来源于欧洲花楸的植保素糖基转移酶及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种来源于欧洲花楸的植保素糖基转移酶及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下a)或b)或c)：a)序列1所示蛋白；b)将序列1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且来源于欧洲花楸并且具有植保素糖基转移酶活性的由序列1衍生的蛋白；c)与a)或b)限定序列具有99％、95％、90％、85％或者80％以上同源性，且来源于欧洲花楸并且具有植保素糖基转移酶活性的蛋白。本发明蛋白质具有植保素糖基转移酶活性，能将联苯植保素的不同位置的羟基糖基化，进而获取多样化的糖苷类化合物。本发明提供了一种合成联苯苷类植保素的方法，对于苹果亚科植物的抗病害研究以及抗性品种的选育具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种来源于欧洲花楸的植保素糖基转移酶及其编码基因与应用。

背景技术

植物通过次生代谢产生大量非生长发育所必需的小分子有机化合物，种类繁多，化学结构迥异。现在已知大约有10万种次生代谢物，包括糖苷、萜类、酚类、黄酮类、香豆素、木脂素、生物碱、甾类、皂苷、多炔类、有机酸等，许多次生代谢产物都具有重要的药理活性和经济价值。次生代谢产物是在结构的基本骨架形成之后，再经过羟基化、甲基化、酰基化或者结合小分子等修饰，最终生成各种终产物。糖基化即是一种广泛存在的化合物修饰方式，也是生物体内重要的转化反应——许多代谢产物合成的最后一步，也是非常重要的一步，往往都发生糖基化反应。催化糖基化反应的酶即为糖基转移酶，其催化形成的糖苷类化合物结构类型多样，并具有多种生物活性，是药物先导的重要来源。

在植物的次生代谢中，有多种类型的糖基转移酶参与其中，目前研究较多的糖基转移酶有植物激素类糖基转移酶、黄酮类糖基转移酶以及萜类糖基转移酶等，而植保素类的糖基转移酶尚未有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于欧洲花楸的植保素糖基转移酶及其编码基因与应用。

本发明首先要求保护如下(a)或(b)或(c)所示蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且来源于欧洲花楸并且具有植保素糖基转移酶活性的由序列1衍生的蛋白质；

(c)与(a)或(b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且来源于欧洲花楸并且具有植保素糖基转移酶活性的蛋白质。

为了便于所述蛋白质的纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因，所述基因具体可为如下任一所示的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体为在pET-28a(+)载体的多克隆位点(如BamH I和Not I)间插入所述基因得到的重组质粒。

所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。

在本发明的一个实施例中，所述重组菌为含有所述重组载体的大肠杆菌；所述大肠杆菌具体如Transetta(DE3)。

所述蛋白质在作为糖基转移酶中的应用也属于本发明的保护范围。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备具有糖基转移酶活性的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

在上述两种应用中，具体可以植保素作为糖基化的受体底物；更加具体的，所述植保素为联苯植保素。

在本发明中，所述联苯植保素具体为如下式I、式II或式III所示化合物：

进一步，所述蛋白质作为糖基转移酶催化式I所示化合物生成式I’所示糖基化产物；所述蛋白质作为糖基转移酶催化式II所示化合物生成式II’所示糖基化产物；所述蛋白质作为糖基转移酶催化式III所示化合物生成式III’所示糖基化产物。

其次，本发明还要求保护如下(A)或(B)或(C)所示的方法。

(A)制备前文式I’所示糖基化产物的方法，包括如下步骤：以所述蛋白质为糖基转移酶，以前文式I所示化合物为糖基化的受体底物，以UDP-葡萄糖作为糖基供体，进行酶促反应。

(B)制备前文中式II’所示糖基化产物的方法，包括如下步骤：以所述蛋白质为糖基转移酶，以前文式II所示化合物为糖基化的受体底物，以UDP-葡萄糖作为糖基供体，进行酶促反应。

(C)制备前文式III’所示糖基化产物的方法，包括如下步骤：以所述蛋白质为糖基转移酶，以前文式III所示化合物为糖基化的受体底物，以UDP-葡萄糖作为糖基供体，进行酶促反应。

进一步，所述方法中，所述受体底物和所述供体的摩尔比可为1：2；作为糖基转移酶的所述蛋白质足量。

在所述方法中，进行所述酶促反应的温度为30℃；反应时间为16h。

实验证明，本发明所提供的来源于欧洲花楸的序列1所示的蛋白质具有植保素糖基转移酶活性，能够将式I、式II和式III所示的三种联苯植保素的不同位置的羟基糖基化，进而可获取多样化的糖苷类化合物。本发明提供了一种合成联苯苷类植保素的方法，对于苹果亚科植物的抗病害研究以及抗性品种的选育具有重要意义。

附图说明

图1为以化合物1和UDP-葡萄糖分别作为糖基受体和糖基供体时，SaUGT5催化糖基化反应产物的UPLC-UV检测图谱。

图2为以化合物2和UDP-葡萄糖分别作为糖基受体和糖基供体时，SaUGT5催化糖基化反应产物的UPLC-UV检测图谱。

图3为以化合物3和UDP-葡萄糖分别作为糖基受体和糖基供体时，SaUGT5催化糖基化反应产物的UPLC-UV检测图谱。

图4为UPLC-UV/ESI-MS检测重组糖基转移酶SaUGT5催化化合物1进行糖基化反应。(A)SaUGT5催化化合物1糖基化反应，化合物1和产物1a、1b的UPLC谱图与化合物1UV吸收谱图；(B)产物1a的UV吸收谱图以及在负离子模式下MS谱图，其分子离子峰为m/z 407.1289[M-H]^-；(C)产物1b的UV吸收谱图以及在负离子模式下MS谱图，其分子离子峰为m/z407.1288[M-H]^-。

图5为UPLC-UV/ESI-MS检测重组糖基转移酶SaUGT5催化化合物2进行糖基化反应。(A)SaUGT5催化化合物2糖基化反应，化合物2和产物2a、2b的UPLC谱图与化合物2UV吸收谱图；(B)产物2a的UV吸收谱图以及在负离子模式下MS谱图，其分子离子峰为m/z 453.1360[M+HCOO]^-；(C)产物2b的UV吸收谱图以及在负离子模式下MS谱图，其分子离子峰为m/z453.1357[M+HCOO]^-。

图6为UPLC-UV/ESI-MS检测重组糖基转移酶SaUGT5催化化合物3进行糖基化反应。(A)SaUGT5催化化合物3糖基化反应，化合物3和产物3a和3b的UPLC谱图与(3)UV吸收谱图；(B)产物3a的UV吸收谱图以及在负离子模式下MS谱图，其分子离子峰为m/z 377.1170[M-H]^-；(C)产物3b的UV吸收谱图以及在负离子模式下MS谱图，其分子离子峰为m/z>-。

图7为重组糖基转移酶SaUGT5催化底物结构以及对应产物的糖基化产物结构。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

欧洲花楸悬浮细胞：记载于“黄蕾,肖文娟,杨光等.酵母提取物诱导欧洲花楸悬浮细胞合成次生代谢产物的机制探究.中国中药杂志,2014,39(11):2019-2023”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

实施例1、欧洲花楸植保素糖基转移酶基因的克隆

从欧洲花楸悬浮细胞中提取总RNA，并反转录得到cDNA。以所得cDNA为模板，采用引物1和引物2进行PCR反应。

引物1：5’-GAGGGATCCATGGGAGACGTAATAGTGCT-3’；

引物2：5’-GAGGCGGCCGCTTATGTAAAGCTATTGACAAAGTTA-3’。

PCR反应体系如下：KOD-Plus-Neo 2μL；2mM dNTPs 10μL；25mM MgSO₄>2O补足至100μL。

PCR反应条件：94℃10min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃维持。

PCR结束后对所得PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测及测序。测序结果显示，PCR产物的序列为“5’-GAGGGATCC+序列2+GCGGCCGCCTC”。将序列2所示基因命名为SaUGT5。序列2编码序列表中序列1所示的蛋白质，该蛋白质命名为SaUGT5。

实施例2、欧洲花楸植保素糖基转移酶的外源表达

1、重组表达载体的构建

将实施例1的PCR产物“5’-GAGGGATCC+序列2+GCGGCCGCCTC”纯化回收后，用限制性内切酶BamH>

将经测序表明，在pET-28a(+)质粒的酶切位点BamH I和Not I之间插入序列2所示DNA片段后的重组质粒命名为pET-28a-UGT5。

2、表达宿主系统构建

将步骤1构建好的重组表达载体pET-28a-UGT5转化到大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞，挑选阳性克隆进行PCR验证后，送测序验证表达系统的正确性。

3、诱导表达及目的蛋白SaUGT5的提取

(a)吸取步骤2经测序验证正确的表达菌株转到含50mg/L Kan的200mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀到0.6-1.0；

(b)加入适量IPTG诱导剂(终浓度约为0.4mM)，30℃，200rpm诱导培养5h；

(c)200mL菌液，4℃，5000g离心10min，弃菌液，收集菌体；

(d)用预冷的纯水清洗菌液2次，4℃，5000g离心10min，弃菌液，收集菌体；

(e)用预冷的缓冲液A【配方：Tris-HCl(pH7.4，1M)2.5mL；EDTA(0.5M)100μL；甘油(50％V/V)10μL；PMSF(100mM)500μL；ddH₂O>

(f)用超声波细胞破碎机超声破碎(30％功率，超声5s，间隔5s，持续5min)；

(g)4℃，13000rpm离心15min；

(h)取上清分装(200μL/管)放置-80℃冰箱备用。

实验同时设置了以pET-28a(+)质粒替代pET-28a-UGT5的对照，得到空载对照上清。

实施例3、欧洲花楸植保素糖基转移酶的活性验证

一、实验方法

1、外源表达糖基转移酶催化活性的筛选

在糖基转移酶活性初步筛选中，以SaUGT5的粗酶液进行筛选实验。分别以Rhaphiolepsin(化合物1，如式I所示)、2'-Hydroxyaucuparin(化合物2，如式II所示)和Noraucuparin(化合物3，如式III所示)这三种联苯植保素为糖基化的受体底物，以UDP-葡萄糖作为供体进行酶促反应。

糖基转移酶活性筛选反应体系为：SaUGT5粗酶液(即实施例2步骤3(h)中的上清)194μL；UDP-葡萄糖(40mM)4μL；受体底物(40mM)2μL。

实验同时以实施例2制备的空载对照上清作为对照。

糖基转移酶活性筛选反应条件为：在30℃条件下，反应16h，加入400μL甲醇终止反应，振摇混匀，1,4000g离心20min，取上清过0.22μm滤膜，待测。

2、酶促产物UPLC检测

色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18超高效液相柱(WatersCorporation,Milford,MA,USA,2.1×100mm,1.7μm)，柱温35℃。流动相为0.1％甲酸-水溶液(A)-0.1％甲酸-乙腈(B)(％表示体积百分含量)，梯度洗脱程序为(0-4)min，10％-40％B；(4.0-5.0)min，40％-52％B；(5.0-8.0)min，52％-72％B；(8.0-8.2)min，72％-95％B(％表示体积百分含量)。流速0.5mL/min。进样量：1μL。

3、SaUGT5催化糖基化放大反应以及产物的制备与分离

将SaUGT5的粗酶液进行放大酶促反应并制备糖基化产物。反应体系为30mL，包括SaUGT5粗酶液(即实施例2步骤3(h)中的上清)，UDP-葡萄糖(40mM)0.5mL，受体底物(80mM)0.125mL，在30℃水浴锅中反应过夜，用2倍体积乙酸乙酯萃取5次，有机相加压蒸干后用约2mL甲醇溶解，过0.22μm滤膜，使用乙腈-水作为流动相进行半制备。液相系统：岛津制备液相色谱仪LC-20AR；制备柱为：YMC-Pack ODS-A(20×250mm,5.0μm)。将分离得到的各产物进行高分辨质谱以及¹H-NMR，¹³C-NMR，H-H>

二、实验结果

1、外源表达糖基转移酶催化活性的筛选

在对糖基转移酶活性进行初步筛选中，以市场购得的UDP-葡萄糖作为糖供体，3种联苯植保素(式I、式II和式III)作为受体进行活性筛选实验。通过UPLC-UV检测极性变大的糖基化产物，检测结果显示相对于空载，外源表达SaUGT5的粗酶液能催化3种联苯底物各形成两种新的产物，如图1、图2和图3所示。

2、重组糖基转移酶SaUGT5催化糖基化产物的研究

图4显示，图1中的产物1a和1b与受体底物1的UV吸收谱图基本一致，且1a和1b分子离子峰分别为m/z 407.1289[M-H]^-和m/z>-，较受体底物1分子量大162。因此，产物1a和1b分别为在受体底物1的不同羟基位上加上了1分子葡萄糖。

图5显示，图2中的产物2a和2b与受体底物2的UV吸收谱图基本一致，且2a和2b分子离子峰分别为m/z 453.1360[M+HCOO]^-和m/z>

图6显示，图3中的产物3a和3b与受体底物3的UV吸收谱图基本一致，且3a和3b分子离子峰分别为m/z 377.1170[M-H]^-和m/z>-，较受体底物3分子量大162。因此，产物3a和3b分别为在受体底物3的不同羟基位上加上了1分子葡萄糖。

3、利用重组糖基转移酶SaUGT5制备糖基化修饰产物

为了进一步确定重组糖基转移酶SaUGT5催化形成不同化合物的糖基化位置，进而系统性评价SaUGT5的催化功能，本发明对具有生物活性的SaUGT5的糖基化产物进行了酶促放大反应的制备。各催化受体底物的糖基化产物制备条件见表1。所有制备出的化合物均利用MS、¹H-NMR，¹³C-NMR，H-H>

表1糖基化产物制备

糖基化产物的MS，¹H-NMR，¹³C-NMR数据具体如下：

Rhaphiolepsin 5-O-β-D-glucopyranoside(1a)

HR-ESI-MS(neg)m/z 407.1289[M-H]^-(Calcd.for>20H₂₃O₉,407.1342),ESI-MS(neg)m/z>-,245[M-H-162]^-.¹H-NMR(600MHz,CD₃OD)δ7.42(2H,dd,J＝8.6,2.0Hz,H-2′,6′),7.02(1H,d,J＝1.9Hz,H-2),6.85(2H,d,J＝8.6,2.0Hz,H-3′,5′),6.80(1H,d,J＝1.9Hz,H-2),4.74(1H,d,J＝7.8Hz,glc-H-l),3.25-3.83(6H,m,glc-H-2,3,4,5,6),3.81(3H,s,3-OCH₃),3.71(3H,s,4′-OCH₃)；¹³C-NMR(150MHz,CD₃OD)δ132.2(C-1),105.2(C-2),145.9(C-3),135.3(C-4),148.5(C-5),108.5(C-6),133.4(C-1′),127.7(C-2′,6′),113.7(C-3′,5′),159.0(C-4′),55.5(3-OCH₃),54.3(4′-OCH₃),101.9(glc-C-1),73.6(glc-C-2),77.1(glc-C-3),70.1(glc-C-4),76.3(glc-C-5),61.2(glc-C-6).

2'-Hydroxyaucuparin 2'-O-β-D-glucopyranoside(2b)

HR-ESI-MS(negative)m/z>-(Calcd.for>20H₂₃O₉,407.1342),ESI-MS(neg)m/z>-,245[M-H-162]^-.¹H-NMR(600MHz,CD₃OD):7.27-7.30(2H,m,H-4′,6′),7.04-7.05(2H,m,H-3′,5′),6.78(2H,s,H-2,6),4.83(1H,d,J＝7.8Hz,glc-H-l),3.32-3.94(6H,m,glc-H-2,3,4,5,6),3.78(6H,s,3,5-OCH₃)；¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃):δ130.7(C-1),107.3(C-2,6),152.4(C-3,5),135.5(C-4),130.7(C-1′),153.9(C-2′),115.7(C-3′),128.6(C-4′),119.5(C-5′),130.2(C-6′),55.7(3,5-OCH₃),101.8(glc-C-1),73.7(glc-C-2),77.0(glc-C-3),69.9(glc-C-4),76.1(glc-C-5),63.0(glc-C-6).

Noraucuparin 5-O-β-D-glucopyranoside(3a)

HR-ESI-MS(negative)m/z 377.1170[M-H]^-(Calcd.for>19H₂₁O₈,377.1236),ESI-MS(neg)m/z>-,215[M-H-162]^-.¹H-NMR(600>3OD)δ7.49(2H,d,J＝7.4>H₃),3.71(3H,s,4′-OCH₃)；¹³C-NMR(150>3OD)δ132.1(C-1),105.6(C-2),146.0(C-3),130.6(C-4),148.6(C-5),109.0(C-6),140.9(C-1′),126.2(C-2′,6′),128.4(C-3′,5′),126.3(C-4′),55.5(3-OCH₃),102.9(glc-C-1),73.6(glc-C-2),77.1(glc-C-3),72.5(glc-C-4),76.3(glc-C-5),61.1(glc-C-6).

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120> 来源于欧洲花楸的植保素糖基转移酶及其编码基因与应用

<130> GNCLN171139

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 480

<212> PRT

<213> 欧洲花楸（Sorbus aucuparia L.）

<400> 1

Met Gly Asp Val Ile Val Leu Tyr Ala Ala Pro Gly Met Gly His Ile

1 5 1015

Ile Ser Met Val Glu Leu Gly Lys Leu Ile Leu His Arg Tyr Gly Pro

202530

His Lys Phe Ser Ile Thr Ile Leu Tyr Thr Cys Gly Ser Leu Tyr Asp

354045

Thr Pro Ser Ile Pro Ala Tyr Ile Arg Arg Ile Ser His Ser His Pro

505560

Ser Ile Ser Phe Arg Gln Phe Pro Arg Val Thr Asn Lys Ile Thr Gln

65707580

Asn Ile Ser Gly Thr Ala Ile Leu Val Asp Phe Val Arg Gln Asn Asp

859095

Pro His Val Arg Arg Ala Leu Gln Asp Ile Ser Lys Ser Ala Val Val

100 105 110

Arg Ala Phe Ile Ile Asp Val Phe Cys Thr Ser Ala Leu Thr Ile Gly

115 120 125

Lys Glu Phe Asp Ile Pro Thr Tyr Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Ala Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Ala Phe Leu Tyr Phe Pro Lys Ile His Glu Gln Thr Thr

145 150 155 160

Gln Ser Phe Lys Asp Leu Thr Asp Thr Val Ile Glu Phe Pro Gly Arg

165 170 175

Lys Ser Pro Leu Lys Ala Ile His Met Ile Glu Pro Leu Leu Asp Arg

180 185 190

Asp Asp Pro Ala Tyr Trp Asp Phe Leu Ser Phe Cys Ser His Leu Pro

195 200 205

Lys Ser Lys Gly Ile Ile Val Asn Thr Phe Glu Glu Leu Glu Pro Pro

210 215 220

Ala Val Leu His Ala Ile Ala Glu Gly Leu Cys Val Pro Asp Gly Pro

225 230 235 240

Thr Ser Pro Val Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ile Asp Glu Glu Lys Val

245 250 255

Thr Gly Asn Asp Ala Ala Ala Ala Glu Glu Asp Cys Leu Ser Trp Leu

260 265 270

Asp Lys Gln Pro Ser Arg Ser Val Val Phe Leu Cys Phe Gly Ser Arg

275 280 285

Gly Ser Phe Pro Ala Ile Gln Leu Lys Glu Ile Ala Lys Ala Leu Glu

290 295 300

Ala Ser Gly Gln Arg Phe Leu Trp Met Val Lys Lys Pro Pro Val Asp

305 310 315 320

Glu Lys Thr Lys Gln Val Leu Gly Val Asp Asp Phe Asp Leu Glu Gly

325 330 335

Val Leu Pro Glu Gly Phe Leu Glu Arg Thr Lys Asp Arg Gly Met Val

340 345 350

Val Lys Ser Trp Thr Pro Gln Val Glu Val Leu Lys Lys Glu Ser Val

355 360 365

Gly Gly Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Val Leu Glu Ala Val

370 375 380

Val Ala Gly Val Pro Met Ile Ala Trp Pro Leu Tyr Ala Glu Gln His

385 390 395 400

Leu Asn Arg Asn Val Met Ala Thr Asp Met Glu Ile Ala Ile Ala Val

405 410 415

Glu Gln Arg Asp Glu Glu Asp Gly Phe Val Ser Gly Glu Glu Leu Glu

420 425 430

Arg Arg Val Arg Glu Leu Met Glu Ser Glu Glu Gly Arg Val Leu Arg

435 440 445

Glu Arg Ser Lys Lys Ile Gly Glu Met Ala Met Ala Ala Leu Gly Glu

450 455 460

Asn Gly Ser Ser Thr Arg Asn Leu Val Asn Phe Val Asn Ser Phe Thr

465 470 475 480

<210> 2

<211> 1443

<212> DNA

<213> 欧洲花楸（Sorbus aucuparia L.）

<400> 2

atgggagacg taatagtgct gtacgcagct ccaggaatgg ggcacatcat ctccatggtg 60

gagctgggca agctcatcct ccaccgctac ggcccccaca agttctccat caccattctc 120

tacacctgcg gcagcctcta cgacacccct agcatccccg cctacatccg ccgcatctcc 180

cactcccacc cttccatttc cttccgccaa ttccctcgcg tcaccaataa aattacccaa 240

aacatcagcg gcaccgcaat tctggtcgac ttcgttcgtc agaacgatcc ccacgtccgc 300

cgtgccctcc aagacatctc caaatccgcc gtcgtccgcg ccttcatcat cgacgtcttc 360

tgcacctccg cgctgaccat cggcaaggaa ttcgacatcc ccacatatta cttctacact 420

tctggtgccg cagctctggg tgcttttttg tatttcccta agatccatga acaaaccacc 480

cagagtttca aggacctcac cgacaccgtt atcgaattcc ccggacggaa atctcctctg 540

aaggctatac acatgatcga accgctgctc gaccgagacg accctgctta ttgggacttc 600

ctctcctttt gctcacatct tcccaaatcc aaaggaatca tcgtcaacac gttcgaagag 660

ctcgagccgc ctgccgtcct ccatgccatt gctgaaggcc tgtgtgttcc tgatgggcca 720

acttcacctg tgtactacgt tggaccattg attgacgaag aaaaagtaac gggtaatgat 780

gcagctgcgg ccgaggagga ctgcttgtca tggctcgata agcagccaag tcgaagcgtg 840

gtttttctct gtttcggaag caggggatca ttccctgcaa ttcaactgaa ggagatagcg 900

aaagcgttgg aggcgagcgg gcagaggttc ctgtggatgg tgaagaagcc gccggttgat 960

gagaaaacaa agcaggtcct tggagttgac gactttgatt tggagggtgt gttgccagaa 1020

gggttcttgg agaggaccaa agacaggggg atggtagtga agtcatggac accgcaggtg 1080

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