一种超高效液相质谱联用测定吴茱萸配方颗粒中10种成分的定量方法

摘要

本发明涉及一种超高效液相质谱联用测定吴茱萸配方颗粒中10种成分的定量方法。其特征：采用液‑质联用，以乙腈为A相、0.12％乙酸/1mmol/L乙酸铵为B相，经4次比例变换梯度洗脱，流速0.8mL/min；柱温40℃；和多重反应监测(MRM)的扫描方式下正负离子同时监测，离子源为ESI源，雾化气(GS1，N2)，辅助气(GS2，N2)，全程使用氮气，碰撞气压力为medium，Q1和Q3分辨率均为UNIT；测定了吴茱萸配方颗粒中绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、橙皮苷、去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸卡品碱含量，10种成分22分钟检测完毕，方法快捷、准确，无干扰。

说明书

技术领域

一种超高效液相质谱联用测定吴茱萸配方颗粒中10种成分的定量方法，属于质量控制领域，即，将超高效液相色谱仪与质谱仪串联起来，液相色谱进行混合物分离，质谱仪进行检测和定量测定多种成分，具有高灵敏性、高选择性、高准确性的特点，10种成分，22分钟内测定完毕。不再受不同成分最佳检测波长不同、含量高低不一样，极性相差悬殊的困扰，检测限可由高效液相的μg级，降低至ng级，大幅度扩大了检测范围。

背景技术

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实。是一种常用中药，具散寒止痒，降逆止呕，助阳止泻的功效。用于厥阴头痛，寒疝腹痛，寒湿脚气，经行腹痛，脘腹胀痛，呕吐吞酸，五更泄泻。主含生物碱类成分，如吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱、吴茱萸卡品碱、羟基吴茱萸碱、吴茱萸新碱、吴茱萸新酮碱、吴茱萸黄碱等；还有一些黄酮类成分，如橙皮苷、金丝桃苷、槲皮素-3-O-β-D半乳糖苷、异鼠李素-3-O-β-D半乳糖苷、花色苷、异戊烯黄酮等；柠檬苦素类，如吴茱萸苦素、柠檬苦素、吴茱萸苦素乙酸酯等；有机酸类，如绿原酸、氨基酸等。其质量标准在中国药典2015年版一部吴茱萸药材项下收载了吴茱萸碱和吴茱萸次碱的薄层鉴别和吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素的高效液相定量测定。目前制剂中多是以吴茱萸碱、吴茱萸次碱为指标，进行定量测定的。虽然曾金祥、朱继孝、黄碧涛等以“吴茱萸中7种成分的含量测定”为题，报道了采用高效液相色谱，经5次梯度洗脱，测定吴茱萸中辛弗林、绿原酸、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、槲皮素、芦丁和金丝桃苷七种成分的文献，但一套梯度程序加上平衡到最初梯度百分比，要花费近50分钟，且供试品溶液分离的波峰不能回基线，干扰峰太多，难以准确定量(见图1-A、B)。尹元元、闫利华、张启伟等报道了以乙腈为A相、四氢呋喃为B相、5mmol·L^-1醋酸铵缓冲液(pH3.8)为C相，经8次梯度洗脱，用HPLC法测定吴茱萸及其习用品药材中N-甲酰二氢吴茱萸次碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、1-甲基-2-十一烷基-4-喹诺酮、吴茱萸卡品碱、二氢吴茱萸卡品碱和柠檬苦素的含量方法，但运行一针花费测定时间约90分钟，且分离色谱图基线高低不平，难以在生产实际中应用。

目前还未查阅到超高效液相色谱质谱联用，高效、快速测定吴茱萸中10种成分的报道。在上述背景情况下，为高效、快捷、准确、多指标控制吴茱萸配方颗粒的质量，发明了超高效液相质谱联用测定吴茱萸配方颗粒中10种成分的定量方法。

吴茱萸配方颗粒的制备方法 取吴茱萸饮片6000g，加水提取二次，每次1小时，提取温度95～100℃，滤过，滤液减压浓缩，浓缩液加入糊精适量，喷雾干燥，得干浸膏粉，加入糊精适量，混匀，制粒，制成1000g，分装，即得。

发明内容

采用超高效液相质谱联用，液相色谱：色谱柱：Diamonsil C₁₈柱(150×4.6mm，5μm)；以乙腈为A相、0.12％乙酸/1mmol/L乙酸铵为B相，采用梯度洗脱方式，即0～6min，15％～28％A；6～10min，28％～68％A；10～11min，68％～90％A；11～22min，90％A；流速0.8mL/min；柱温40℃；进样量为10μL；质谱条件：采用多重反应监测(MRM)的扫描方式下正负离子同时监测，离子源为ESI源，离子喷雾电压设为5500和-4500V，源温度(TEM)为650℃，雾化气(GS1，N2)为60psi，辅助气(GS2，N2)为65psi，接口持续加热，全程使用氮气，气帘气(N2)设置为25psi，碰撞气压力为medium，Q1和Q3分辨率均为UNIT；每个待测化合物的监测离子对为化合物的分子离子峰和子离子峰；每个离子对的滞留时间(dwell>

同时测定了吴茱萸配方颗粒中绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、橙皮苷、去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸卡品碱含量，10种成分22分钟检测完毕，方法简便、快捷、准确，无干扰。为首次报道。见10种成分提取的离子流色谱图(图2-11中A、B)及对照品的离子扫描图(图2-11中C)。

通过方法学考察，10种成分的线性范围(表2)：绿原酸进样浓度在32.93-3292.80ng/ml，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝3.21e³X+4.00e⁴，r＝0.9994；咖啡酸进样浓度在49.68-4968.00ng/ml，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝4.18e²X+2.63e⁴，r＝0.9980；芦丁进样浓度在5.74-573.50ng/ml，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝7.27e²X+9.22e³，r＝0.9964；金丝桃苷进样浓度在6.22-622.38ng/ml，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝2.84e³X+1.41e⁴，r＝0.9987；橙皮苷进样浓度在16.63-1662.86ng/ml，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝1.31e³X+4.53e⁴，r＝0.9994；去氢吴茱萸碱进样浓度在61.45-6144.60ng/ml，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝5.58e²X+5.03e⁴，r＝0.9988；柠檬苦素进样浓度在298.41-29841.00ng/ml，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝2.07e²X+2.17e⁵，r＝0.9974；吴茱萸碱的进样浓度在20.38-2037.70ng/ml，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝6.88e³X+6.01e⁵>4X+3.17e⁵，r＝0.9991；吴茱萸卡品碱的进样浓度在21.36-2136.40ng/ml，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝5.09e⁵X+3.78e⁶，r＝0.9982。采用加样回收实验，结果表明：绿原酸的平均回收率为100.38％(n＝6)，RSD为1.99％(见表3)；咖啡酸的平均回收率为100.49％(n＝6)，RSD为1.38％(见表4)；芦丁的平均回收率为99.67％(n＝6)，RSD为2.96％(见表5)；金丝桃苷的平均回收率为99.67％(n＝6)，RSD为2.07％(见表6)；橙皮苷的平均回收率为100.95％(n＝6)，RSD为3.43％(见表7)；去氢吴茱萸碱的平均回收率为95.91％(n＝6)，RSD为1.35％(见表8)；柠檬苦素的平均回收率为99.56％(n＝6)，RSD为1.70％(见表9)；吴茱萸碱的平均回收率为97.12％(n＝6)，RSD为2.44％(见表10)；吴茱萸次碱的平均回收率为99.26％(n＝6)，RSD为2.93％(见表11)；吴茱萸卡品碱的平均回收率为99.54％(n＝6)，RSD为2.28％(见表12)；精密度(见表13、14)、稳定性(见表15)、重复性(见表16)等一系列方法参数，均符合定量方法学规定，适用于吴茱萸配方颗粒中10种成分的快速定量测定。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

(1)检测条件 超高效液相色谱：色谱柱：Diamonsil C₁₈柱(150×4.6mm，5μm)；以乙腈为A相、0.12％乙酸/1mmol/L乙酸铵为B相，采用梯度洗脱方式，即0～6min，15％～28％A；6～10min，28％～68％A；10～11min，68％～90％A；11～22min，90％A；流速0.8mL/min；柱温40℃；进样量为10μL；质谱条件：采用多重反应监测(MRM)的扫描方式下正负离子同时监测，离子源为ESI源，离子喷雾电压设为5500和-4500V，源温度(TEM)为650℃，雾化气(GS1，N2)为60psi，辅助气(GS2，N2)为65psi，接口持续加热，全程使用氮气，气帘气(N2)设置为25psi，碰撞气压力为medium，Q1和Q3分辨率均为UNIT；每个待测化合物的监测离子对为化合物的分子离子峰和子离子峰；每个离子对的滞留时间(dwell>

(2)对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、橙皮苷、去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸卡品碱适量，用甲醇溶解并配制成一定浓度的储备液。分别精密量取一定体积储备液，混合，并稀释成浓度分别329.28、496.80、57.35、62.24、166.29、614.46、2984.10、203.77、200.39、213.64ng/mL的混合对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备 精密称取吴茱萸配方颗粒约0.1g，置锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；

(4)测定法 分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱质谱联用仪，测定供试品溶液中10种成分的含量。

本发明的原理如下：

吴茱萸配方颗粒中的10种成分，化学结构不同，理化性质不一样，最大吸收波长而异，但都有固定的分子量，随着流动相进入到液相仪器后，进行初步分离，分离的物质进入质谱仪器后，转变为分子离子与子离子碎片，确定离子对化合物分子离子峰与子离子峰，进而确定待测成分的分析条件，找到待测成分保留时间处的峰，对峰面积积分，其峰面积在一定范围内与其含量具有良好的线性关系，而用于定量测定。

本发明的创新点及有益效果如下：

(1)采用超高效液相色谱-质谱联用，以乙腈为A相、0.12％乙酸/1mmol/L乙酸铵为B相，经4次比例变换梯度洗脱，流速0.8mL/min；柱温40℃；和多重反应监测(MRM)的扫描方式下正负离子同时监测，离子源为ESI源，雾化气(GS1，N2)，辅助气(GS2，N2)，全程使用氮气，碰撞气压力为medium，Q1和Q3分辨率均为UNIT；测定了吴茱萸配方颗粒中绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、橙皮苷、去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸卡品碱含量，10种成分22分钟检测完毕，方法简便、快捷、准确，无干扰。为首次报道。

(2)超高效液相色谱-质谱联用与一般的高效液相色谱相比，具有高灵敏性、高选择性、高准确性的特点，10种成分，22分钟内测定完毕。不再受不同成分最佳检测波长不同、含量高低不一样，极性相差悬殊的困扰，检测限可由高效液相的μg级，降低至ng级，大幅度扩大了检测范围。由上述吴茱萸中7种成分的含量测定图谱得知，在液相色谱仪上短时间难以分离或定量测定的微量成分，通过液相质谱仪联用，获得良好的分离，得到能准确定量测定的波峰信息。

(3)芦丁、金丝桃苷、橙皮苷属于黄酮类成分，咖啡酸和绿原酸为有机酸类，柠檬苦素为柠檬苦素类，而吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱和吴茱萸卡品碱为生物碱类，这些成分化学结构如下：

由结构图得知，结构不同，极性相差悬殊，按极性大小排列，其在液相质谱仪上出峰的顺序是：绿原酸→咖啡酸→芦丁→金丝桃苷→橙皮苷→去氢吴茱萸碱→柠檬苦素→吴茱萸碱→吴茱萸次碱→吴茱萸卡品碱，采用一般的高效液相，很难在短时间内获得分离良好的波峰；最佳检测波长而异，很难统一；含量高低不一样，有一些在液相上无波峰信息；所以采用普通的高效液相，无法在22分钟之内，测定结构不同、极性悬殊、含量高低相差700余倍的10种成分。而采用超高效液相色谱质谱联用，获得成功检测。为吴茱萸配方颗粒的多指标快速检测提供了方法。

附图说明

图1-A文献7种对照品的含量测定HPLC色谱图

图1-B文献吴茱萸中7种成分的含量测定HPLC色谱图

图2-A绿原酸对照品溶液提取的离子流色谱图

图2-B供试品溶液提取的离子流色谱图

图2-C绿原酸对照品溶液的离子扫描图

图3-A咖啡酸对照品溶液提取的离子流色谱图

图3-B供试品溶液提取的离子流色谱图

图3-C咖啡酸对照品溶液的离子扫描图

图4-A芦丁对照品溶液提取的离子流色谱图

图4-B供试品溶液提取的离子流色谱图

图4-C芦丁对照品溶液的离子扫描图

图5-A金丝桃苷对照品溶液提取的离子流色谱图

图5-B供试品溶液提取的离子流色谱图

图5-C金丝桃苷对照品溶液的离子扫描图

图6-A橙皮苷对照品溶液提取的离子流色谱图

图6-B供试品溶液提取的离子流色谱图

图6-C橙皮苷对照品溶液的离子扫描图

图7-A去氢吴茱萸碱对照品溶液提取的离子流色谱图

图7-B供试品溶液提取的离子流色谱图

图7-C去氢吴茱萸碱对照品溶液的离子扫描图

图8-A柠檬苦素对照品溶液提取的离子流色谱图

图8-B供试品溶液提取的离子流色谱图

图8-C柠檬苦素对照品溶液的离子扫描图

图9-A吴茱萸碱对照品溶液提取的离子流色谱图

图9-B供试品溶液提取的离子流色谱图

图9-C吴茱萸碱对照品溶液的离子扫描图

图10-A吴茱萸次碱对照品溶液提取的离子流色谱图

图10-B供试品溶液提取的离子流色谱图

图10-C吴茱萸次碱对照品溶液的离子扫描图

图11-A吴茱萸卡品碱对照品溶液提取的离子流色谱图

图11-B供试品溶液提取的离子流色谱图

图11-C吴茱萸卡品碱对照品溶液的离子扫描图

图1-A、B中，纵坐标为吸收强度；横坐标为保留时间(分钟)，其中，1.辛弗林 2.绿原酸 3.芦丁 4.金丝桃苷 5.槲皮素 6.吴茱萸碱 7.吴茱萸次碱

图2～图11中的A和B图，纵坐标为吸收强度；横坐标为保留时间(分钟)，其中A为对照品，B为供试品。

图2～图11中的C 纵坐标为吸收强度；横坐标为分子量，从左至右，图中第1个标有的数字为各对照品的子离子峰、第2个数字为分子离子峰。

本发明具体实施方式

实施例：

(1)检测条件 超高效液相色谱：色谱柱：Diamonsil C₁₈柱(150×4.6mm，5μm)；以乙腈为A相、0.12％乙酸/1mmol/L乙酸铵为B相，采用梯度洗脱方式，即0～6min，15％～28％A；6～10min，28％～68％A；10～11min，68％～90％A；11～22min，90％A；流速0.8mL/min；柱温40℃；进样量为10μL；质谱条件：采用多重反应监测(MRM)的扫描方式下正负离子同时监测，离子源为ESI源，离子喷雾电压设为5500和-4500V，源温度(TEM)为650℃，雾化气(GS1，N2)为60psi，辅助气(GS2，N2)为65psi，接口持续加热，全程使用氮气，气帘气(N2)设置为25psi，碰撞气压力为medium，Q1和Q3分辨率均为UNIT；每个待测化合物的监测离子对为化合物的分子离子峰和子离子峰；每个离子对的滞留时间(dwell>

(2)对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、橙皮苷、去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸卡品碱适量，用甲醇溶解并配制成一定浓度的储备液。分别精密量取一定体积储备液，混合，并稀释成浓度分别329.28、496.80、57.35、62.24、166.29、614.46、2984.10、203.77、200.39、213.64ng/mL的混合对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备 精密称取吴茱萸配方颗粒约0.1g，置锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

(4)测定法 分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱质谱联用仪，测定供试品溶液中10种成分的含量。测定了不同厂家的7批样品，结果见表17。

表1 10种被测成分的质谱参数

表2 被测化合物的回归分析方程及检测限、定量限

表3 绿原酸加样回收试验结果

表4 咖啡酸加样回收试验结果

表5 芦丁加样回收试验结果

表6 金丝桃苷加样回收试验结果

表7 橙皮苷加样回收试验结果

表8 去氢吴茱萸碱加样回收试验结果

表9 柠檬苦素加样回收试验结果

表10 吴茱萸碱加样回收试验结果

表11 吴茱萸次碱加样回收试验结果

表12 吴茱萸卡品碱加样回收试验结果

表13 日内精密度

表14 日间精密度

表15 稳定性

表16 重复性试验(mg/g)

注：表13～16的各成分顺序为仪器自动打印的顺序，未再按出峰顺序调整。

表17 吴茱萸配方颗粒中10种化学成分的含量(mg/g)