使用新型酶生产稀有脂肪酸的方法以及新型稀有脂肪酸

摘要

本发明提供了通过使用来源于乳酸菌并使用脂肪酸作为底物的新型酶的水合反应来生产羟基化脂肪酸，并且还提供了使用所述羟基化脂肪酸作为底物通过酶促反应或化学氧化反应生产氧代脂肪酸的方法。本发明也提供了由上述方法之一所生产的且有利用价值的新型稀有脂肪酸。

说明书

技术领域

本发明涉及脂肪酸的生产方法。更具体地讲，本发明涉及通过使用不饱和脂肪酸作为原材料生产羟基化脂肪酸，其特征在于通过新型酶的水合反应，并且还涉及通过酶反应或化学氧化反应从羟基化脂肪酸生产氧代脂肪酸。另外，其涉及通过所述生产方法获得的新型稀有脂肪酸。

背景技术

已报道，以共轭亚油酸（CLA）为代表的共轭脂肪酸具有各种生理活性如改善脂质代谢效果、抗动脉硬化作用、降低体脂肪作用等（非专利文件1-3），并且是预期适用于药物、功能性食物等各个领域的功能性脂质（专利文件1、2）。虽然已知乳制品和肉制品中含有CLA（因为其是由反刍动物胃中存在的微生物产生的）并且少量存在于植物油中，但是其产生的详细机理尚不了解。

本发明人报道了存在于植物乳杆菌（Lactobacillus>）菌体中的酶（CLA-HY、CLA-DC、CLA-DH）对于将亚油酸转化成共轭亚油酸的反应是必要的（专利文件1）。已经报道了这些酶反应中一系列特定反应的机理、中间体的存在等（专利文件4）。虽然对于生产在含18个碳原子的不饱和脂肪酸（如亚油酸等）的10-位具有羟基、羰基的稀有脂肪酸而言，这些酶反应是有效的，但是在13-位具有羟基、羰基的稀有脂肪酸的生产方法尚不清楚。

另外，近年来已经报道了番茄中含有的氧代脂肪酸（如9-氧代-十八碳二烯酸、13-氧代-十八碳二烯酸等）具有改善与生活方式相关的疾病的活性，如改善脂质代谢等（专利文件3；非专利文件4、5）。此外，已经报道了在10-位具有羟基、氧代基的羟基化脂肪酸和氧代脂肪酸具有改善与生活方式相关的疾病的活性（如改善代谢、改善脂质代谢等）以及改善肠屏障功能的活性（专利文件5、6），羟基化脂肪酸和氧代脂肪酸正受到越来越多的关注。然而，从不饱和脂肪酸合成功能性羟基化脂肪酸、功能性氧代脂肪酸是困难的，这是因为在羟基化脂肪酸和氧代脂肪酸中，有必要区分不饱和脂肪酸分子中存在的多个双键并在特定位置引入羟基、羰基。

[文件列表]

[专利文件]

专利文件1：JP-A-2007-259712

专利文件2：JP-A-2007-252333

专利文件3：JP-A-2011-184411

专利文件4：WO 2013/168310

专利文件5：WO 2014/069227

专利文件6：WO 2014/129384

[非专利文件]

非专利文件1：Ha YL, (1987), Carcinogenesis, 第8卷, 第12号, 第1881-1887页

非专利文件2：Clement Ip, (1991), Cancer Res., 第51卷, 第6118-6124页

非专利文件3：Kisun NL, (1994), Atherosclerosis, 第108卷, 第19-25页

非专利文件4：Kim Y-I,(2011), Mol. Nutr. Food Res., 第55卷, 第585-593页

非专利文件5：Kim Y-I,(2012), PLoS ONE, 第7卷, 第2号, e31317。

发明内容

本发明要解决的问题

本发明的目标是提供通过使用不饱和脂肪酸作为原材料并使用新型酶生产羟基化脂肪酸、氧代脂肪酸的方法。

解决问题的方法

本发明人已经阐明了反应，其中嗜酸乳杆菌（Lactobacillus>）羟基化含有18个碳原子的不饱和脂肪酸的13-位，并且识别出了生产中涉及到的新型酶（FA-HY）。

本发明人已经发现了通过使用新型酶（FA-HY）将含有16、18、20个碳原子的不饱和脂肪酸、顺-4,顺-7,顺-10,顺-13,顺-16,顺-19-二十二碳六烯酸（DHA）和顺-9-十四碳烯酸（肉豆蔻脑酸）转化成羟基化脂肪酸的方法，并且还发现了通过酶反应或化学反应氧化所生成物质的羟基的方法。

本发明人已经通过使用新型酶（FA-HY）的新型稀有脂肪酸的生产方法生产了所发现的具有此前从未发现的结构的羟基化脂肪酸和氧代脂肪酸，并且发现其具有核受体PPARα和PPARγ激动剂活性。

具体而言，本发明人已经发现了通过使用新型酶（FA-HY）从亚油酸生产13-羟基-顺-9-十八碳烯酸，并且还发现了通过引入酶反应或使用铬酸的化学氧化方法从13-羟基-顺-9-十八碳烯酸生产13-氧代-顺-9-十八碳烯酸。

本发明人已经进一步研究并发现使用新型酶（FA-HY），分别从含有18个碳原子并在12-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸（亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸、(6Z,9Z,12Z,15Z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸(stearidonic acid)等）、含有16个碳原子并在9-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸（棕榈油酸(pulmitoleic aicd)等）、含有20个碳原子并在14-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸（二高-γ-亚麻酸或花生四烯酸等）、含有18或20个碳原子并在11-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸（11-顺-十八碳烯酸(cis-vaccenic acid)、二高-γ-亚麻酸、(5Z,8Z,11Z)-二十碳-5,8,11-三烯酸(mead acid)等）作为底物，生产在13-位、10-位、15-位、12-位被羟基化的脂肪酸。此外，他们还已经发现通过使用DHA作为底物生产14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸以及通过使用肉豆蔻脑酸作为底物生产10-羟基-十四烷酸。另外，他们已经发现所得产物中的一些羟基化脂肪酸具有此前从未发现的结构并且其为新物质。他们已经发现此类包含新型脂肪酸的羟基化脂肪酸具有作为核受体PPARα和PPARγ的激动剂的活性，并且是可用作代谢改善剂等的物质。

他们也已经发现由本发明获得的羟基化脂肪酸作为原材料可以通过引入酶反应或使用铬酸的化学氧化方法而被转化成氧代脂肪酸。他们已经在此类所得产物的氧代脂肪酸中发现了具有此前从未发现的结构的新物质。他们已经发现此类氧代脂肪酸（包括新型脂肪酸）具有作为核受体PPARα和PPARγ的激动剂的活性，并且其是可用作代谢改善剂等的物质。已经基于以上发现完成了本发明。

因此，本发明提供了下列内容：

[1] 下列(a) - (c)中任一项的酶蛋白质：

(a) 由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列组成的酶蛋白质；

(b) 蛋白质，其包含氨基酸序列并且具有催化水合反应的酶活性，在所述氨基酸序列中SEQ ID NO: 2所示的所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被缺失和/或取代和/或插入和/或添加；

(c) 蛋白质，其由碱基序列编码并且具有催化水合反应的酶活性，所述碱基序列在严格条件下杂交至核酸，所述核酸由与SEQ ID NO: 1所示的碱基序列互补的链序列组成；

[2] 嗜酸乳杆菌（Lactobacillus>）菌体或其菌体碎片，包含[1]的酶蛋白质；

[3] 编码[1]的酶蛋白质的核酸；

[4] 包含[3]的核酸的载体；

[5] 用[4]的载体转化的宿主细胞；

[6] 生产[1]的酶蛋白质的方法，包括培养[5]的宿主细胞以及从所述培养物中回收所述酶；

[7] 生产含有18个碳原子并在13-位具有羟基的羟基化脂肪酸的方法，包括使含有18个碳原子并在12-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸经受使用[1]的酶蛋白质的水合反应；

[8] 生产含有18个碳原子并在13-位具有羰基的氧代脂肪酸的方法，包括使含有18个碳原子并在12-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸经受使用[1]的酶蛋白质的水合反应，以诱导含有18个碳原子并在13-位具有羟基的羟基化脂肪酸，并使所述羟基化脂肪酸经受脱氢反应或化学氧化；

[9] 生产含有16个碳原子并在10-位具有羟基的羟基化脂肪酸的方法，包括使含有16个碳原子并在9-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸经受使用[1]的酶蛋白质的水合反应；

[10] 生产含有16个碳原子并在10-位具有羰基的氧代脂肪酸的方法，包括使含有16个碳原子并在9-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸经受使用[1]的酶蛋白质的水合反应，以诱导含有16个碳原子并在10-位具有羟基的羟基化脂肪酸，并使所述羟基化脂肪酸经受脱氢反应或化学氧化；

[11] 生产含有20个碳原子并在15-位具有羟基的羟基化脂肪酸的方法，包括使含有20个碳原子并在14-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸经受使用[1]的酶蛋白质的水合反应；

[12] 生产含有20个碳原子并在15-位具有羰基的氧代脂肪酸的方法，包括使含有20个碳原子并在14-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸经受使用[1]的酶蛋白质的水合反应，以诱导含有20个碳原子并在15-位具有羟基的羟基化脂肪酸，并使所述羟基化脂肪酸经受脱氢反应或化学氧化；

[13] 生产含有18或20个碳原子并在12-位具有羟基的羟基化脂肪酸的方法，包括使含有18或20个碳原子并在11-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸经受使用[1]的酶蛋白质的水合反应；

[14] 生产含有18或20个碳原子并在12-位具有羰基的氧代脂肪酸的方法，包括使含有18或20个碳原子并在11-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸经受使用[1]的酶蛋白质的水合反应，以诱导含有18或20个碳原子并在12-位具有羟基的羟基化脂肪酸，并使所述羟基化脂肪酸经受脱氢反应或化学氧化；

[15] [7]或[8]的方法，其中所述含有18个碳原子并在12-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸为亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸、(6Z,9Z,12Z,15Z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸、10-羟基-顺-12-十八碳烯酸、10-羟基-顺-6,顺-12-十八碳二烯酸、10-羟基-顺-12,顺-15-十八碳二烯酸、10-羟基-顺-6,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸、10-氧代-顺-12-十八碳烯酸、10-氧代-顺-6,顺-12-十八碳二烯酸、10-氧代-顺-12,顺-15-十八碳二烯酸、10-氧代-顺-6,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸、皮诺敛酸(pinolenic acid)或哥伦比亚酸(columbinic acid)；

[16] [9]或[10]的方法，其中所述含有16个碳原子并在9-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸为棕榈油酸（pulmitoleic acid）；

[17] [11]或[12]的方法，其中所述含有20个碳原子并在14-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸为顺-11,顺-14-二十碳二烯酸、顺-11,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、顺-8,顺-11,顺-14,顺-17-二十碳四烯酸、花生四烯酸、5(Z),11(Z),14(Z)-二十碳三烯酸(sciadonic acid)或(5Z,11Z,14Z,17Z)-5,11,14,17-二十碳四烯酸(juniperonicacid)；

[18] [13]或[14]的方法，其中所述含有18或20个碳原子并在11-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸为11-顺-十八碳烯酸、顺-11-顺-14-二十碳二烯酸、顺-11,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、(5Z,8Z,11Z)-二十碳-5,8,11-三烯酸、顺-8,顺-11,顺-14,顺-17-二十碳四烯酸或花生四烯酸；

[19] 生产14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸的方法，包括使顺-4,顺-7,顺-10,顺-13,顺-16,顺-19-二十二碳六烯酸经受使用[1]的酶蛋白质的水合反应；

[20] 生产14-氧代-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸的方法，包括使顺-4,顺-7,顺-10,顺-13,顺-16,顺-19-二十二碳六烯酸经受使用[1]的酶蛋白质的水合反应以诱导14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸，并且使所述羟基化脂肪酸经受脱氢反应或化学氧化；

[21] 生产10-羟基-十四烷酸的方法，包括使顺-9-十四碳烯酸（肉豆蔻脑酸）经受使用[1]的酶蛋白质的水合反应；

[22] 生产10-氧代-十四烷酸的方法，包括使顺-9-十四碳烯酸（肉豆蔻脑酸）经受使用[1]的酶蛋白质的水合反应以诱导10-羟基-十四烷酸，并使所述羟基化脂肪酸经受脱氢反应或化学氧化；

[23] [8]、[10]、[12]、[14] - [18]、[20]或[22]的方法，其中所述脱氢反应使用来源于乳杆菌的脱氢酶；

[24] [23]的方法，其中所述乳杆菌为植物乳杆菌FERM BP-10549菌株；

[25] 由[7]的方法生产的13-羟基-顺-9,顺-15-十八碳二烯酸、13-羟基-顺-6,顺-9,顺-15-十八碳三烯酸、10,13-二羟基-顺-6-十八碳烯酸、10,13-二羟基-顺-15-十八碳烯酸、10,13-二羟基-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸、10-氧代-13-羟基-顺-6-十八碳烯酸、10-氧代-13-羟基-顺-15-十八碳烯酸、10-氧代-13-羟基-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸、13-羟基-顺-5,顺-9-十八碳二烯酸或13-羟基-反-5,顺-9-十八碳二烯酸；

[26] 由[11]的方法生产的15-羟基-顺-11,顺-17-二十碳二烯酸、15-羟基-顺-8,顺-11-二十碳二烯酸、15-羟基-顺-8,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸、15-羟基-顺-5,顺-11-二十碳二烯酸或15-羟基-顺-5,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸；

[27] 由[13]的方法生产的12-羟基-顺-14-二十碳烯酸、12-羟基-顺-14,顺-17-二十碳二烯酸或12-羟基-顺-8,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸；

[28] 由[8]的方法生产的13-氧代-顺-6,顺-9-十八碳二烯酸、13-氧代-顺-6,顺-9,顺-15-十八碳三烯酸、10,13-二氧代-顺-6-十八碳烯酸、10,13-二氧代-顺-15-十八碳烯酸、10,13-二氧代-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸、13-氧代-顺-5,顺-9-十八碳二烯酸或13-氧代-反-5,顺-9-十八碳二烯酸；

[29] 由[12]的方法生产的15-氧代-顺-11,顺-17-二十碳二烯酸、15-氧代-顺-8,顺-11-二十碳二烯酸、15-氧代-顺-8,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸、15-氧代-顺-5,顺-11-二十碳二烯酸或15-氧代-顺-5,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸；

[30] 由[14]的方法生产的12-氧代-顺-14-二十碳烯酸、12-氧代-顺-14,顺-17-二十碳二烯酸、12-氧代-顺-8,顺-14-二十碳二烯酸、12-氧代-顺-5,顺-8-二十碳二烯酸或12-氧代-顺-8,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸；

[31] 由[19]的方法生产的14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸；

[32] 由[20]的方法生产的14-氧代-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸；

[33] 含脂肪酸的物质，其包含[25] - [32]中任一项的羟基化脂肪酸或氧代脂肪酸；

[34] 包括[1]的酶蛋白质的嗜酸乳杆菌菌体或其菌体碎片在生产[25] - [32]中任一项的羟基化脂肪酸或氧代脂肪酸中的用途。

[发明效果]

在本发明中，发现了传统上未知的脂肪酸水合酶（FA-HY），发现了将含有16、18或20个碳原子的不饱和脂肪酸、DHA或肉豆蔻脑酸转化成羟基化脂肪酸的方法，并且还发现了通过酶反应或化学反应氧化所得物质的羟基的方法。要生产的稀有脂肪酸等极为有用，这是因为其用于如药物、食物、化妆品等各个领域中。另外，可以通过使用新型酶的生产来产生新型稀有脂肪酸，并且所述新型稀有脂肪酸也具有作为核受体PPARα和PPARγ的激动剂的活性。因此，其可以是用于如药物、食物、化妆品等各个领域中的有用物质。

[附图说明]

图1示出了源自亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸和花生四烯酸的稀有脂肪酸的PPARα激动剂活性的结果。EtOH显示阴性对照（加入乙醇），而GW7647显示阳性对照（加入PPARα激动剂）。纵轴显示相对的萤光素酶活性。

图2示出了源自亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸和花生四烯酸的稀有脂肪酸的PPARγ激动剂活性的结果。EtOH显示阴性对照（加入乙醇），而Tro显示阳性对照（加入PPARγ激动剂）。纵轴显示相对的萤光素酶活性。

[具体实施方式]

本发明详细解释于下。

本发明提供了新型脂肪酸水合酶“FA-HY”。

具体地讲，本发明的新型酶“FA-HY”是

(a) 由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列组成的酶蛋白质；

(b) 蛋白质，其包含氨基酸序列并且具有酶活性，在所述氨基酸序列中SEQ ID NO: 2所示的所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被缺失和/或取代和/或插入和/或添加，所述酶活性是由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列组成的酶蛋白质所具有的酶活性；或

(c) 蛋白质，其由碱基序列编码并且具有酶活性，所述碱基序列在严格条件下杂交至核酸，所述核酸由与SEQ ID NO: 1所示的碱基序列互补的链序列组成，所述酶活性是由SEQID NO: 2所示的氨基酸序列组成的酶蛋白质所具有的酶活性。

上述(b)的更具体的实例包括含有以下的蛋白质：(i)氨基酸序列，其是SEQ IDNO: 2所示的氨基酸序列，其中1 - 20、优选1 - 10、更优选1 - 几个（5、4、3或2）氨基酸被缺失，(ii) 氨基酸序列，其是SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，其中1 - 20、优选1 - 10、更优选1 –几个数目（5、4、3或2）的氨基酸被添加，(iii）氨基酸序列，其是SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，其中1 - 20、优选1 - 10、更优选1 –几个（5、4、3或2）氨基酸被插入，(iv)氨基酸序列，其是SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，其中1 - 20、优选1 - 10、更优选1 –几个（5、4、3或2）氨基酸被其它氨基酸取代，或(v) 通过将其组合而获得的氨基酸序列。当具有相似特性的氨基酸（例如，甘氨酸和丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸和异亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、赖氨酸和精氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等）彼此取代等时，可能有更大数目的取代等。

当如上所述氨基酸被缺失、取代或插入时，缺失、取代和插入的位置不受特别限制，只要上述酶活性得以保持。

在上述(c)中，“严格条件”是这样的条件：在该条件下，具有高同一性（例如，70、80、90、95或99%或以上的同一性）的核苷酸序列相互杂交，而具有低于所述的同一性的核苷酸序列不杂交；具体地讲，于对应于常规DNA杂交的洗涤条件中那些的盐浓度和温度（60℃,1xSSC, 0.1% SDS, 优选地，0.1xSSC, 0.1% SDS, 更优选地, 68℃, 0.1xSSC, 0.1% SDS）等，洗涤一次、更优选2 – 3次的条件。

关于上述(b)或(c)，由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列组成的酶蛋白质所具有的酶活性不受特别限制，只要其具有下列中的至少一项、优选全部：（1）能够将用作底物的含有18个碳原子并在12-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸（在下文中有时简称“顺-12不饱和脂肪酸”）转化成含有18个碳原子并在13-位具有羟基的羟基化脂肪酸（在下文中有时简称“13-羟基脂肪酸”）（反应 1）的酶活性；（2）能够将用作底物的含有16个碳原子并在9-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸（在下文中有时简称“顺-9不饱和脂肪酸”）转化成含有16个碳原子并在10-位具有羟基的羟基化脂肪酸（在下文中有时简称“10-羟基脂肪酸”）（反应 2）的酶活性；（3）能够将用作底物的含有20个碳原子并在14-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸（在下文中有时简称“顺-14不饱和脂肪酸”）转化成含有20个碳原子并在15-位具有羟基的羟基化脂肪酸（在下文中有时简称“15-羟基脂肪酸”）（反应 3）的酶活性；（4）能够将用作底物的含有18或20个碳原子并在11-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸（在下文中有时简称“顺-11不饱和脂肪酸”）转化成含有18或20个碳原子并在12-位具有羟基的羟基化脂肪酸（在下文中有时简称“12-羟基脂肪酸”）（反应 4）的酶活性、能够将顺-4,顺-7,顺-10,顺-13,顺-16,顺-19-二十二碳六烯酸（DHA）转化成14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸（反应 A）的酶活性以及能够将顺-9-十四碳烯酸（肉豆蔻脑酸）转化成10-羟基-十四烷酸（反应 I）的酶活性。

上述“顺-12不饱和脂肪酸”、“顺-9不饱和脂肪酸”、“顺-14不饱和脂肪酸”和“顺-11不饱和脂肪酸”不受特别限制，只要其分别是含有18个碳原子并在12-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸、含有16个碳原子并在9-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸、含有20个碳原子并在14-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸、含有18或20个碳原子并在11-位具有顺式双键的不饱和脂肪酸，并且可以提及例如，单价不饱和脂肪酸、二价不饱和脂肪酸、三价不饱和脂肪酸、四价不饱和脂肪酸、五价不饱和脂肪酸等。在本说明书中，“脂肪酸”不仅涵盖了游离酸，而且涵盖了酯的形式、与碱性化合物的盐等。“DHA”和“肉豆蔻脑酸”也不仅涵盖了游离酸，而且涵盖了酯的形式、与碱性化合物的盐等。

本发明的FA-HY可以通过本身已知的蛋白质分离和纯化技术分离自，例如，嗜酸乳杆菌的菌体、培养基。作为另外一种选择，FA-HY可作为含有FA-HY的嗜酸乳杆菌的菌体或其菌体碎片使用。含有FA-HY的嗜酸乳杆菌的菌体不受特别限制，只要其含有本发明的FA-HY，并且，例如，可以提及NITE BP-01788等。作为另外一种选择，FA-HY也可以通过如下步骤作为重组蛋白质生产：根据实施例2中所述的方法分离编码FA-HY的基因，将所述基因亚克隆到合适的载体中，将所述载体引入到合适的宿主（如大肠杆菌(Escherichia>)等）中并培养所述宿主。FA-HY可以是经过纯化或粗纯化的。作为另外一种选择，可以在菌体（如大肠杆菌等）中表达水合酶，并且可使用所述菌体自身或可使用其培养基。此外，所述酶可以是游离形式或由各种载体固定化的。

作为含有编码本发明的FA-HY的核酸的载体，适用于将要引入所述载体的宿主细胞的载体可以根据目标（例如，蛋白质表达）而恰当选择并使用。就表达载体而言，其含有本发明的核酸，所述核酸可操作地连接至适当的启动子，并且优选地在本发明的核酸的下游含有转录终止信号，即，终止子区。此外，其也可以含有用以选择转化体的选择标记基因（耐药基因、补充营养缺陷型突变的基因等）。其也可含有编码标签序列的序列，所述标签序列用于分离和纯化所表达蛋白质等。另外，可将载体整合入靶宿主细胞的基因组中。可以通过本身已知的转化方法（如感受态细胞法、原生质体法、磷酸钙共沉淀法等）将本发明的载体引入到靶宿主细胞中。

在本发明中，“宿主细胞”可以是任何细胞，只要其可以表达含有编码本发明的FA-HY的核酸的载体，并且可以提及细菌、酵母、真菌、高等真核细胞等。细菌的实例包括革兰氏阳性细菌（如芽孢杆菌、链霉菌属(Streptomyces)等）和革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等）。引入了含有编码FA-HY的核酸的载体的重组细胞可以通过本身已知的适用于所述宿主细胞的方法来培养。

“纯化”本发明的FA-HY可以通过本身已知的方法进行，例如，将通过离心等收集到的菌体通过超声处理或玻璃珠等破裂，将固体（如细胞碎片）通过离心等移除等以得到粗酶溶液，使所述粗酶溶液经受盐析法（使用硫酸铵、硫酸钠等）、层析（如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等）、凝胶电泳等。

如上所述，本发明的FA-HY具有能够将用作底物的顺-12不饱和脂肪酸、顺-9不饱和脂肪酸、顺-14不饱和脂肪酸、顺-11不饱和脂肪酸、DHA、肉豆蔻脑酸分别转化成13-羟基脂肪酸、10-羟基脂肪酸、15-羟基脂肪酸、12-羟基脂肪酸、14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸、10-羟基-十四烷酸的酶活性。因此，本发明也提供了[1]通过使用本发明的FA-HY的水合反应从顺-12不饱和脂肪酸生产13-羟基脂肪酸的方法（生产方法1），[2]通过使用本发明的FA-HY的水合反应从顺-9不饱和脂肪酸生产10-羟基脂肪酸的方法（生产方法 2），[3]通过使用本发明的FA-HY的水合反应从顺-14不饱和脂肪酸生产15-羟基脂肪酸的方法（生产方法 3），[4]通过使用本发明的FA-HY的水合反应从顺-11不饱和脂肪酸生产12-羟基脂肪酸的方法（生产方法 4），[A]通过使用本发明的FA-HY的水合反应从DHA生产14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸的方法（生产方法 A）和[I]通过使用本发明的FA-HY的水合反应从肉豆蔻脑酸生产10-羟基-十四烷酸的方法（生产方法 I）。

本发明的生产方法1中的“顺-12不饱和脂肪酸”的实例包括：顺-9,顺-12-十八碳二烯酸（亚油酸）、顺-6,顺-9,顺-12-十八碳三烯酸（γ-亚麻酸）、顺-9,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸（α-亚麻酸）、顺-6,顺-9,顺-12,顺-15-十八碳四烯酸（(6Z,9Z,12Z,15Z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸）以及现在可以通过WO 2013/168310生产的10-羟基-顺-12-十八碳烯酸、10-羟基-顺-6,顺-12-十八碳二烯酸、10-羟基-顺-12,顺-15-十八碳二烯酸、10-羟基-顺-6,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸、10-氧代-顺-12-十八碳烯酸、10-氧代-顺-6,顺-12-十八碳二烯酸、10-氧代-顺-12,顺-15-十八碳二烯酸、10-氧代-顺-6,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸、顺-5,顺-9,顺-12-十八碳三烯酸（皮诺敛酸）、反-5,顺-9,顺-12-十八碳三烯酸（哥伦比亚酸）等。这些底物可以通过WO 2013/168310以外的方法获得。

由本发明的生产方法1所生产的“13-羟基脂肪酸”的实例包括：由顺-9,顺-12-十八碳二烯酸（亚油酸）诱导的13-羟基-顺-9-十八碳烯酸、由顺-6,顺-9,顺-12-十八碳三烯酸（γ-亚麻酸）诱导的13-羟基-顺-6,顺-9-十八碳二烯酸、由顺-9,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸（α-亚麻酸）诱导的13-羟基-顺-9,顺-15-十八碳二烯酸、由顺-6,顺-9,顺-12,顺-15-十八碳四烯酸（(6Z,9Z,12Z,15Z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸）诱导的13-羟基-顺-6,顺-9,顺-15-十八碳三烯酸、由10-羟基-顺-12-十八碳烯酸诱导的10,13-二羟基-十八烷酸、由10-羟基-顺-6,顺-12-十八碳二烯酸诱导的10,13-二羟基-顺-6-十八碳烯酸、由10-羟基-顺-12,顺-15-十八碳二烯酸诱导的10,13-二羟基-顺-15-十八碳烯酸、由10-羟基-顺-6,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸诱导的10,13-二羟基-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸、由10-氧代-顺-12-十八碳烯酸诱导的10-氧代-13-羟基-十八烷酸、由10-氧代-顺-6,顺-12-十八碳二烯酸诱导的10-氧代-13-羟基-顺-6-十八碳烯酸、由10-氧代-顺-12,顺-15-十八碳二烯酸诱导的10-氧代-13-羟基-顺-15-十八碳烯酸、由10-氧代-顺-6,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸诱导的10-氧代-13-羟基-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸、由顺-5,顺-9,顺-12-十八碳三烯酸（皮诺敛酸）诱导的13-羟基-顺-5,顺-9-十八碳二烯酸、由反-5,顺-9,顺-12-十八碳三烯酸 (哥伦比亚酸)诱导的13-羟基-反-5,顺-9-十八碳二烯酸等。

本发明的生产方法2中的“顺-9不饱和脂肪酸”的实例包括：顺-9-十六碳烯酸（棕榈油酸）等。

由本发明的生产方法2所生产的“10-羟基脂肪酸”的实例包括：由顺-9-十六碳烯酸（棕榈油酸）诱导的10-羟基-十六烷酸等。

本发明的生产方法3中的“顺-14不饱和脂肪酸”的实例包括：顺-11,顺-14-二十碳二烯酸、顺-11,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸、顺-8,顺-11,顺-14-二十碳三烯酸（二高-γ-亚麻酸）、顺-8,顺-11,顺-14,顺-17-二十碳四烯酸、顺-5,顺-8,顺-11,顺-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）、顺-5,顺-11,顺-14-二十碳三烯酸（5(Z),11(Z),14(Z)-二十碳三烯酸）、顺-5,顺-11,顺-14,顺-17-二十碳四烯酸（(5Z,11Z,14Z,17Z)-5,11,14,17-二十碳四烯酸）等。

由本发明的生产方法3所生产的“15-羟基脂肪酸”的实例包括：由顺-11,顺-14-二十碳二烯酸诱导的15-羟基-顺-11-二十碳烯酸、由顺-11,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸诱导的15-羟基-顺-11,顺-17-二十碳二烯酸、由顺-8,顺-11,顺-14-二十碳三烯酸（二高-γ-亚麻酸）诱导的15-羟基-顺-8,顺-11-二十碳二烯酸、由顺-8,顺-11,顺-14,顺-17-二十碳四烯酸诱导的15-羟基-顺-8,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸、由顺-5,顺-8,顺-11,顺-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）诱导的15-羟基-顺-5,顺-8,顺-11-二十碳三烯酸、由顺-5,顺-11,顺-14-二十碳三烯酸（5(Z),11(Z),14(Z)-二十碳三烯酸）诱导的15-羟基-顺-5,顺-11-二十碳二烯酸、由顺-5,顺-11,顺-14,顺-17-二十碳四烯酸（(5Z,11Z,14Z,17Z)-5,11,14,17-二十碳四烯酸）诱导的15-羟基-顺-5,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸等。

本发明的生产方法4中的“顺-11不饱和脂肪酸”的实例包括：顺-11-十八碳烯酸（11-顺-十八碳烯酸）、顺-11,顺-14-二十碳二烯酸、顺-11,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸、顺-8,顺-11,顺-14-二十碳三烯酸（二高-γ-亚麻酸）、顺-5,顺-8,顺-11-二十碳三烯酸（(5Z,8Z,11Z)-二十碳-5,8,11-三烯酸）、顺-8,顺-11,顺-14,顺-17-二十碳四烯酸、顺-5,顺-8,顺-11,顺-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）等。

由本发明的生产方法4所生产的“12-羟基脂肪酸”的实例包括：由顺-11-十八碳烯酸（11-顺-十八碳烯酸）诱导的12-羟基-十八烷酸、由顺-11,顺-14-二十碳二烯酸诱导的12-羟基-顺-14-二十碳烯酸、由顺-11,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸诱导的12-羟基-顺-14,顺-17-二十碳二烯酸、由顺-8,顺-11,顺-14-二十碳三烯酸（二高-γ-亚麻酸）诱导的12-羟基-顺-8,顺-14-二十碳二烯酸、由顺-5,顺-8,顺-11-二十碳三烯酸（(5Z,8Z,11Z)-二十碳-5,8,11-三烯酸）诱导的12-羟基-顺-5,顺-8-二十碳二烯酸、由顺-8,顺-11,顺-14,顺-17-二十碳四烯酸诱导的12-羟基-顺-8,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸、由顺-5,顺-8,顺-11,顺-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）诱导的12-羟基-顺-5,顺-8,顺-14-二十碳三烯酸等。

水合反应可以在合适的缓冲液（例如，磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液等）中通过以下进行：将作为底物的不饱和脂肪酸与本发明的FA-HY于合适的浓度混合并温育所述混合物。底物浓度为，例如，1 - 1000 g/L，优选10 - 500 g/L，更优选20 - 250 g/L。将要加入的上述FA-HY的量为，例如，0.001 - 10 mg/mL，优选0.1 - 5 mg/mL，更优选0.2- 2 mg/mL。

“辅因子”可用于水合反应（反应 1 - 4、反应 A 或反应 I）并且，例如，可使用FAD等。添加的浓度可以是任意的，只要所述水合反应有效地进行。优选0.001>

此外，“激活剂”可用于所述水合反应并且，例如，可以提及选自NADH和NADPH的1种或2种化合物。其添加的浓度可以是任意的，只要所述水合反应有效地进行。优选0.1 – 20mM，更优选1 – 10 mM。

期望的是，水合反应在本发明的FA-HY的优选温度下和优选pH范围内进行。例如，反应温度为5 - 50℃，优选20 - 45℃。反应混合物的pH为，例如，pH 4 - 10，优选pH 5 -9。反应时间不受特别限制，并且其为，例如，10 分钟 - 72 小时，优选30 分钟 - 36 小时。

在本发明的一个优选的实施方案中，将本发明的FA-HY以重组细胞（例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus>)、酵母、昆虫细胞、动物细胞等）的形式提供给反应体系，所述重组细胞中引入了含有编码所述酶的核酸的表达载体。在这种情况下，水合反应也可以通过如下进行：在适合于所述细胞的培养、并加入了辅因子和底物以及在必要时激活剂的液体培养基中培养所述细胞。

此外，通过脱氢反应或使用铬酸的化学氧化，从在本发明的生产方法 1 - 4、生产方法 A、生产方法 I中获得的13-羟基脂肪酸生产了含有18个碳原子并在13-位具有羰基的氧代脂肪酸（在下文中有时简称“13-氧代脂肪酸”）（反应 5），从10-羟基脂肪酸生产了含有16个碳原子并在10-位具有羰基的氧代脂肪酸（在下文中有时简称“10-氧代脂肪酸”）（反应6），从15-羟基脂肪酸生产了含有20个碳原子并在15-位具有羰基的氧代脂肪酸（在下文中有时简称“15-氧代脂肪酸”）（反应 7），从12-羟基脂肪酸生产了含有18或20个碳原子并在12-位具有羰基的氧代脂肪酸（在下文中有时简称“12-氧代脂肪酸”）（反应 8），从14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸生产了14-氧代-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸（反应 B），以及从10-羟基-十四烷酸生产了10-氧代-十四烷酸（反应 II）。

因此，本发明也提供了：[5] 生产13-氧代脂肪酸的方法，包括使顺-12不饱和脂肪酸经受使用本发明的FA-HY的水合反应以诱导13-羟基脂肪酸，并使所述13-羟基脂肪酸经受脱氢反应或化学氧化（生产方法 5）；[6] 生产10-氧代脂肪酸的方法，包括使顺-9不饱和脂肪酸经受使用本发明的FA-HY的水合反应以诱导10-羟基脂肪酸，并使所述10-羟基脂肪酸经受脱氢反应或化学氧化（生产方法 6）；[7] 生产15-氧代脂肪酸的方法，包括使顺-14不饱和脂肪酸经受使用本发明的FA-HY的水合反应以诱导15-羟基脂肪酸，并使所述15-羟基脂肪酸经受脱氢反应或化学氧化（生产方法 7）；[8] 生产12-氧代脂肪酸的方法，包括使顺-11不饱和脂肪酸经受使用本发明的FA-HY的水合反应以诱导12-羟基脂肪酸，并使所述12-羟基脂肪酸经受脱氢反应或化学氧化（生产方法 8）；[B] 生产14-氧代-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸的方法，包括使DHA经受使用本发明的FA-HY的水合反应以诱导14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸，并使所述14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸经受脱氢反应或化学氧化（生产方法 B）；以及 [II] 生产10-氧代-十四烷酸的方法，包括使肉豆蔻脑酸经受使用本发明的FA-HY的水合反应以诱导10-羟基-十四烷酸，并使所述10-羟基-十四烷酸经受脱氢反应或化学氧化（生产方法 II）。

本发明的生产方法5-8中的“顺-12不饱和脂肪酸”、“顺-9不饱和脂肪酸”、“顺-14不饱和脂肪酸”、“顺-11不饱和脂肪酸”与上述生产方法1-4中的底物相同。

由本发明的生产方法5所生产的“13-氧代脂肪酸”的实例包括：由顺-9,顺-12-十八碳二烯酸（亚油酸）诱导的13-氧代-顺-9-十八碳烯酸、由顺-6,顺-9,顺-12-十八碳三烯酸（γ-亚麻酸）诱导的13-氧代-顺-6,顺-9-十八碳二烯酸、由顺-9,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸（α-亚麻酸）诱导的13-氧代-顺-9,顺-15-十八碳二烯酸、由顺-6,顺-9,顺-12,顺-15-十八碳四烯酸（(6Z,9Z,12Z,15Z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸）诱导的13-氧代-顺-6,顺-9,顺-15-十八碳三烯酸、由10-羟基-顺-12-十八碳烯酸或10-氧代-顺-12-十八碳烯酸诱导的10,13-二氧代-十八烷酸、由10-羟基-顺-6,顺-12-十八碳二烯酸或10-氧代-顺-6,顺-12-十八碳二烯酸诱导的10,13-二氧代-顺-6-十八碳烯酸、由10-羟基-顺-12,顺-15-十八碳二烯酸或10-氧代-顺-12,顺-15-十八碳二烯酸诱导的10,13-二氧代-顺-15-十八碳烯酸、由10-羟基-顺-6,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸或10-氧代-顺-6,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸诱导的10,13-二氧代-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸、由顺-5,顺-9,顺-12-十八碳三烯酸（皮诺敛酸）诱导的13-氧代-顺-5,顺-9-十八碳二烯酸、由反-5,顺-9,顺-12-十八碳三烯酸(哥伦比亚酸)诱导的13-氧代-反-5,顺-9-十八碳二烯酸等。

由本发明的生产方法6所生产的“10-氧代脂肪酸”的实例包括：由顺-9-十六碳烯酸（棕榈油酸）诱导的10-氧代-十六烷酸等。

由本发明的生产方法7所生产的“15-氧代脂肪酸”的实例包括：由顺-11,顺-14-二十碳二烯酸诱导的15-氧代-顺-11-二十碳烯酸、由顺-11,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸诱导的15-氧代-顺-11,顺-17-二十碳二烯酸、由顺-8,顺-11,顺-14-二十碳三烯酸（二高-γ-亚麻酸）诱导的15-氧代-顺-8,顺-11-二十碳二烯酸、由顺-8,顺-11,顺-14,顺-17-二十碳四烯酸诱导的15-氧代-顺-8,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸、由顺-5,顺-8,顺-11,顺-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）诱导的15-氧代-顺-5,顺-8,顺-11-二十碳三烯酸、由顺-5,顺-11,顺-14-二十碳三烯酸（5(Z),11(Z),14(Z)-二十碳三烯酸）诱导的15-氧代-顺-5,顺-11-二十碳二烯酸、由顺-5,顺-11,顺-14,顺-17-二十碳四烯酸（(5Z,11Z,14Z,17Z)-5,11,14,17-二十碳四烯酸）诱导的15-氧代-顺-5,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸等。

由本发明的生产方法8所生产的“12-氧代脂肪酸”的实例包括：由顺-11-十八碳烯酸（11-顺-十八碳烯酸）诱导的12-氧代-十八烷酸、由顺-11,顺-14-二十碳二烯酸诱导的12-氧代-顺-14-二十碳烯酸、由顺-11,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸诱导的12-氧代-顺-14,顺-17-二十碳二烯酸、由顺-8,顺-11,顺-14-二十碳三烯酸（二高-γ-亚麻酸）诱导的12-氧代-顺-8,顺-14-二十碳二烯酸、由顺-5,顺-8,顺-11-二十碳三烯酸（(5Z,8Z,11Z)-二十碳-5,8,11-三烯酸）诱导的12-氧代-顺-5,顺-8-二十碳二烯酸、由顺-8,顺-11,顺-14,顺-17-二十碳四烯酸诱导的12-氧代-顺-8,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸、由顺-5,顺-8,顺-11,顺-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）诱导的12-氧代-顺-5,顺-8,顺-14-二十碳三烯酸等。

本发明的生产方法5-8、生产方法B或生产方法II中所用的脱氢酶不受特别限制，只要其是这样的酶：能够将用作底物的13-羟基脂肪酸、10-羟基脂肪酸、15-羟基脂肪酸、12-羟基脂肪酸、14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸、10-羟基-十四烷酸分别转化成13-氧代脂肪酸、10-氧代脂肪酸、15-氧代脂肪酸、12-氧代脂肪酸、14-氧代-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸、10-氧代-十四烷酸，并且，例如，优选来源于乳杆菌的羟基化脂肪酸–脱氢酶（CLA-DH）。更优选的是来源于植物乳杆菌的CLA-DH，并且特别优选的是来源于植物乳杆菌FERM BP-10549菌株的CLA-DH。CLA-DH可以由JP-A-2007-259712中所述的方法、WO 2013/168310中所述的方法获得。脱氢酶可以是经过纯化或粗纯化的。作为另外一种选择，可以在菌体（如大肠杆菌等）中表达脱氢酶，并且可使用所述菌体自身或可使用其培养基。此外，所述酶可以是游离形式或由各种载体固定化的。

脱氢反应可以在合适的缓冲液（例如，磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液等）中通过以下进行：将作为底物的13-羟基脂肪酸、10-羟基脂肪酸、15-羟基脂肪酸、12-羟基脂肪酸、14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸、10-羟基-十四烷酸与脱氢酶于合适的浓度混合并温育所述混合物。底物浓度为，例如，0.01 - 100 g/L，优选0.05 - 50 g/L，更优选0.1 - 5 g/L。将要加入的脱氢酶的量为，例如，0.001 - 10 mg/mL，优选0.005 - 1 mg/mL，更优选0.05 - 0.2 mg/mL。

“辅因子”可用于脱氢反应并且，例如，可使用NAD⁺、NADP⁺等。其添加的浓度可以是任意的，只要所述水合反应有效地进行。优选0.001>

期望的是，脱氢反应在脱氢酶的优选温度和优选pH范围内进行。例如，反应温度为5 - 50℃，优选20 - 45℃。反应混合物的pH为，例如，pH 4 - 10，优选pH 5 - 9。反应时间不受特别限制，并且其为，例如，10 分钟 - 72 小时，优选30 分钟 - 36 小时。

在本发明的一个实施方案中，使脱氢酶以重组细胞（例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等）的形式经受反应体系，所述重组细胞中引入了含有编码所述脱氢酶的核酸的表达载体。在这种情况下，氧化反应也可以通过如下进行：在适合于所述细胞的培养、并加入了底物以及在必要时辅因子和激活剂的液体培养基中培养所述细胞。

另外，通过用使用铬酸的化学氧化来替代脱氢反应，可以以化学方式获得类似于通过酶反应所得到的氧代脂肪酸。

作为化学氧化，可以提及本身已知的方法，例如，铬酸氧化，优选琼斯氧化（Jonesoxidation）等。作为铬酸，可以使用所述化合物的盐或络合物如无水铬酸 CrO₃、铬酸H₂CrO₄和重铬酸>2Cr₂O₇。

具体来说，将硫酸（2.3 ml）和水（7.7 ml）加入无水铬酸（2.67 g）中，并将丙酮（90ml）加入所述混合物中以得到铬酸溶液。将2 g 羟基化脂肪酸和40 ml 丙酮加入锥形瓶中，并在置于冰上的搅拌器中搅拌下将上述铬酸溶液逐滴滴入。当溶液由蓝色变为茶绿色时，停止逐滴加入所述铬酸溶液，并用异丙醇终止反应。将沉淀的沉积物通过滤纸过滤，置于分液漏斗中，加入二乙醚（150 ml）和Milli-Q水（300 ml），将混合物充分振荡，并用Milli-Q水洗涤二乙醚层几次。向洗涤后的二乙醚层中加入适量的（无水）硫酸钠，搅拌混合物并移除残余水。通过滤纸将所加入的无水硫酸钠滤掉，使用旋转蒸发器浓缩所得的二乙醚层，并提取反应产物（氧代脂肪酸）和未反应的底物。

使通过使用无水铬酸的氧化反应所获得的提取物（含有底物和所得产物（氧代脂肪酸）的混合物）经受中等压力层析，将从柱中流出的溶液回收于级分中。通过LC/MS和气相层析分析所回收的各个级分，收集仅含有氧代脂肪酸的级分并通过旋转蒸发器浓缩。将获得的最终所得产物的一部分甲酯化，通过气相层析评价氧代脂肪酸的纯度，而可以获得具有不低于98%的纯度的氧代脂肪酸。

通过本发明的生产方法1-8和生产方法A、B所获得的下列羟基化脂肪酸和氧代脂肪酸是具有传统上未知的结构的新型脂肪酸。

<羟基化脂肪酸>

13-羟基-顺-9,顺-15-十八碳二烯酸

13-羟基-顺-6,顺-9,顺-15-十八碳三烯酸

13-羟基-顺-5,顺-9-十八碳二烯酸

13-羟基-反-5,顺-9-十八碳二烯酸

12-羟基-顺-14-二十碳烯酸

12-羟基-顺-14,顺-17-二十碳二烯酸

15-羟基-顺-11,顺-17-二十碳二烯酸

15-羟基-顺-8,顺-11-二十碳二烯酸

12-羟基-顺-8,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸

15-羟基-顺-8,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸

15-羟基-顺-5,顺-11-二十碳二烯酸

15-羟基-顺-5,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸

10,13-二羟基-顺-6-十八碳烯酸

10,13-二羟基-顺-15-十八碳烯酸

10,13-二羟基-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸

10-氧代-13-羟基-顺-6-十八碳烯酸

10-氧代-13-羟基-顺-15-十八碳烯酸

10-氧代-13-羟基-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸

14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸。

<氧代脂肪酸>

13-氧代-顺-6,顺-9-十八碳二烯酸

13-氧代-顺-6,顺-9,顺-15-十八碳三烯酸

13-氧代-顺-5,顺-9-十八碳二烯酸

13-氧代-反-5,顺-9-十八碳二烯酸

12-氧代-顺-14-二十碳烯酸

12-氧代-顺-14,顺-17-二十碳二烯酸

15-氧代-顺-11,顺-17-二十碳二烯酸

15-氧代-顺-8,顺-11-二十碳二烯酸

12-氧代-顺-8,顺-14-二十碳二烯酸

12-氧代-顺-5,顺-8-二十碳二烯酸

12-氧代-顺-8,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸

15-氧代-顺-8,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸

15-氧代-顺-5,顺-11-二十碳二烯酸

15-氧代-顺-5,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸

10,13-二氧代-顺-6-十八碳烯酸

10,13-二氧代-顺-15-十八碳烯酸

10,13-二氧代-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸

14-氧代-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸。

因为由本发明所获得的羟基化脂肪酸和氧代脂肪酸具有作为核受体PPARα和PPARγ的激动剂的活性，所以其可以用作代谢改善剂等。因此，新型羟基化脂肪酸和氧代脂肪酸也是可以用作代谢改善剂等的新物质。

本发明中所获得的羟基化脂肪酸和氧代脂肪酸可以基于传统上已知的生理活性，通过与例如药物、食物或化妆品试剂掺合而使用。

含有羟基化脂肪酸、氧代脂肪酸的药物的剂型包括，例如，粉末、颗粒、丸剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、可咀嚼片剂、快速崩解片剂、糖浆、液体、悬浮液、栓剂、软膏、乳膏、凝胶、粘合剂、吸入剂、注射剂等。其制剂是根据常规方法配制的。由于氧代脂肪酸等难溶于水，所以将其溶解于非亲水性有机溶剂（如植物来源的油、动物来源的油等）中或将其与乳化剂、分散剂、表面活性剂等一起通过匀浆器（高压匀浆器）分散或乳化于水溶液中且使用。

可用于配制的添加剂的实例包括：动物和植物油，如大豆油、红花油、橄榄油、胚芽油、葵花油、牛脂肪、沙丁鱼油等；多元醇，如聚乙二醇、丙二醇、甘油、山梨糖醇等；表面活性剂，如脂肪酸的脱水山梨糖醇酯、脂肪酸的蔗糖酯、甘油脂肪酸酯、脂肪酸的聚甘油酯等；赋形剂，如纯净水、乳糖、淀粉、结晶纤维素、D-甘露糖醇、卵磷脂、阿拉伯树胶、山梨糖醇溶液、碳水化合物溶液等；增甜剂、着色剂、pH调节剂、食用香料等。在使用时，可将液体制剂溶解或悬浮于水或其它合适介质中。片剂和颗粒也可通过众所周知的方法包被。

对于以注射剂的形式施用，优选静脉内、腹膜内、肌内、皮下、经皮、关节内、滑膜内、鞘内、骨膜内、舌下、口服等，并且尤其优选静脉内施用或腹膜内施用。静脉内施用可以是滴注施用和快速灌注(bolus)施用中的任一种。

含有由本发明所获得的羟基化脂肪酸、氧代脂肪酸等的“食物”的形式的实例包括：补充剂（粉末、颗粒、软胶囊、硬胶囊、片剂、可咀嚼片剂、快速崩解片剂、糖浆、液体等）；饮料（茶饮料、碳酸饮料、乳酸饮料、运动饮料等）；糖食（橡皮糖、果冻、口香糖、巧克力、饼干、糖果等）；油、脂肪和油脂食物（蛋黄酱、调味品、黄油、乳油、人造奶油等）等。

上述食物在必要时可以含有：各种营养物、各种维生素（维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K等）、各种矿物质（镁、锌、铁、钠、钾、硒等）、膳食纤维、分散剂、稳定剂如乳化剂等、增甜剂、调味组分（柠檬酸、苹果酸等）、食用香料、蜂王胶、蜂胶、蘑菇属(Agaricus)等。

含有由本发明所获得的羟基化脂肪酸、氧代脂肪酸等的“化妆品”的实例包括：乳膏、乳液(skin milk)、化妆水(toner)、微乳精华、浴粉等，且可能添加香料等。

以下参考实施例对本发明进行了更详细的说明。实施例仅仅是本发明的示范而不以任何方式限制本发明的范围。

[实施例 1]

嗜酸乳杆菌的培养方法

将嗜酸乳杆菌从含有2%琼脂并保存于4℃的MRS高层培养基接种到15 ml MRS液体培养基（由Difco生产；pH 6.5）中，并在37℃培养20小时。经过培养后，通过在3,000 rpm、4℃离心10分钟收集细胞以得到嗜酸乳杆菌的菌体。

上述嗜酸乳杆菌于2014年1月17日在NITE专利微生物保藏中心（NPMD）提交保藏，保藏号NITE BP-01788。

[实施例 2]

克隆具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的酶（FA-HY：脂肪酸水合酶）的基因

(1) 获得基因组DNA

将上述嗜酸乳杆菌接种在10 ml MRS液体培养基（由Difco生产）中并在37℃进行静置培养过夜，并通过离心收集细胞。将获得的菌体用1 ml 无菌水洗涤两次并加入0.1 ml 无菌水、0.125 ml 裂解缓冲液（含有80 mM EDTA的200 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0））、0.25ml TE饱和酚，并将所述混合物涡旋1分钟并通过离心回收上清液。向所获得的上清液（0.2ml）中加入0.2 ml PCI溶液（由Nacalai Tesque生产），并用手摇动混合物，并通过在15,000rpm、4℃离心5分钟回收上清液（0.125 ml）。加入0.0125 ml 5 M NaCl、0.31 ml 乙醇，并使所述混合物在室温静置10分钟并在15,000 rpm、4℃离心5分钟。弃去上清液并用0.2 ml70% 乙醇洗涤沉淀。向所述沉淀加入0.1 ml 无菌水并将所述混合物在65℃温育10分钟以得到基因组DNA。

(2) 通过PCR获得FA-HY基因

在已公布的嗜酸乳杆菌菌株的总基因组基因序列中，靶向的是与WO/2013/168310中的CLA-HY的基因序列具有同源性（约32%）的可读框（ORF）。基于ORF的起始密码子的5’侧的序列设计了有义引物（SEQ ID NO: 3），并基于终止密码子的3’侧的序列设计了反义引物（SEQID NO: 4）。使用这些引物，以嗜酸乳杆菌的基因组DNA作为模板，进行了PCR。对经过PCR扩增的约1.8 kbp基因区段的碱基序列进行分析。结果表明，此基因区段含有1,773 bp的一个可读框（ORF）（SEQ ID NO: 1），其始于起始密码子ATG而终于终止密码子TAG，并取此基因作为FA-HY基因。所述FA-HY基因编码由SEQ ID NO: 2所示的590个氨基酸残基组成的蛋白质。

[实施例 3]

在大肠杆菌中表达（FA-HY）

使用了由大肠杆菌表达载体pET21b（Novagen）和Rosetta 2（DE3）菌株组成的宿主载体系统。将使用嗜酸乳杆菌的基因组DNA作为模板通过PCR扩增的FA-HY基因区段插入到pET21b中以构建表达载体（pFA-HY）。用pFA-HY转化Rosetta 2（DE3）菌株以得到转化的Rosetta/pFA-HY菌株。将所获得的Rosetta/pFA-HY菌株在37℃、300 rpm下于含有0.5 mg氨苄青霉素、0.3 mg 氯霉素的10 ml LB培养基（培养基含有1% Bacto Tripton（Difco）、0.5% 酵母提取物、1% 氯化钠（pH 7.0））中需氧培养，当OD600 nm为0.5时，加入1 μl 1 MIPTG，并将所述混合物在16℃进一步培养18小时。经过培养后，将混合物在3,000 rpm离心10分钟以得到湿的Rosetta/pFA-HY菌株的菌体。

[实施例 4]

使用转化的表达脂肪酸水合酶的大肠杆菌从不饱和脂肪酸生产羟基化脂肪酸

使用脂肪酸水合酶诱导性转化的大肠杆菌进行了从各种不饱和脂肪酸生产羟基化脂肪酸的测试。用含有脂肪酸水合酶诱导性转化的大肠杆菌（湿体重0.3 g/ml）、NADH（5 mM）、FAD（0.1 mM）、不饱和脂肪酸（100 mg）、BSA（10 mg）的100 mM 磷酸钾缓冲液（pH 6.5）将反应混合物的总量调整至1 ml。反应在存在氧吸附剂安宁包（Anaeropack）（MitsubishiChemical Corporation）的情况下，于37℃、120 rpm下厌氧摇动进行16至60小时。经过反应后，向反应混合物（1 ml）中加入2 ml 氯仿、2 ml 甲醇和1 ml 0.5% KCl，并搅拌所述混合物并回收氯仿层。通过离心蒸发器将所回收的氯仿层浓缩，并提取反应产物和未反应的底物。将所述提取物的一部分甲酯化并通过气相层析评价所述反应产物。

[实施例 5]

从实施例4中获得的提取物（含有底物和所得产物（羟基化脂肪酸）的混合物）纯化所得产物

使得自实施例4的提取物（含有底物和所得产物（羟基化脂肪酸）的混合物）经受中等压力层析，将从柱中流出的溶液回收于级分中。通过LC/MS和气相层析分析所回收的各个级分，收集仅含有所得产物（羟基化脂肪酸）的级分并通过旋转蒸发器浓缩。将所获得的最终所得产物（羟基化脂肪酸）的一部分甲酯化，并通过气相层析评价所述所得产物的纯度。结果，从各个底物均获得了具有不低于98%的纯度的所得产物。所得产物的化学结构通过NMR、二维NMR、GC-MS分析等确定。结果，可以从顺-9-十六碳烯酸（棕榈油酸）获得具有不低于98%的纯度的10-羟基-十六烷酸。可以从顺-11-十八碳烯酸（11-顺-十八碳烯酸）获得具有不低于98%的纯度的12-羟基-十八烷酸。可以从顺-9,顺-12-十八碳二烯酸（亚油酸）获得具有不低于98%的纯度的13-羟基-顺-9-十八碳烯酸。可以从顺-6,顺-9,顺-12-十八碳三烯酸（γ-亚麻酸）获得具有不低于98%的纯度的13-羟基-顺-6-顺-9-十八碳二烯酸。可以从顺-9,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸（α-亚麻酸）获得具有不低于98%的纯度的13-羟基-顺-9-顺-15-十八碳二烯酸。可以从顺-6,顺-9,顺-12-顺-15-十八碳四烯酸（(6Z,9Z,12Z,15Z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸）获得具有不低于98%的纯度的13-羟基-顺-6-顺-9-顺-15-十八碳三烯酸。可以从顺-11,顺-14-二十碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的12-羟基-顺-14-二十碳烯酸和15-羟基-顺-11-二十碳烯酸。可以从顺-11,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸获得具有不低于98%的纯度的12-羟基-顺-14,顺-17-二十碳二烯酸和15-羟基-顺-11,顺-17-二十碳二烯酸。可以从顺-8,顺-11,顺-14-二十碳三烯酸(二高-γ-亚麻酸)获得具有不低于98%的纯度的15-羟基-顺-8,顺-11-二十碳二烯酸和12-羟基-顺-8,顺-14-二十碳二烯酸。可以从顺-5,顺-8,顺-11-二十碳三烯酸（(5Z,8Z,11Z)-二十碳-5,8,11-三烯酸）获得具有不低于98%的纯度的12-羟基-顺-5,顺-8-二十碳二烯酸。可以从顺-8,顺-11,顺-14,顺-17-二十碳四烯酸获得具有不低于98%的纯度的12-羟基-顺-8,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸和15-羟基-顺-8,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸。可以从顺-5,顺-8,顺-11,顺-14-二十碳四烯酸（花生四烯酸）获得具有不低于98%的纯度的15-羟基-顺-5,顺-8,顺-11-二十碳三烯酸和12-羟基-顺-5,顺-8,顺-14-二十碳三烯酸。可以从10-羟基-顺-12-十八碳烯酸获得具有不低于98%的纯度的10,13-二羟基-十八烷酸。可以从10-羟基-顺-6,顺-12-十八碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的10,13-二羟基-顺-6-十八碳烯酸。可以从10-羟基-顺-12,顺-15-十八碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的10,13-二羟基-顺-15-十八碳烯酸。可以从10-羟基-顺-6,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸获得具有不低于98%的纯度的10,13-二羟基-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸。可以从10-氧代-顺-12-十八碳烯酸获得具有不低于98%的纯度的10-氧代-13-羟基-十八烷酸。可以从10-氧代-顺-6,顺-12-十八碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的10-氧代-13-羟基-顺-6-十八碳烯酸。可以从10-氧代-顺-12,顺-15-十八碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的10-氧代-13-羟基-顺-15-十八碳烯酸。可以从10-氧代-顺-6,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸获得具有不低于98%的纯度的10-氧代-13-羟基-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸。可以从顺-5,顺-9,顺-12-十八碳三烯酸（皮诺敛酸）获得具有不低于98%的纯度的13-羟基-顺-5-顺-9-十八碳二烯酸。可以从反-5,顺-9,顺-12-十八碳三烯酸（哥伦比亚酸）获得具有不低于98%的纯度的13-羟基-反-5-顺-9-十八碳二烯酸。可以从顺-5,顺-11,顺-14-二十碳三烯酸（5(Z),11(Z),14(Z)-二十碳三烯酸）获得具有不低于98%的纯度的15-羟基-顺-5,顺-11-二十碳二烯酸。可以从顺-5,顺-11,顺-14-顺-17-二十碳四烯酸（(5Z,11Z,14Z,17Z)-5,11,14,17-二十碳四烯酸）获得具有不低于98%的纯度的15-羟基-顺-5-顺-11-顺-17-二十碳三烯酸。可以从顺-4,顺-7,顺-10,顺-13,顺-16,顺-19-二十二碳六烯酸（DHA）获得具有不低于98%的纯度的14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸。可以从顺-9-十四碳烯酸（肉豆蔻脑酸）获得具有不低于98%的纯度的10-羟基-十四烷酸。

[实施例 6]

通过使用在大肠杆菌中表达的脱氢酶（CLA-DH）从羟基化脂肪酸生产氧代脂肪酸

使用纯化的来源于植物乳杆菌FERM BP-10549菌株的脱氢酶（CLA-DH）（由JP-A-2007-259712中所述的方法或WO/2013/168310中所述的方法获得）进行了从羟基化脂肪酸生产氧代脂肪酸的测试。用含有纯化的脱氢酶（酶量83 μg）、0.5 mM NAD⁺、0.5>

使用类似方法，通过使用各种羟基化脂肪酸作为底物可以获得所得产物氧代脂肪酸。

[实施例 7]

通过使用无水铬酸（CrO₃）从羟基化脂肪酸生产氧代脂肪酸

向无水铬酸（2.67 g）中加入硫酸（2.3 ml）和水（7.7 ml），并向其中加入丙酮（90 ml）以得到铬酸溶液。将2 g 羟基化脂肪酸和40 ml 丙酮加入锥形瓶中，并在用搅拌器搅拌混合物的同时在冰上将上述铬酸溶液逐滴滴入。当溶液由蓝色变为粉末状绿茶的颜色时，停止逐滴加入所述铬酸溶液，并用异丙醇猝灭反应。将沉淀的沉积物用滤纸过滤并置于分液漏斗中。另外加入二乙醚（150 ml）和Milli Q水（300 ml）并将混合物充分振荡。用Milli Q水洗涤二乙醚层几次。向经过洗涤的二乙醚层中加入适量的（无水）硫酸钠，搅拌混合物并移除残余水。用滤纸将所加入的无水硫酸钠滤掉，使用旋转蒸发器浓缩所得二乙醚层，并提取反应产物（氧代脂肪酸）和未反应的底物。

[实施例 8]

从实施例6、7中获得的提取物（含有底物和所得产物（氧代脂肪酸）的混合物）纯化所得产物

使在实施例6、7中获得的提取物（含有底物和所得产物（氧代脂肪酸）的混合物）经受中等压力层析，将从柱中流出的溶液回收于级分中。通过LC/MS和气相层析分析所回收的各个级分，收集仅含有氧代脂肪酸的级分并通过旋转蒸发器浓缩。将所获得的最终所得产物的一部分甲酯化，并通过气相层析评价氧代脂肪酸的纯度。结果，从各个底物均获得了具有不低于98%的纯度的氧代脂肪酸。所得产物的化学结构通过NMR、二维NMR、GC-MS分析等确定。结果，可以从13-羟基-顺-9-十八碳烯酸获得具有不低于98%的纯度的13-氧代-顺-9-十八碳烯酸。可以从13-羟基-顺-6,顺-9-十八碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的13-氧代-顺-6,顺-9-十八碳二烯酸。可以从13-羟基-顺-9,顺-15-十八碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的13-氧代-顺-9,顺-15-十八碳二烯酸。

使用类似方法，可以从10-羟基-十六烷酸获得具有不低于98%的纯度的10-氧代-十六烷酸。可以从12-羟基-十八烷酸获得具有不低于98%的纯度的12-氧代-十八烷酸。可以从13-羟基-顺-6,顺-9,顺-15-十八碳三烯酸获得具有不低于98%的纯度的13-氧代-顺-6,顺-9,顺-15-十八碳三烯酸。可以从15-羟基-顺-11-二十碳烯酸获得具有不低于98%的纯度的15-氧代-顺-11-二十碳烯酸。可以从12-羟基-顺-14-二十碳烯酸获得具有不低于98%的纯度的12-氧代-顺-14-二十碳烯酸。可以从12-羟基-顺-14,顺-17-二十碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的12-氧代-顺-14,顺-17-二十碳二烯酸。可以从15-羟基-顺-11,顺-17-二十碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的15-氧代-顺-11,顺-17-二十碳二烯酸。可以从15-羟基-顺-8,顺-11-二十碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的15-氧代-顺-8,顺-11-二十碳二烯酸。可以从12-羟基-顺-8,顺-14-二十碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的12-氧代-顺-8,顺-14-二十碳二烯酸。可以从12-羟基-顺-5,顺-8-二十碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的12-氧代-顺-5,顺-8-二十碳二烯酸。可以从12-羟基-顺-8,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸获得具有不低于98%的纯度的12-氧代-顺-8,顺-14,顺-17-二十碳三烯酸。可以从15-羟基-顺-8,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸获得具有不低于98%的纯度的15-氧代-顺-8,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸。可以从15-羟基-顺-5,顺-8,顺-11-二十碳三烯酸获得具有不低于98%的纯度的15-氧代-顺-5,顺-8,顺-11-二十碳三烯酸。可以从12-羟基-顺-5,顺-8,顺-14-二十碳三烯酸获得具有不低于98%的纯度的12-氧代-顺-5,顺-8,顺-14-二十碳三烯酸。可以从10,13-二羟基-十八烷酸或10-氧代-13-羟基-十八烷酸获得具有不低于98%的纯度的10,13-二氧代-十八烷酸。可以从10,13-二羟基-顺-6-十八碳烯酸或10-氧代-13-羟基-顺-6-十八碳烯酸获得具有不低于98%的纯度的10,13-二氧代-顺-6-十八碳烯酸。可以从10,13-二羟基-顺-15-十八碳烯酸或10-氧代-13-羟基-顺-15-十八碳烯酸获得具有不低于98%的纯度的10,13-二氧代-顺-15-十八碳烯酸。可以从10,13-二羟基-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸或10-氧代-13-羟基-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的10,13-二氧代-顺-6,顺-15-十八碳二烯酸。可以从13-羟基-顺-5,顺-9-十八碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的13-氧代-顺-5,顺-9-十八碳二烯酸。可以从13-羟基-反-5,顺-9-十八碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的13-氧代-反-5,顺-9-十八碳二烯酸。可以从15-羟基-顺-5,顺-11-二十碳二烯酸获得具有不低于98%的纯度的15-氧代-顺-5,顺-11-二十碳二烯酸。可以从15-羟基-顺-5,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸获得具有不低于98%的纯度的15-氧代-顺-5,顺-11,顺-17-二十碳三烯酸。可以从14-羟基-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸获得具有不低于98%的纯度的14-氧代-顺-4,顺-7,顺-10,顺-16,顺-19-二十二碳五烯酸。可以从10-羟基-十四烷酸获得具有不低于98%的纯度的10-氧代-十四烷酸。

[实施例 9]

测量作为核受体PPARα和PPARγ的激动剂的活性

参考Nobuyuki Takahashi 等人, FEBS Letters 514 (2002) 第315-322页, “Dualaction of isoprenols from herbal medicines on both PPARgamma and PPARalpha in3T3-L1 adipocytes and HepG2 hepatocytes.”, 材料与方法部分“Reporter plasmidsand luciferase assays”测量了本发明的PPAR配体的PPARα、γ活化能力。具体地讲，PPARα、γ配体活性是通过基于萤光素酶的表达，评价对PPAR配体结合区与GAL4 DNA结合区的融合蛋白的结合以及靶基因活化的报道分子测定来测量的。具体地，将包含编码PPARα、γ配体结合区与GAL4 DNA结合区的融合蛋白的DNA的质粒和其中萤光素酶连接至结合了GAL4的DNA序列的报道分子质粒引入CV-1细胞中，将下述配体加入所述细胞中，温育细胞并检测萤光素酶活性。

用乙醇调整样品的浓度。将乙醇用作阴性对照，而将PPARα、γ配体GW7647（10 nM）和曲格列酮（5 μM）用作阳性对照。

如下有代表性的羟基化脂肪酸、氧代脂肪酸的PPARα、γ配体活性数据示于图1和图2中：(1) 13-羟基-顺-9-十八碳烯酸（表示为“13-OH LA”）；(2) 13-氧代-顺-9-十八碳烯酸（表示为“13-OXO LA”）；(3) 10,13-二羟基-十八烷酸（表示为“10,13-OH LA”）；(4) 13-羟基-顺-9,顺-15-十八碳二烯酸（表示为“13-OH ALA”）；(5) 13-氧代-顺-9,顺-15-十八碳二烯酸（表示为“13-OXO ALA”）；(6) 10,13-二羟基-顺-15-十八碳烯酸（表示为“10,13-OHALA”）；(7) 13-羟基-顺-6,顺-9-十八碳二烯酸（表示为“13-OH GLA”）；(8) 13-氧代-顺-6,顺-9-十八碳二烯酸（表示为“13-OXO GLA”）；(9) 10,13-二羟基-顺-6-十八碳烯酸（表示为“10,13-OH GLA”）；(10) 15-羟基-顺-5,顺-8,顺-11-二十碳三烯酸（表示为“15-OH AA”）。在这之中，(4)、(6)、(8)和(9)的稀有脂肪酸是新型脂肪酸。

虽然已经着重从优选的实施方案描述了本发明，但对于本领域技术人员显而易见的是，所述优选的实施方案是可以修改的。

本文所引用的任何出版物（包括专利和专利申请）中所公开的内容，均在此整体引入作为参考，其程度如同其已在本文中公开。

[工业适用性]

根据本发明的方法，可以生产各种羟基化脂肪酸和氧代脂肪酸，并且因此，所述羟基化脂肪酸和氧代脂肪酸可应用于药物、食物等各个领域。另外，根据本发明的方法，可以生产极为有用的新型稀有脂肪酸。

本申请基于在日本提交的专利申请号2014-011855（申请日：2014年1月24日），其内容全文并入本文。

序列表

<110>Kyoto University

NITTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD.

<120>使用新型酶生产稀有脂肪酸的方法以及新型稀有脂肪酸

<130>092262

<150>JP 2014-011855

<151>2014-01-24

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1773

<212>DNA

<213>嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1773)

<400>1

atg cat tat agt agt ggt aat tat gaa gct ttt gta aac gca agt aaa48

Met His Tyr Ser Ser Gly Asn Tyr Glu Ala Phe Val Asn Ala Ser Lys

1 5 1015

cct aag gat gtc gat cag aag tcc gca tat ctt gtt ggt tca ggt ttg96

Pro Lys Asp Val Asp Gln Lys Ser Ala Tyr Leu Val Gly Ser Gly Leu

202530

gca tcg ctt gct agt gct gta ttt tta att cgt gat ggt cac atg aag144

Ala Ser Leu Ala Ser Ala Val Phe Leu Ile Arg Asp Gly His Met Lys

354045

ggt gat aga att cat atc ctt gaa gaa ttg agc ctt cca ggt ggt tca192

Gly Asp Arg Ile His Ile Leu Glu Glu Leu Ser Leu Pro Gly Gly Ser

505560

atg gat ggg atc tat aat aag caa aaa gaa agc tac atc att cgt ggt240

Met Asp Gly Ile Tyr Asn Lys Gln Lys Glu Ser Tyr Ile Ile Arg Gly

65707580

ggt cgt gaa atg gaa gcc cat ttt gaa tgc ttg tgg gac ttg ttt aga288

Gly Arg Glu Met Glu Ala His Phe Glu Cys Leu Trp Asp Leu Phe Arg

859095

tcg att cca tca gct gaa aat aaa gat gaa tcg gtc ctg gat gaa ttt336

Ser Ile Pro Ser Ala Glu Asn Lys Asp Glu Ser Val Leu Asp Glu Phe

100 105 110

tac cgt tta aat aga aaa gat cca agt ttc gca aag act cgt gtc att384

Tyr Arg Leu Asn Arg Lys Asp Pro Ser Phe Ala Lys Thr Arg Val Ile

115 120 125

gtt aac cgc gga cat gaa ctt cca act gac ggt caa tta ctt ctt act432

Val Asn Arg Gly His Glu Leu Pro Thr Asp Gly Gln Leu Leu Leu Thr

130 135 140

ccc aag gct gtt aaa gaa att att gat ctt tgc tta act cct gaa aaa480

Pro Lys Ala Val Lys Glu Ile Ile Asp Leu Cys Leu Thr Pro Glu Lys

145 150 155 160

gat tta caa aat aaa aaa att aat gaa gtc ttt agt aaa gaa ttt ttt528

Asp Leu Gln Asn Lys Lys Ile Asn Glu Val Phe Ser Lys Glu Phe Phe

165 170 175

gaa tca aac ttc tgg ctt tac tgg tca acg atg ttt gcc ttt gag cca576

Glu Ser Asn Phe Trp Leu Tyr Trp Ser Thr Met Phe Ala Phe Glu Pro

180 185 190

tgg gca agt gcg atg gaa atg cgt cgt tac tta atg cgt ttt gtt caa624

Trp Ala Ser Ala Met Glu Met Arg Arg Tyr Leu Met Arg Phe Val Gln

195 200 205

cac gtt tct aca ctt aag aat tta tca tca cta cgc ttt act aag tat672

His Val Ser Thr Leu Lys Asn Leu Ser Ser Leu Arg Phe Thr Lys Tyr

210 215 220

aac caa tat gaa tca tta att tta cca atg gtt aaa tac ttg aaa gat720

Asn Gln Tyr Glu Ser Leu Ile Leu Pro Met Val Lys Tyr Leu Lys Asp

225 230 235 240

cgc ggc gtg caa ttc cat tac aac acc gtt gtt gat aat atc ttt gtt768

Arg Gly Val Gln Phe His Tyr Asn Thr Val Val Asp Asn Ile Phe Val

245 250 255

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Asn Arg Ser Asn Gly Glu Lys Ile Ala Lys Gln Ile Leu Leu Thr Glu

260 265 270

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Asn Gly Glu Lys Lys Ser Ile Asp Leu Thr Glu Asn Asp Leu Val Phe

275 280 285

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Val Thr Asn Gly Ser Ile Thr Glu Ser Thr Thr Tyr Gly Asp Asn Leu

290 295 300

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His Pro Ala Ser Glu Glu His Lys Leu Gly Ala Thr Trp Lys Leu Trp

305 310 315 320

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Gln Asn Leu Ala Ala Gln Asp Asp Asp Phe Gly His Pro Asp Val Phe

325 330 335

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Cys Lys Asp Ile Pro Lys Ala Asn Trp Val Met Ser Ala Thr Ile Thr

340 345 350

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Phe Lys Asn Asn Asp Ile Val Pro Phe Ile Glu Ala Val Asn Lys Lys

355 360 365

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Asp Pro His Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Gly Pro Thr Thr Ile Lys

370 375 380

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385 390 395 400

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Glu Ala Gln Lys Pro Asn Glu Leu Ile Val Trp Leu Tyr Gly Leu Phe

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420 425 430

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Gly Ile Glu Leu Cys Glu Glu Trp Leu Tyr His Met Gly Val Pro Glu

435 440 445

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Glu Arg Ile Pro Glu Met Ala Ser Ala Ala Thr Thr Ile Pro Ala His

450 455 460

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Met Pro Tyr Ile Thr Ser Tyr Phe Met Pro Arg Ala Leu Gly Asp Arg

465 470 475 480

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Pro Lys Val Val Pro Asp His Ser Lys Asn Leu Ala Phe Ile Gly Asn

485 490 495

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Phe Ala Glu Thr Pro Arg Asp Thr Val Phe Thr Thr Glu Tyr Ser Val

500 505 510

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Arg Thr Ala Met Glu Ala Val Tyr Thr Leu Leu Asn Ile Asp Arg Gly

515 520 525

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530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

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Gly Thr Tyr Ile Glu Glu Leu Leu Lys Lys Tyr Lys Leu Val

580 585 590

<210>2

<211>590

<212>PRT

<213>嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）

<400>2

Met His Tyr Ser Ser Gly Asn Tyr Glu Ala Phe Val Asn Ala Ser Lys

1 5 1015

Pro Lys Asp Val Asp Gln Lys Ser Ala Tyr Leu Val Gly Ser Gly Leu

202530

Ala Ser Leu Ala Ser Ala Val Phe Leu Ile Arg Asp Gly His Met Lys

354045

Gly Asp Arg Ile His Ile Leu Glu Glu Leu Ser Leu Pro Gly Gly Ser

505560

Met Asp Gly Ile Tyr Asn Lys Gln Lys Glu Ser Tyr Ile Ile Arg Gly

65707580

Gly Arg Glu Met Glu Ala His Phe Glu Cys Leu Trp Asp Leu Phe Arg

859095

Ser Ile Pro Ser Ala Glu Asn Lys Asp Glu Ser Val Leu Asp Glu Phe

100 105 110

Tyr Arg Leu Asn Arg Lys Asp Pro Ser Phe Ala Lys Thr Arg Val Ile

115 120 125

Val Asn Arg Gly His Glu Leu Pro Thr Asp Gly Gln Leu Leu Leu Thr

130 135 140

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145 150 155 160

Asp Leu Gln Asn Lys Lys Ile Asn Glu Val Phe Ser Lys Glu Phe Phe

165 170 175

Glu Ser Asn Phe Trp Leu Tyr Trp Ser Thr Met Phe Ala Phe Glu Pro

180 185 190

Trp Ala Ser Ala Met Glu Met Arg Arg Tyr Leu Met Arg Phe Val Gln

195 200 205

His Val Ser Thr Leu Lys Asn Leu Ser Ser Leu Arg Phe Thr Lys Tyr

210 215 220

Asn Gln Tyr Glu Ser Leu Ile Leu Pro Met Val Lys Tyr Leu Lys Asp

225 230 235 240

Arg Gly Val Gln Phe His Tyr Asn Thr Val Val Asp Asn Ile Phe Val

245 250 255

Asn Arg Ser Asn Gly Glu Lys Ile Ala Lys Gln Ile Leu Leu Thr Glu

260 265 270

Asn Gly Glu Lys Lys Ser Ile Asp Leu Thr Glu Asn Asp Leu Val Phe

275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Gln Asn Leu Ala Ala Gln Asp Asp Asp Phe Gly His Pro Asp Val Phe

325 330 335

Cys Lys Asp Ile Pro Lys Ala Asn Trp Val Met Ser Ala Thr Ile Thr

340 345 350

Phe Lys Asn Asn Asp Ile Val Pro Phe Ile Glu Ala Val Asn Lys Lys

355 360 365

Asp Pro His Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Gly Pro Thr Thr Ile Lys

370 375 380

Asp Ser Asn Trp Leu Leu Gly Tyr Ser Ile Ser Arg Gln Pro His Phe

385 390 395 400

Glu Ala Gln Lys Pro Asn Glu Leu Ile Val Trp Leu Tyr Gly Leu Phe

405 410 415

Ser Asp Thr Lys Gly Asn Tyr Val Glu Lys Thr Met Pro Asp Cys Asn

420 425 430

Gly Ile Glu Leu Cys Glu Glu Trp Leu Tyr His Met Gly Val Pro Glu

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450 455 460

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Pro Lys Val Val Pro Asp His Ser Lys Asn Leu Ala Phe Ile Gly Asn

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580 585 590

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

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<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

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