2A所示)，3’SIN LTR去除了U3区域，消除了慢病毒载体自我复制的可能性，大大提高了安全性；增加了 cPPT和WPRE元件，提高了转导效率和转基因的表达效率；采用RSV启动子保证了慢病毒载体包装时核心 RNA的持续高效转录；采用人自身的EF1α启动子，使CAR基因能够在人体内长时间持续表达。

本发明所述的PDL1单链抗体轻链VL、PDL1单链抗体重链VH、PDL1单链抗体均经过人源化改造，能有有效减少体内人抗鼠抗(Human anti-mouse antibodies，HAMA)的产生，延长scFv的半衰期和作用效果，增加OCTS-CAR-T细胞的存在时间。

本发明中使用的共刺激因子的一种或若干种组合，能够增加转导后细胞的增殖速率、存活时间、杀伤效率、免疫记忆等特性。

本发明采用的OCTS-CAR-T细胞由GMP级别的车间生产后，可用于人体临床实验。

本发明的重组慢病毒载体可以实现在人T淋巴细胞上表达PSMA、PDL1等组合的双靶向嵌合抗原受体，引导并激活T淋巴细胞对PSMA、PDL1等阳性细胞的杀伤作用，在临床上可用于前列腺癌、黑色素瘤、子宫内膜癌等恶性肿瘤的治疗。

本发明通过重组慢病毒载体骨架、OCTS结构域、PD1配体(PD-L1)的single chainantibody(单链抗体)构建形成重组慢病毒载体，该方式得到的重组慢病毒载体可以实现在人T淋巴细胞内表达细胞程式死亡配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PDL1)的单链抗体，能有效封闭PDL1，阻断免疫负调节信号通路，临床上可用于抑制肿瘤的免疫逃脱，提高CAR-T细胞免疫治疗的疗效。

可见，本发明所述的OCTS-CAR-T细胞将给肿瘤细胞治疗提供可靠的保障。

附图说明

图1是本发明所述的OCTS嵌合受体的示意图，包含了串联OCTS(Series OCTS)和转角OCTS(Turn OCTS) 示意图；

图2本发明所述的慢病毒载体结构示意图；其中图2A是本发明采用的第三代慢病毒载体结构示意图，图2B是第二代和第三代慢病毒载体结构比较示意图；

图3为本发明实施例1中构建本发明所述的重组慢病毒载体的构建流程图。其中，(A)图是慢病毒骨架质粒pLenti-3G basic的结构示意图；(B)图是2个OCTS质粒的示意图；(C)图是pPac-GP质粒的结构示意图；(D)图是pPac-R质粒的结构示意图；(E)图是pEnv-G包装质粒的结构示意图；

图4是本发明实施例1中OCTS结构的元件顺序示意图，其中，A图是串联OCTS(Series OCTS)的结构示意图，B图是转角OCTS(Turn OCTS)的结构示意图，C图是OCTS结构的质粒编号(OCTS Symbol)的列表示意图；

图5是本发明实施例1中重组慢病毒质粒pOCTS-PDL1PSMAs、pOCTS-PDL1PSMAt的酶切预测及酶切琼脂糖凝胶电泳图；其中图5A是pOCTS-PDL1PSMAs的酶切预测示意图，图5B是pOCTS-PDL1PSMAs 的酶切琼脂糖凝胶电泳图；图5C是pOCTS-PDL1PSMAt的酶切预测示意图，图5D是pOCTS-PDL1PSMAt 的酶切琼脂糖凝胶电泳图；图5A中的lane1是1kb DNA ladderMarker：条带从上到下依次为：10kb、8kb、 6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；图5A中的lane2是 pOCTS-PDL1PSMAs的Sac II酶切预测：条带从上到下依次为：7158bp、2437bp、1863bp、557bp；图5B 中的lane1是1kb DNA ladder Marker的电泳结果；图5B中的lane2是pOCTS-PDL1PSMAs的Sac II酶切电泳结果；图5C中的lane1是1kb DNA ladder Marker：条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、 3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；图5C中的lane2是pOCTS-PDL1PSMAt 的EcoR I酶切预测：条带从上到下依次为：8988bp、1934bp、1355bp；图5D中的lane1是1kb DNAladder Marker的电泳结果；图5D中的lane2是pOCTS-PDL1PSMAt的EcoR I酶切电泳结果；

图6是本发明实施例1中重组慢病毒载体的滴度检测结果示意图；

图7为本发明实施例1中所述的OCTS-CAR-T细胞构建的步骤流程图，包含分离培养、激活、基因转导、OCTS-CAR-T细胞鉴定等阶段；

图8是本发明实施例2中OCTS-CAR-T细胞的支原体检测结果示意图，其中，lane1为DL2000marker，从上到下条带条带从上到下依次为：2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；lane2为阳性对照；lane3 为阴性对照；lane4为PBS；lane5为裂解液；lane6为OCTS-PDL1PSMAs-CAR-T细胞；lane7为 OCTS-PDL1PSMAt-CAR-T细胞；

图9为本发明实施例2中流式检测OCTS-CAR-T细胞的转导效率以及免疫分型结果示意图；其中，图 9A表示OCTS-PDL1PSMAs-CAR-T细胞的转导效率结果；图9B表示OCTS-PDL1PSMAs-CAR-T细胞的免疫分型结果；图9C表示OCTS-PDL1PSMAt-CAR-T细胞的转导效率结果；图9D表示 OCTS-PDL1PSMAt-CAR-T细胞的免疫分型结果；

图10为本发明实施例3中不同效靶比条件下，OCTS-PDL1PSMAs-CAR-T细胞和OCTS-PDL1PSMAt-CAR-T细胞对不同靶细胞的杀伤结果比较示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。材料

1、慢病毒骨架质粒pLenti-3G basic，慢病毒包装质粒pPac-GP、pPac-R以及膜蛋白质粒pEnv-G，HEK293T/17 细胞，同源重组酶，Oligo Annealing Buffer，支原体检测试剂盒，内毒素检测试剂盒，PSMA⁺K562、>+K562、PDL1⁺PSMA⁺K562、K562细胞购自世翱(上海)生物医药科技有限公司；慢病毒骨架质粒>

2、人新鲜外周血由健康供者提供；

3、OCTS-PDL1PSMAs、OCTS-PDL1PSMAtDNA序列组合由上海优卡迪公司设计(参见图4C)，交给上海捷瑞生物工程有限公司合成，并以寡核苷酸干粉或者质粒形式保存；

4、工具酶Cla I、EcoR I、Sac II、T4DNA连接酶均购自NEB公司；

5、0.22μm-0.8μm PES滤器购自millipore公司；

6、D-PBS(-)、0.4％台盼蓝、筛网、各类型细胞培养皿、培养袋、培养板均购自corning公司；

7、Opti-MEM、Pen-Srep、Hepes、FBS、AIM-V、RPMI 1640、DMEM、lipofectamine 3000购自invitrogen 公司；

8、Biotinylated protein L购自GeneScript公司；

9、LDH检测试剂盒购自promega公司；

10、Ficoll淋巴细胞分离液购自GE公司；

11、20％人血白蛋白注射液购自杰特贝林公司；

12、CryoPremium冻存液、分选缓冲液来自上海优卡迪公司；

13、rIL-2，rIL-7，，rIL-15，rIL-21购自peprotech公司；

14、CD3单克隆抗体，CD28单克隆抗体，CD3/CD28磁珠CD4/CD8磁珠购自德国Miltenyi公司；

15、冷冻离心机(美国ThermoScientific公司；

16、FACS流式细胞仪购自Thermo公司；

17、荧光倒置显微镜购自Olympus公司；

18、CD4-FITC、CD8-APC购自BioLegend公司；

19、0.9％生理盐水购自今迈公司；

20、ProteinL Magnetic Beads购自BioVision公司；

21、PrimeSTAR、RetroNectin购自Takara公司；

22、phycoerythrin(PE)-conjugated streptavidin购自BD Bioscience公司；

23、质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自MN公司；

24、感受态细胞TOP10购自tiangen公司；

25、NaCl、KCl、Na₂HPO₄.12H₂O、KH₂PO₄、Trypsin、EDTA、CaCl₂、NaOH、PEG6000均购自上海生工；

26、DNeasy试剂盒购自上海捷瑞公司；

27、SA-HRP购自上海翊圣公司；

28、引物：根据引物设计原则设计扩增DNA片段和靶位点所需的引物，该引物由上海生物公司合成，具体为：

EF1α-F：5’-ATTCAAAATTTTATCGATGCTCCGGTGCCCGTCAGT-3’(SEQ ID NO.28)

EF1α-R：5’-TCACGACACCTGAAATGGAAGA-3’(SEQ ID NO.29)

OCTS-F：CATTTCAGGTGTCGTGAGGATCCGCCACCATGGCGCTGCCGGTGAC(SEQ ID NO.30)

OCTS-R：GGGGAGGGAGAGGGGCTTAGCGCGGCGGCAGCG(SEQ ID NO.31)

IRES-F：GCCCCTCTCCCTCCCCC(SEQ ID NO.32)

IRES-R：ATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAA(SEQ ID NO.33)

PDL1scab-F：AAAACACGATGATAATGCCACCATGAACTCCTTCTCCACAAGCG(SEQ ID NO.34)

PDL1scab-R：AATCCAGAGGTTGATTGTCGACGAATTCTCATTTGCCCGGGCTCAG(SEQ IDNO.35)

WPRE-QPCR-F：5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’(SEQ ID NO.36)

WPRE-QPCR-R：5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’(SEQ ID NO.37)

Actin-QPCR-F：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’(SEQ ID NO.38)

Actin-QPCR-R：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(SEQ ID NO.39)

29、本发明中，所述SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQID NO.5，SEQ ID NO.6， SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ IDNO.11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO.13， SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.16，SEQ IDNO.17，SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.20， SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.22，SEQID NO.23，SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.25，SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.27 所示DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司根据本发明人提供的序列合成。

实施例1 OCTS-CAR-T细胞构建

一、重组慢病毒载体lvOCTS-PDL1PSMAs、lvOCTS-PDL1PSMAt的构建、纯化、检测方法。

参见图3，本发明所述重组慢病毒载体的构建方法如下：

1、将人EF1α启动子(SEQ ID NO.14)、OCTS结构【OCTS-PDL1PSMAs、OCTS-PDL1PSMAt】(CD8 leader 嵌合受体信号肽(SEQ ID NO.15)、PSMA单链抗体轻链VL(SEQ IDNO.16)、PSMA单链抗体重链VH(SEQ ID NO.17)、PDL1单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.18)、PDL1单链抗体重链VH(SEQ ID NO.19)、抗体内铰链Inner-Linker(SEQ ID NO.20)、单链抗体间铰链Inter-Linker(SEQ ID NO.21)、CD8Hinge嵌合受体铰链(SEQ ID NO.22)、CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区(SEQ ID NO.23)、CD28嵌合受体共刺激因子 (SEQ IDNO.24)、CD134嵌合受体共刺激因子(SEQ ID NO.25)、TCR嵌合受体T细胞激活域(SEQ IDNO.26))、 PDL1单链抗体(SEQ ID NO.27)组合成OCTS嵌合受体设计方案，经过酶切、连接、重组反应克隆至慢病毒骨架质粒pLenti-3G basic中，分别得到重组慢病毒质粒pOCTS-PDL1PSMAs、pOCTS-PDL1PSMAt，元件顺序和编号如图4所示。

(1)将慢病毒骨架质粒pLenti-3G basic使用Cla I和EcoR I限制性内切酶进行双酶切，产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认5823bp的片段V1，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；

1、溶胶按200μl NTI/100mg gel比例加入溶胶液，50℃水浴放置5-10分钟。2、结合DNA11000g离心30秒，弃去滤液。3、洗膜加入700μl NT3，11000g离心30秒，弃去滤液。4、洗膜重复第三步一次5、晾干11000g离心1分钟，换新的收集管，室温放置1分钟。6、洗脱DNA加入15-30μl NE，室温放置1分钟，11000g离心1分钟，收集滤液。

表1琼脂糖凝胶回收步骤

(2)用引物EF1α-F和EF1α-R以合成的人EF1α启动子(SEQ ID NO.14)为模板，使用表2中的体系， PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1208bp的片段a，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；

表2 50μl PCR反应体系

(3)用引物OCTS-F和OCTS-R以合成的OCTS-PDL1PSMAs为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2352bp的片段b，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；

(4)用引物OCTS-F和OCTS-R以合成的OCTS-PDL1PSMAt为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2406bp的片段c，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；

(5)用引物IRES-F和IRES-R以合成的IRES核糖体结合序列(SEQ ID NO.12)为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认575bp的片段d，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；

(6)用引物PDL1scab-F和PDL1scab-R以合成的PDL1单链抗体(SEQ ID NO.27)为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1557bp的片段e，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；

(7)将重组慢病毒质粒DNA片段组合(见表3)以5μl总体积且摩尔比1:1:1:1的比例加入Eppendorf管内，加入同源重组酶反应液15μl，混匀后在42℃孵育30分钟，转移至冰上放置2-3分钟，将反应液加入 50μl TOP10中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟，将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏，取100μl的转化菌液涂布于Amp LB琼脂平板上，倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。

重组慢病毒质粒片段组合pOCTS-PDL1PSMAsa、b、d、epOCTS-PDL1PSMAta、c、d、e

表3重组慢病毒质粒DNA片段组合

挑取克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的克隆即为重组慢病毒质粒pOCTS-PDL1PSMAs、pOCTS-PDL1PSMAt，对正确的克隆进行酶切鉴定(见图5)，并送测序复核结果。

2、重组慢病毒载体lvOCTS-PDL1PSMAs、lvOCTS-PDL1PSMAt的包装。

(1)完全培养基：取出预热好的新鲜培养基，加入10％FBS+5ml Pen-Srep，上下颠倒混匀即可；

(2)1XPBS溶液：称量NaCl 8g，KCl 0.2，Na₂HPO₄.12H₂O>2PO4>

(3)0.25％Trypsin溶液:称量Trypsin 2.5g，EDTA 0.19729g置于1000ml烧杯中，加入900ml 1XPBS溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μM过滤除菌，长期使用可保存至-20℃冰箱；

(4)0.5M CaCl2溶液：称量36.75g CaCl₂用400ml>

(5)2XHBS溶液：称量4.09g NaCl，0.269g Na₂HPO4，5.96g>

(6)从液氮罐中取出冻存的HEK293T/17细胞，迅速转移到37℃水浴中，1～2min后转移到超净台中，无菌操作将冻存管中的液体全部转移至10cm²培养皿中，补足含10％FBS的DMEM至8mL/10cm²dish，24h>

(7)选择细胞状态良好、无污染的HEK293T/17细胞，每2-6个培养皿为一组，将细胞胰酶消化后，用电动移液器吸取4-12ml完全培养基，向每个消化后的培养皿中加2ml，避免培养皿变干；使用1ml移液器将所有细胞吹打成单细胞悬液，转移到培养基瓶中；

(8)将上述2-6个培养皿中的剩余细胞转移到培养基瓶中，并用培养基再冲洗一便培养皿；

(9)盖紧培养基瓶盖，上下颠倒10次左右充分混匀细胞悬液，将细胞传到8-24个10cm²培养皿中，每皿的细胞密度应当约4×10⁶个/10ml完全培养基左右。如果细胞密度和预期的相差较大，则需要对细胞进行计数，然后按照4×10⁶个/皿的量接种；

(10)每6个培养皿整理为一摞，注意保持上下皿之间的配合。将培养皿左右，前后晃动数次，使细胞充分铺开，然后放入5％CO₂培养箱。剩余细胞做同样处理；

(11)检查所传代细胞，细胞汇合度应当为70-80％，轮廓饱满，贴壁良好，在细胞培养皿中均匀分布；

(12)为细胞换液，将培养基替换为新鲜完全培养基,每皿9ml，并将培养箱的CO₂浓度设定值提高到8％；

(13)按照N+0.5配DNA/CaCl₂溶液。每皿HEK293T/17细胞转染质粒量按照下列比例使用：重组慢病毒质粒(20μg),pPac-GP(15μg)，pPac-R(10μg),pEnv-G(7.5μg)。取一个新的5ml离心管，加入0.5M>

(14)另取一支5ml离心管，加入0.5ml DNA/CaCl2溶液。打开涡旋振荡器，一只手拿住5ml离心管的上端，使管底接触振荡头，使液体在管壁上散开流动，另一只手拿一把1mL移液枪，吸取0.5mL 2×HBS溶液，缓慢滴加进入离心管，控制流速，以半分钟滴完为宜。2×HBS加入后，继续振荡5秒钟，停止振荡，可直接加入需要转染的细胞中；

(15)取一皿细胞，将离心管中的1mL钙转液滴加进去，尽可能使钙转试剂分布到整个培养皿中；

(16)钙转液加入后，在皿盖上做好标记，将培养皿放还到另一个5％CO₂培养箱中。确保培养皿水平放置，每摞培养皿不要超过6个。在5％CO₂培养箱中放置(6–8h)；

(17)将第一个培养箱的CO₂浓度设定值调回到5％；

(18)24小时后，检查细胞状态。细胞汇合度应当为80–85％左右，状态良好。将培养基吸走，更换10ml 新鲜的DMEM完全培养基；

(19)48小时后，观察转染效率。绝大多数细胞仍然是贴壁的。可以看到超过95％细胞都会带有绿色荧光。将同一个病毒包装上清液收集到一起，并向培养皿中继续添加10mL新鲜培养基；

(20)72小时后，再次将同一个病毒上清液收集到一起，两次收集的病毒可以放在一起，丢弃培养皿；此时收集的上清里包含了重组慢病毒载体lvOCTS-PDL1PSMAs、lvOCTS-PDL1PSMAt。

3、离子交换色谱法纯化重组慢病毒载体；

(1)将收集的上清液使用Thermo真空泵，经0.22μm-0.8μm的PES滤器抽滤，除去杂质；

(2)按1:1～1:10的比例往上清中加入1.5M NaCl 250mM Tris-HCl(pH 6-8)；

(3)将2个离子交换柱串联放置，用4ml 1M NaOH、4ml 1M NaCl、5ml 0.15M NaCl25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液依次过柱；

(4)将步骤2中获得的溶液通过蠕动泵以1-10ml/min的速度给离子交换柱上样；

(5)全部上清液过柱后，使用10ml 0.15M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液清洗一遍；

(6)根据上样量使用1-5ml 1.5M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)进行洗脱，收集洗脱液；

(7)将洗脱液分成25到50μl一管，冻存到-80℃冰箱，进行长期保存；

4、重组慢病毒载体滴度测定；

(1)取24孔板接种293T细胞。每孔细胞为5×10⁴个，所加培养基体积为500ul,不同种类的细胞生长速度有所差异，进行病毒感染时的细胞融合率为40％-60％；

(2)准备3个无菌EP管，在每个管中加入90ul的新鲜完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N；

(3)取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10ul加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培养基(高糖DMEM+10％FBS),终体积为500ul；

(4)感染开始后20小时，除去培养上清，更换为500μl完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)，5％CO₂继续培养48小时；

(5)72小时后，观察荧光表达情况，正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少,并拍照；

(6)用0.2ml 0.25％胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗整个细胞面，离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA并定量；

(7)准备目的DNA检测qPCRmix总管Ⅰ(QPCR引物序列为SEQ ID NO.36---SEQ IDNO.37)：

n＝number of reactions.例如：总反应数为40，将1ml 2×TaqMan UniversalPCR Master Mix，4μl forward primer，4μl reverse primer，4μl probe和788μl H2O混和。震荡后放在冰上；

(8)准备内参DNA检测qPCRmix管Ⅱ(QPCR引物序列为SEQ ID NO.38---SEQ IDNO.39)：

2×TaqMan Master Mix25μl×n

10×RNaseP primer/probe mix 2.5μl×n

H₂O>

n＝number of reactions.例如：总反应数为40，将1ml 2×TaqMan UniversalPCR Master Mix，100μl 10×RNaseP primer/probe mix和700μl H₂O混和。震荡后放在冰上；

(9)在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。

(10)分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl 的水做为无模板对照(no-template control)。

(11)分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入 5μl的水做为无模板对照(no-template control)。

(12)所使用定量PCR仪为ABI PRISM 7500定量系统。循环条件设定为：50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒，60℃1分钟的40个循环。

数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。

滴度(integration units per ml，IU ml^-1)的计算公式如下：

IU ml^-1＝(C×N×D×1000)/V

其中：C＝平均每基因组整合的病毒拷贝数

N＝感染时细胞的数目(约为1×10⁵)

D＝病毒载体的稀释倍数

V＝加入的稀释病毒的体积数

(13)重组慢病毒载体lvOCTS-PDL1PSMAs、lvOCTS-PDL1PSMAt的滴度结果(如图6所示)；

二、OCTS-CAR-T细胞构建

参见图7，本发明所述OCTS-CAR-T细胞的构建方法如下：

1、分离PBMC。

(1)抽取健康供者新鲜外周血50ml；

(2)将采血袋喷拭酒精两遍，并擦干。

(3)用50ml注射器将袋中的血细胞吸出来移至新50ml管中。

(4)400g，20℃离心10min。

(5)将上层血浆移到新的50ml离心管中，56℃，30min灭活血浆，恢复至室温，2000g，离心30min，取上清到50ml离心管中待用。

(6)用D-PBS(-)补至50ml，拧紧盖子，颠倒混匀。

(7)取2个新50ml离心管，每管加入15ml Ficoll淋巴细胞分离液。

(8)向每管Ficoll上小心加入血细胞稀释液25ml。800g，20℃离心20min。

(9)离心管中液体分为四层，从上至下分别为：黄色的血浆层(回收待用)、白膜层、无色透明的Ficoll 层、红黑色的混合细胞层。

(10)小心吸取白膜层到新50ml离心管中，补加D-PBS(-)至50ml，颠倒混匀后500g，20℃离心10min。

(11)加入25ml 5％人血白蛋白并重悬细胞，400g，20℃离心10min。

(12)弃上清，加入25ml 5％人血白蛋白重悬细胞沉淀，并过70um筛网，计数。

(13)取1份含1.25x10⁸cells用于激活；剩余细胞悬液400g，20℃离心10min，加CryoPremium并冻存。

2、CD4/CD8阳性T细胞分选。

(1)将获得的PBMC计数，以80ul/10⁷cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。

(2)再以20ul/10⁷cells的比例加入CD4/CD8磁珠，吹打混匀后放入4℃中孵育15min。

(3)取出磁珠-细胞混合液，以2ml/10⁷cells的比例加入分选缓冲液，颠倒混匀后，250g，4℃离心10min。

(4)以500ul/10⁸cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。

(5)用镊子夹取LS分离柱到磁力架上。

(6)同时准备2个15ml离心管，分别标记：CD4-/CD8-细胞液(A管)、CD4+/CD8+细胞液(B管)。

(7)用3ml分离缓冲液润洗LS,并用A管接缓冲液。

(8)加入细胞-磁珠混合液，滴完后加入3ml缓冲液冲洗柱子(每次无液体残留时再加入新的液体)，总共三次，收集得到CD4/CD8-细胞。

(9)LS分离柱与磁力架分离，用B管接细胞悬液，加入5ml缓冲液，将并用柱子内塞稍用力冲洗，收集为CD4+/CD8+细胞，取样计数。

(10)按1x10⁶/ml-4x10⁶/ml的细胞密度用AIM-V培养基重悬细胞沉淀，并加入2×10⁵～1×10⁶U/L>

3、T细胞激活。

(1)提前一天将1×10³ug/L～1×10⁴ug/L>3ug/L～1×10⁴ug/L>

(2)取出包被的T75瓶，倒掉包被液，用D-PBS(-)洗涤一次，并将分选得到的细胞悬液接种到T75瓶中，摇匀，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

4、CAR基因转导及OCTS-CAR-T细胞诱导培养。

(1)提前一天包被1×10³ug/L～1×10⁴ug/L>

(2)往24孔板中，根据每孔5×10⁵细胞量，按MOI＝5～20的量，分别加入lvOCTS-PDL1PSMAs、>5～5×10⁵U/L>3ng/L～1×10⁴ng/L>3ng/L～1×10⁴ng/L>3ng/L～1×10⁴ng/L>2继续培养。

5、OCTS-CAR-T细胞体外扩增。

(1)每2天等量补加含2×10⁵～5×10⁵U/L>3ng/L～1×10⁴ng/L>3ng/L～1×10⁴ng/L>3ng/L～1×10⁴ng/L>5～2×10⁶/ml之间，37℃、5％CO₂继续培养10-14天。

(2)第7天左右，冻存培养的OCTS-CAR-T细胞用于后续检测。

实施例2

OCTS-CAR-T细胞病原检测和表达检测。

一、内毒素检测；

(1)、内毒素工作标准品为15EU/支；

(2)、鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml，0.5ml/管

(3)、内毒素标准品稀释：取内毒素标准品一支，分别用BET水按比例稀释成4λ和2λ的溶解，封口膜封口，震荡溶解15min；稀释时每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s；

(4)、加样：取鲎试剂若干支，每支加入BET水0.5ml溶解，分装至若干支无内毒素试管中，每管0.1ml。其中2支为阴性对照管，加入BET水0.1ml；

2支为阳性对照管，加入2λ浓度的内毒素工作标准品溶液0.1ml；

2支为样品阳性对照管，加入0.1ml含2λ内毒素标准品的样品溶液(稀释20倍的待测样品1ml+4λ的内毒素标准品溶液1ml＝2ml含2λ内毒素标准品的稀释40倍样品)。

样品管中加入0.1ml样品，稀释比例见表4，37±1℃水浴(或培养箱)保温60±1min；

表4内毒素稀释比例及对应内毒素含量

(5)、OCTS-CAR-T细胞的内毒素检测结果(如表5所示)，所有细胞的内毒素含量均小于2.5EU/ml，符合《中华人民共和国药典》中小于10EU/ml的标准；

表5

稀释倍数原液510204080160对应EU/ml0.251.252.55102040OCTS-PDLlPSMAs-CAR-T(+)(+)(-)(-)(-)(-)(-)OCIS-PDLlPSMAt-CAR-T(+)(+)(-)(-)(-)(-)(-)

二、支原体检测；

(1)在实验前三日，细胞样品用无抗生素培养基进行培养；

(2)收集1ml细胞悬浮液(细胞数大于1*10⁵)，置于1.5ml离心管中；

(3)13000g离心1min，收集沉淀，弃去培养基；

(4)加入500ul PBS用枪头吹吸或涡旋振荡，重悬沉淀。13000g离心5min；

(5)步骤4重复一次；

(6)加入50μl Cell Lysis Buffer，用枪头吹吸，充分混匀后,在55℃水浴中孵育20min；

(7)将样品置于95℃中加热5min；

(8)13000g离心5min后，取5μl上清作为模板，25μl PCR反应体系为：ddH20 6.5μl、Myco Mix 1μl、2x Taq Plus Mix Master(Dye Plus)12.5μl、模板5μl；PCR循环条件为：95℃30sec，(95℃30sec，56℃30sec， 72℃30sec)*30cycle，72℃5min。

(9)支原体检测结果显示(如图8所示)，OCTS-CAR-T细胞中均不含支原体。

三、OCTS基因转导效率检测及免疫分型检测；

(1)收集经病毒转导后的T细胞，用含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液重悬细胞并调整为1×10⁶/ml。

(2)向离心管中加入含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液1ml并混匀，350g离心5min，弃上清。

(3)重复步骤2一次。

(4)用0.2ml的含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液重悬细胞，并向离心管中加入1ul的1mg/ul protein L， 5ul CD4-FITC，5ul CD8-APC，混匀，4℃孵育45min。

(5)向离心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液并混匀，350g离心5min，弃上清。

(6)重复步骤5两次。

(7)用0.2ml含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液重悬细胞，并向离心管中加入0.2ul PE-SA，混匀，37℃避光孵育15min。

(8)向离心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液重并混匀，350g离心5min，弃上清。

(9)用1ml D-PBS(-)溶液重悬细胞沉淀，350g离心5min，弃上清。

(10)重复步骤9两次。

(11)用0.4ml D-PBS(-)溶液重悬细胞沉淀，流式细胞仪进行检测。

(12)OCTS基因转导效率及免疫分型检测的检测结果如图9所示，制备的OCTS-CAR-T细胞的感染效率均位于40％以上，CD4阳性细胞和CD8阳性细胞的比例位于1:3～3:1之间，可以进行后续功能检测。

实施例3 OCTS-CAR-T细胞的功能检测。

一、靶细胞杀伤效果评估。

(1)分别培养靶细胞[PSMA⁺K562、PDL1⁺K562、PDL1⁺PSMA⁺K562、K562细胞]和效应细胞[OCTS-CAR-T>

(2)收集靶细胞4x10⁵cells和OCTS-CAR-T细胞2.8x10⁶cells，800g，6min离心，弃上清；

(3)用1ml D-PBS(-)溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；

(4)重复步骤3一次；

(5)用700ul培养基(AIM-V培养基+1～10％FBS)重悬效应细胞，用2ml培养基(AIM-V培养基+1～10％ FBS)重悬靶细胞；

(6)设置效靶比为1:1、5:1、10:1的实验孔，效应细胞分别与单靶细胞和双靶细胞共孵育的分组情况如表 6所示，并设置对照组(K562细胞)，每组3个复孔；

表6

效应细胞靶细胞1靶细胞2靶细胞3OCTS-PDLlPSMAs-CAR-TPDLl⁺K562PSMA⁺K562PDLl⁺PSMA⁺K562OCTS-PDLlPSMAt-CAR-TPDLl⁺K562PSMA⁺K562PDLl⁺PSMA⁺K562

(7)250g，5min平板离心；

(8)37℃，5％CO2培养箱中培养4小时；

(9)250g，5min平板离心；

(10)取每个孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；

(11)避光孵育25min；

(12)每孔加入50ul终止液；

(13)酶标仪检测490nm吸光度；

(14)将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值。

(15)将步骤14中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。结果如图10所示，OCTS-CAR-T对各自的单靶细胞和双靶细胞均有较好的杀伤效果，Turn OCTS结构的CAR-T 细胞对靶细胞的杀伤效率略高于Series OCTS结构的CAR-T细胞；

杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)X100％

(16)上述实验结果表明，通过对传统CAR结构中抗原识别区的改造形成的OCTS结构，能够显著提高 OCTS-CAR-T细胞识别并杀伤靶细胞的范围，因此OCTS-CAR-T细胞将在未来的PSMA阳性/PDL1阳性 /PSMA、PDL1双阳性的前列腺癌、黑色素瘤、子宫内膜癌等恶性肿瘤的细胞治疗中发挥巨大的作用。

序列表

<110>上海优卡迪生物医药科技有限公司

<120>一种基于OCTS技术的前列腺癌CAR-T治疗载体及其构建方法和应用

<130> HJ17-13349

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 861

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60

gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120

cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180

gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240

cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300

gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360

tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420

ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480

gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540

cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600

tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660

tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 720

cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780

acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840

tcactgatta agcattggta a 861

<210> 2

<211> 674

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 60

ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 120

actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta 180

gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 240

ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 300

gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 360

acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 420

tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 480

gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 540

cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 600

cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 660

ccttttgctc acat 674

<210> 3

<211> 147

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 60

tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga 120

ggcttttttg gaggcctaga cttttgc 147

<210> 4

<211> 228

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 60

cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg 120

tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc 180

gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacg 228

<210> 5

<211> 180

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 60

tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 120

gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 180

<210> 6

<211> 234

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

tgctagagat tttccacact gactaaaagg gtctgaggga tctctagtta ccagagtcac 60

acaacagacg ggcacacact acttgaagca ctcaaggcaa gctttattga ggcttaagca 120

gtgggttccc tagttagcca gagagctccc aggctcagat ctggtctaac cagagagacc 180

cagtacaagc aaaaagcaga tcttattttc gttgggagtg aattagccct tcca 234

<210> 7

<211> 353

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc 60

ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg 120

agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa 180

tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga agaacttaga tcattatata 240

atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga gataaaagac accaaggaag 300

ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac caccgcacag caa 353

<210> 8

<211> 233

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcctcaat 60

gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120

gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180

gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcc 233

<210> 9

<211> 489

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

tggggatttg gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct tggaatgcta 60

gttggagtaa taaatctctg gaacagattg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag 120

agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc aaaaccagca 180

agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt 240

taacataaca aattggctgt ggtatataaa attattcata atgatagtag gaggcttggt 300

aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc 360

accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 420

agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatctcg 480

acggttaac 489

<210> 10

<211> 119

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60

agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaatttta 119

<210> 11

<211> 696

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 11

atggcccagt ccaagcacgg cctgaccaag gagatgacca tgaagtaccg catggagggc 60

tgcgtggacg gccacaagtt cgtgatcacc ggcgagggca tcggctaccc cttcaagggc 120

aagcaggcca tcaacctgtg cgtggtggag ggcggcccct tgcccttcgc cgaggacatc 180

ttgtccgccg ccttcatgta cggcaaccgc gtgttcaccg agtaccccca ggacatcgtc 240

gactacttca agaactcctg ccccgccggc tacacctggg accgctcctt cctgttcgag 300

gacggcgccg tgtgcatctg caacgccgac atcaccgtga gcgtggagga gaactgcatg 360

taccacgagt ccaagttcta cggcgtgaac ttccccgccg acggccccgt gatgaagaag 420

atgaccgaca actgggagcc ctcctgcgag aagatcatcc ccgtgcccaa gcagggcatc 480

ttgaagggcg acgtgagcat gtacctgctg ctgaaggacg gtggccgctt gcgctgccag 540

ttcgacaccg tgtacaaggc caagtccgtg ccccgcaaga tgcccgactg gcacttcatc 600

cagcacaagc tgacccgcga ggaccgcagc gacgccaaga accagaagtg gcacctgacc 660

gagcacgcca tcgcctccgg ctccgccttg ccctga 696

<210> 12

<211> 575

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 12

gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60

gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120

ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180

gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240

aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300

tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360

acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct cacctcaagc gtattcaaca 420

aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480

gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540

ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataat 575

<210> 13

<211> 592

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 13

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120

atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180

tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240

ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300

attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360

ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420

gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480

aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540

cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg 592

<210> 14

<211> 1178

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 14

gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60

gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120

atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180

tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240

tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300

cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 360

agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420

ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480

tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540

aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 600

cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 660

cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 720

gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 780

ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga 840

cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 900

cctcagccgt cgcttcatgt gactccactg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 960

agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 1020

agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 1080

tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 1140

tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1178

<210> 15

<211> 63

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 15

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 16

<211> 321

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 16

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcacca gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

ctgacctgca aagcgagcca ggatgtgggc accgcggtgg attggtatca gcagaaaccg 120

ggcccgagcc cgaaactgct gatttattgg gcgagcaccc gccataccgg cattccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagattttg cggattatta ttgccagcag tataacagct atccgctgac ctttggcccg 300

ggcaccaaag tggatattaa a 321

<210> 17

<211> 345

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 17

gaagtgcagc tggtgcagag cggcccggaa gtgaaaaaac cgggcgcgac cgtgaaaatt 60

agctgcaaaa ccagcggcta tacctttacc gaatatacca ttcattgggt gaaacaggcg 120

ccgggcaaag gcctggaatg gattggcaac attaacccga acaacggcgg caccacctat 180

aaccagaaat ttgaagataa agcgaccctg accgtggata aaagcaccga taccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc ggcgggctgg 300

aactttgatt attggggcca gggcaccctg ctgaccgtga gcagc 345

<210> 18

<211> 333

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 18

gatattgtgc tgacccagag cccggcgagc ctggcggtga gcccgggcca gcgcgcgacc 60

attacctgcc gcgcgagcca gagcgtgagc accagcagca gcagctttat gcattggtat 120

cagcagaaac cgggccagcc gccgaaactg ctgattaaat atgcgagcaa cctggaaagc 180

ggcgtgccgg cgcgctttag cggcagcggc agcggcaccg attttaccct gaccattaac 240

ccggtggaag cgaacgatac cgcgaactat tattgccagc atagctggga aattccgtat 300

acctttggcc agggcaccaa actggaaatt aaa 333

<210> 19

<211> 348

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 19

gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgaaac cgggcggcag cctgcgcctg 60

agctgcgcgg cgagcggctt tatttttcgc agctatggca tgagctgggt gcgccaggcg 120

ccgggcaaag gcctggaatg ggtggcgagc attagcagcg gcggcagcac ctattatccg 180

gatagcgtga aaggccgctt taccattagc cgcgataacg cgaaaaacag cctgtatctg 240

cagatgaaca gcctgcgcgc ggaagatacc gcggtgtatg attgcgcgcg cggctatgat 300

agcggctttg cgtattgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcagc 348

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 20

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45

<210> 21

<211> 57

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 21

gcctccacca agggcccatc tgtcttcccc ctggccccca gctcctctgg ctccgga 57

<210> 22

<211> 141

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 22

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta c 141

<210> 23

<211> 66

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 23

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 60

tactgc 66

<210> 24

<211> 123

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 24

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 25

<211> 111

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 25

cgccgcgatc agcgcctgcc gccggatgcg cataaaccgc cgggcggcgg cagctttcgc 60

accccgattc aggaagaaca ggcggatgcg catagcaccc tggcgaaaat t 111

<210> 26

<211> 336

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 26

cgcgtgaaat ttagccgcag cgcggatgcg ccggcgtatc agcagggcca gaaccagctg 60

tataacgaac tgaacctggg ccgccgcgaa gaatatgatg tgctggataa acgccgcggc 120

cgcgatccgg aaatgggcgg caaaccgcgc cgcaaaaacc cgcaggaagg cctgtataac 180

gaactgcaga aagataaaat ggcggaagcg tatagcgaaa ttggcatgaa aggcgaacgc 240

cgccgcggca aaggccatga tggcctgtat cagggcctga gcaccgcgac caaagatacc 300

tatgatgcgc tgcatatgca ggcgctgccg ccgcgc 336

<210> 27

<211> 1557

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 27

atgaactcct tctccacaag cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg gctgctcctg 60

gtgttgcctg ctgccttccc tgccccagat attgtgctga cccagagccc ggcgagcctg 120

gcggtgagcc cgggccagcg cgcgaccatt acctgccgcg cgagccagag cgtgagcacc 180

agcagcagca gctttatgca ttggtatcag cagaaaccgg gccagccgcc gaaactgctg 240

attaaatatg cgagcaacct ggaaagcggc gtgccggcgc gctttagcgg cagcggcagc 300

ggcaccgatt ttaccctgac cattaacccg gtggaagcga acgataccgc gaactattat 360

tgccagcata gctgggaaat tccgtatacc tttggccagg gcaccaaact ggaaattaaa 420

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatctgaagt gcagctggtg 480

gaaagcggcg gcggcctggt gaaaccgggc ggcagcctgc gcctgagctg cgcggcgagc 540

ggctttattt ttcgcagcta tggcatgagc tgggtgcgcc aggcgccggg caaaggcctg 600

gaatgggtgg cgagcattag cagcggcggc agcacctatt atccggatag cgtgaaaggc 660

cgctttacca ttagccgcga taacgcgaaa aacagcctgt atctgcagat gaacagcctg 720

cgcgcggaag ataccgcggt gtatgattgc gcgcgcggct atgatagcgg ctttgcgtat 780

tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc agcggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 840

tcgggtggcg gcggatctga accgaaaagc tgcgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 900

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 960

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1020

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1080

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1140

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1200

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1260

accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1320

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1380

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1440

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcac 1500

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 1557

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 28

attcaaaatt ttatcgatgc tccggtgccc gtcagt 36

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 29

tcacgacacc tgaaatggaa ga 22

<210> 30

<211> 46

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 30

catttcaggt gtcgtgagga tccgccacca tggcgctgcc ggtgac 46

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 31

ggggagggag aggggcttag cgcggcggca gcg 33

<210> 32

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 32

gcccctctcc ctccccc 17

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 33

attatcatcg tgtttttcaa aggaa 25

<210> 34

<211> 44

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 34

aaaacacgat gataatgcca ccatgaactc cttctccaca agcg 44

<210> 35

<211> 46

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 35

aatccagagg ttgattgtcg acgaattctc atttgcccgg gctcag 46

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 36

cctttccggg actttcgctt t 21

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 37

gcagaatcca ggtggcaaca 20

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 38

catgtacgtt gctatccagg c 21

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 39

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