一种油菜组织特异性启动子在调控目的基因在植物花药中特异表达的应用

摘要

本发明属于植物生物技术领域，与植物组织特异启动子的分离和应用有关，具体涉及一种油菜组织特异性启动子在调控目的基因在植物花药中表达的应用。发明人将该启动子及其截短的片段融合报告基因并转化拟南芥，GUS染色发现它们能驱动报告基因在花药中特异表达，它们的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；进一步截短后获得具有花粉特异表达的SEQ ID NO.5所示的启动子片段。本发明进一步公开了所述组织特异启动子或截短后的启动子片段为控制植物育性提供了新的有效调控元件，对基因工程育种具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种油菜组织特异性启动子在调控目的基因在植物花药中特异表达的应用，本发明提供的油菜组织特异性启动子能够调控目的基因在植物花药或花粉中特异转录或表达。

背景技术

高等植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调控制。外源DNA序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，因此启动子类型的选择决定了基因的表达时间和部位。近些年比较热门的研究对象是组织特异启动子，这些组织特异启动子主要包括叶片、韧皮部、维管束和根等器官特异表达启动子以及花粉、花器官、果实、种子等生殖器官特异表达启动子(宋扬等，植物组织特异性启动子研究。生物技术通报，2007，(4)：21-24)。耿安奇等从白菜型油菜、甘蓝型油菜、菜苔、甘蓝中分离了4个启动子并转化烟草，GUS染色分析其为花器官特异表达的启动子(Geng AQ,Zhao Z J,Nie X L,et al.Expression analysis of four flower-specificpromoters of Brassica spp.in the heterogeneous host tobacco[J].AfricanJournal of Biotechnology,2009,8(20).)。Ariizumi等分离了LTP12,XTH3和PGA4的启动子并转化拟南芥，GUS染色表明这3个启动子为花药特异表达启动子，且在表达时期上存在差异(Ariizumi T,Amagai M,Shibata D,et al.Comparative study of promoteractivity of three anther-specific genes enc oding lipid transfer protein,xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase and polygalacturonas e intransgenic Arabidopsis thaliana[J].Plant Cell Reports,2002,21(1):90-96.)。从玉米中克隆的ZmGLU1基因启动子,连接GUS报告基因后转化至烟草中，检测分析结果玉米的ZmGLU1启动子驱动了GUS基因在烟草根部高效表达(Gu R,Zhao L,Zhang Y,et al.Isolation of a maize beta-glucosidase gene promoter and characterization of itsactivity in transg enic tobacco[J].Plant cell reports,2006,25(11):1157-1165.)。

以上这些报道都是利用转基因技术在不同的植物间进行启动子功能分析的例子，这些实例表明利用模式植物拟南芥、烟草等作为受体，通过转基因植株的报告基因分析证实来自于其他植物的启动子的功能是被广泛认可和接受的。本发明从油菜中分离的一种组织特异启动子的功能鉴定就是通过模式植物拟南芥完成的，最终在油菜中验证。正是基于这个方法的成功应用，可以对组织特异启动子的功能进行快速的体内验证，越来越多的组织特异启动子被报道，这些都可能成为植物基因工程领域有实用价值的组织特异启动子。组织特异启动子成功应用的例子之一是通过基因工程调控植物花粉育性、创造植物雄性不育系、恢复系和保持系，已在一些作物上获得成功。

目前利用基因工程创造雄性不育的策略主要是利用花粉或花药特异启动子与外源基因融合，构建表达载体，转化植物，适时地阻断花粉发育的过程从而达到雄性不育的目的。Mar iani C等利用烟草花药绒毡层特异启动子TA29与RNaseT1或Barnase融合在一起，通过农杆菌介导转入烟草和油菜，获得了稳定的雄性不育的转化株(Marian C,DeBeuckeleer M,Truettner J,et al.Induction of male sterility in plants by achimaeric ribonuclease gene[J].Nature,1990,347:737-741.)。两年后，Mariani C等又用TA29驱动Barstar基因，创建了上述雄性不育系的恢复(Mariani C,Gossele V,DeBeuckeleer M,et al.A chimaeric ribo nuclease-inhibitor gene restoresfertility to male sterile plants[J].Nature,1992,357(6377):384-387.)。由此可见，即使不同的植物之间的体内环境不同以及基因间存在互作差异，即使是与烟草性质差异较大的植物，只要具有保守的核心启动区域和相应保守的调控元件，就可以在其他不同植物中发挥启动下游基因稳定持续表达的生物学功能。

通过基因工程手段调控花粉育性、创造植物不育系、保持系及恢复系的关键之一是植物花粉或花药启动子的驱动活性和特异性。目前已知的驱动活性高且特异性良好的油菜花药或花粉特异启动子还相对较少，而油菜因其基因组较大且结构复杂等原因，在花药发育分子机制方面的研究不多，更多的是参考模式植物拟南芥中的相关研究。因此油菜花药和花粉特异表达启动子的克隆和鉴定，为油菜中利用基因工程调控花粉育性和创造植物雄性不育系提供新的调控元件，从而为油菜杂种优势资源在油菜育种中的充分利用打下基础。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种油菜组织特异性启动子在调控目的基因在植物花药中特异表达的应用，所述的油菜组织特异性启动子序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

为实现上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种油菜组织特异性启动子在调控目的基因在植物花药中特异表达的应用，包括利用本领域成常规手段，将包含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示启动子驱动目的基因的表达载体转入植物中，即可达到调控目的基因在植物花药中特异表达；SEQ ID NO.5所示的启动子序列可调控目的基因在植物花粉中特异表达，利用上述方法看创建基因工程不育系、保持系或恢复系。以上所述方案中，所述的植物为芸薹属植物，优选的为油菜或拟南芥。

所述目的基因可以是促使碳水化合物降解的酶或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，或者是引起PCD过程的关键基因，更具体的如油菜的半胱氨酸蛋白酶基因、β-1、3-葡聚糖酶基因，哺乳动物的细胞毒素基因、细胞凋亡基因或者可选自原核调控系统，还可以是显性的雄性不育基因。

所述的重组植物表达载体中还可含有选择标记基因。所述的标记基因通常包括提供抗生素抗性或除草剂抗性的基因，诸如：潮霉素抗性基因、草苷膦或草丁膦抗性基因等。

可以采用任何一种的植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体转化到受体植物的细胞、组织中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的植株及其无性系或其后代；所述的转化方法包括：农杆菌介导的转化、原生质体转化、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等；所述的受体植物包括芸薹属植物；优选的，所述的受体植物为油菜。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的序列分别与报告基因可操作的连接，构建得到重组植物表达载体；以拟南芥和油菜为受体材料，利用农杆菌GV3101介导，将重组植物表达载体转化到拟南芥和油菜中，不同转化子的GUS染色表明，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示所示的启动子能够驱动报告基因在花药中特异表达，而在角果、根、茎、叶等其它组织部位里没有表达活性；SEQ ID NO.5所示的序列能够驱动报告基因在花粉中特异表达，其它组织部位不表达。说明SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的启动子片段都具有组织特异性启动子的功能。本发明对油菜花药和花粉特异表达启动子的克隆和鉴定，为油菜中利用基因工程调控花粉育性和创造植物雄性不育系提供新的调控元件，从而为油菜杂种优势资源在油菜育种中的充分利用打下基础。

附图说明

图1是启动子片段SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5检测电泳图；

其中泳道M：DNA marker；泳道1：SEQ ID NO.1所示的启动子；泳道2：SEQ ID NO.5所示的启动子。

图2为表达载体pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost的示意图。

图3为启动子SEQ ID NO.1启动子元件示意图。

图4为启动子SEQ ID NO.1转基因拟南芥的不同组织器官的GUS染色。

其中，A为14d整株苗；B为茎生叶；C为花序；D为花蕾；E为5mm长角果；F为10mm长角果。

图5为启动子SEQ ID NO.5转基因拟南芥的不同组织器官的GUS染色示意图；

其中，a为14d整株苗；b为茎生叶；c为花序；d为花蕾；e为5mm长角果；f为10mm长角果。

图6为启动子SEQ ID NO.5转基因拟南芥GUS染色花药的半薄切片。

其中，S11为花药发育第11期；S12为花药发育第12期；S13为花药发育第13期；S14为花药发育第14期，bar＝20μm。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

油菜组织特异启动子SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5的克隆及其植物表达载体构建

利用CTAB法提取油菜中双11叶片基因组DNA，以此DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μl。

扩增启动子SEQ ID NO.1的引物为：

1-F：5′-(Sal I)CGCgtcgacCCATCTTACTCCAATAGTATTTTGG-3'、1-R：5′-(SmaI)CcccgggCCGTTCTTCTTTTCAATATTTAAAA-3；

扩增启动子SEQ ID NO.2的引物为：

2-F：5′-(Sal I)CGCgtcgacATGGAGAACTTAAATAGACAAATAC-3'、2-R：5′-(SmaI)Ccccg ggCCGTTCTTCTTTTCAATATTTAAAA-3；

扩增启动子SEQ ID NO.3的引物为：

3-F:5′-(Sal I)CGCgtcgacATGGAGAACTTAAATAGACAAATAC-3'、3-R：5′-(SmaI)Ccccggg AATCAGATTATTTAAGCTGTCTAAA-3；

扩增启动子SEQ ID NO.4的引物为：

4-F：5′-(Sal I)CGCgtcgacATGAAACGAAAGCCACCTC-3'、4-R：5′-(SmaI)CcccgggCCGTTCTTCTTTTCAATATTTAAAA-3；

扩增启动子SEQ ID NO.5的引物为：

5-F：5′-(SalI)CGCgtcgacATGAAACGAAAGCCACCTC-3'和5-R：5′-(SmaI)CcccgggAATCAGATTATTTAAGCTGTCTAAA-3。

50μl体系如下：

PCR反应程序为：98℃预变性2min，然后以98℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s,进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1.0％质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，PCR产物回收试剂盒纯化回收后，37℃酶切(Sal I和SmaI)2h，再次回收，分别与植物表达载体pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost在4℃过夜连接，热激法转化并挑取单克隆，PCR检测阳性后送武汉擎科创新生物科技有限公司测序，测序结果与参考基因组序列SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5完全一致，即获得了含有目的启动子的植物表达载体，分别命名为pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost-1，pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost-2，pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost-3，pG2NHL-H2BYF P-gusplus-Nost-4和pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost-5。

实施例2：

启动子SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5调控目的基因在植物花药中特异表达的应用：

1)启动子融合报告基因的表达载体转化拟南芥

实施例1构建成功的含有启动子植物表达载体的单克隆大肠杆菌菌液37℃活化并提取质粒，采用电转法将pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost-1，pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost-2，pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost-3，pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost-4和pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost-5分别转化农杆菌GV3101感受态细胞，在含有卡那霉素(50μg/mL)和利福平(50μg/mL)的平板上培养后挑取单克隆，用启动子的克隆引物检测，确定阳性克隆。28℃活化阳性农杆菌菌液，采用花序浸染法(Zhang X,Henriques R,Lin S S,et al.Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floraldip method[J].Nature protocols,2006,1(2):641-646.)转化野生型拟南芥，浸染2次后收获的种子，经消毒后均匀地铺在含有浓度为50μg/mL卡那霉素的1/2MS培养基上生长，获得的存活绿苗初步认定为阳性植株。将它们移栽到蛭石中，待植株长至5-7片真叶时取一个叶片，CTAB法提取叶片基因组DNA，对其进行PCR鉴定，引物为启动子特异扩增引物，反应体系和程序如实施例1所述。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，大小与目的启动子SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的大小一致。结果表明5个启动子的植物表达载体已经成功转入拟南芥，收获各阳性单株的T1代种子。

2)转基因拟南芥不同组织器官的GUS染色

在含有浓度为50μg/ml卡那霉素的1/2MS培养基上筛选各阳性单株的T1代种子，每个启动子表达载体确定符合孟德尔遗传定律3:1分离的单拷贝的株系3-5个，在T3代进行不同组织(14d整株苗，开花后的茎、叶片、花序、5mm长角果、10mm长角果)进行GUS染色，步骤如下：

(1)收集拟南芥材料到小离心管中或小玻璃瓶中(事先加入预冷的90％丙酮)，冰上放置，直到收集完所有样品。

(2)材料收集完后在冰上放置20min。

(3)丙酮处理完，用预冷的GUS染色缓冲液漂洗组织约10min。GUS染色缓冲液的成分见下表。

GUS染色缓冲液的成分

(4)换掉染色缓冲液，加入含有X-gluc的GUS染液，抽真空15-30min。GUS染液成分见下表。

GUS染液的成分

(5)37℃染色过夜。

(6)去掉染液。在室温下将染色样品依次置于20％、35％、50％、70％乙醇溶液中，每个处理30min，其中在70％乙醇中，染色组织可以长期保存或观察。

用OLYMPUS DP72数码成像系统对染色结果照相并保存图片。各株系的GUS染色结果均表明：启动子SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4可以驱动GUS基因在拟南芥的花药中特异表达，其它组织和器官中均不表达(图4)；启动子SEQ ID NO.5驱动GUS基因在拟南芥花粉中特异表达(图5)。

3)启动子SEQ ID NO.5转基因拟南芥GUS染色花药的半薄切片

为了确定启动子SEQ ID NO.5驱动GUS基因表达的具体时期，我们对启动子SEQ IDNO.5的GUS染色的花药进行半薄切片。步骤如下：

l)脱水：保存在70％乙醇中的被GUS染色的花序，分别在80％、95％和100％乙醇中逐级脱水，每级脱水2h。

2)脱水完成后，轻轻的将花序切开，分成单个的小花蕾，再进行如下操作：

A，预渗透：将小花蕾置于预渗透液(95％乙醇：base liquid Technovit 7100＝1：1混合)中预渗透3h。

B，渗透：小花蕾转入适量的渗透液(1g硬化剂I溶于100ml base liquidTeclmovit 7100)中渗透8-12h。

C，包埋：每个200μL小离心管内加入100μL的包埋剂(硬化剂Ⅱ：渗透液＝1：15混合)，将单个的小花蕾用尖头镊子轻轻地塞入离心管内，尽量保持小花蕾垂直向下，然后将离心管垂直放置在PCR板上。室温下几分钟后即开始凝固聚合，2h后将包埋好的样品置于37度恒温箱内继续聚合，1周后即可进行切片。

D，切片：用Leica Ultracut R型超薄切片机进行切片,切片厚度为8μm，边切片边镜检(Nikon eclipse 80i显微镜)，保证切片的完整性。

E，粘片：切好的片子用细铜丝绕制的小铜网捞片，直接转到滴有水的干净载玻片上，电热台上展片、烘干。

F，封片：加拿大树脂封片，永久保存。

H，观察照相：Nikon eclipse 80i显微镜下观察，并用Ds-Ril数码照相。

GUS染色花药的半薄切片表明启动子SEQ ID NO.5的GUS信号特异在花粉的双核初期出现，持续至花粉粒成熟(图6)。

综合这些结果说明：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列是花药特异启动子，SEQ ID NO.5是一个花粉特异启动子。这些特异启动子片段为控制植物育性提供了新的有效调控元件，对基因工程育种具有很好的应用前景。

4)SEQ ID NO.5转基因油菜花药的GUS染色

将pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost-5转入甘蓝型油菜中，对阳性单株进行GUS染色，发现GUS基因只在花粉中表达，和拟南芥中结果一致。

实施例3：

启动子SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5序列在芸薹属植物白菜、甘蓝和油菜中的保守性

基于PCR反应，使用实施案例1中的引物分别克隆了启动子SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5在白菜、甘蓝和油菜中的同源片段并测序，通过序列比对发现它们的序列同源性高达100％，最低的为99.78％，仅1bp差异，而且该差异不在核心启动子区域。这说明启动子SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5序列在芸薹属植物白菜、甘蓝和油菜中是高度保守。预示着启动子SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的功能也是保守的。正如实施案例2中的SEQ ID NO.5启动子在拟南芥和油菜中驱动GUS基因表达的模式相同。也就是说将启动子SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的植物表达载体分别转入到白菜、甘蓝和油菜中，它们驱动目的基因表达的模式是相同的，均是花药或花粉特异表达。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种油菜组织特异性启动子在调控目的基因在植物花药中特异表达的应用

<130> 一种油菜组织特异性启动子在调控目的基因在植物花药中特异表达的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccatcttact ccaatagtat tttggatctt actcattttc tgtcttttga aaacatctaa 60

aacttgatta tggagaactt aaatagacaa atacatttat aagccgaaaa ctatgtcact 120

acgctttgct gcttttggca tatacatgtt gtttaattta ctcgcatgaa acgaaagcca 180

cctcacgtcg tgctattttc ggtgtaacct taacggtgga tctttaaata aaaccaaact 240

atttaaattt agggcacaat ccaacaaaag tagtacaaca cgtaaaaatc gttgcaactt 300

tagacagctt aaataatctg attatgacct tttcttaaac cattcttttg ttttaaatat 360

tgaaaagaag aacgg 375

<210> 2

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggagaact taaatagaca aatacattta taagccgaaa actatgtcac tacgctttgc 60

tgcttttggc atatacatgt tgtttaattt actcgcatga aacgaaagcc acctcacgtc 120

gtgctatttt cggtgtaacc ttaacggtgg atctttaaat aaaaccaaac tatttaaatt 180

tagggcacaa tccaacaaaa gtagtacaac acgtaaaaat cgttgcaact ttagacagct 240

taaataatct gattatgacc ttttcttaaa ccattctttt gttttaaata ttgaaaagaa 300

gaacgg 306

<210> 3

<211> 254

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggagaact taaatagaca aatacattta taagccgaaa actatgtcac tacgctttgc 60

tgcttttggc atatacatgt tgtttaattt actcgcatga aacgaaagcc acctcacgtc 120

gtgctatttt cggtgtaacc ttaacggtgg atctttaaat aaaaccaaac tatttaaatt 180

tagggcacaa tccaacaaaa gtagtacaac acgtaaaaat cgttgcaact ttagacagct 240

taaataatct gatt 254

<210> 4

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaaacgaa agccacctca cgtcgtgcta ttttcggtgt aaccttaacg gtggatcttt 60

aaataaaacc aaactattta aatttagggc acaatccaac aaaagtagta caacacgtaa 120

aaatcgttgc aactttagac agcttaaata atctgattat gaccttttct taaaccattc 180

ttttgtttta aatattgaaa agaagaacgg 210

<210> 5

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaaacgaa agccacctca cgtcgtgcta ttttcggtgt aaccttaacg gtggatcttt 60

aaataaaacc aaactattta aatttagggc acaatccaac aaaagtagta caacacgtaa 120

aaatcgttgc aactttagac agcttaaata atctgatt 158