抗镉相关蛋白在调控植物的抗镉性及对镉的积累中的应用

摘要

本发明公开了抗镉相关蛋白在调控植物的抗镉性及对镉的积累中的应用。本发明所提供的抗镉相关蛋白在调控植物的抗镉性、调控植物对镉的积累、培育抗镉性增强的植物或培育对镉的积累量增高的植物中的应用；抗镉相关蛋白为序列1的第1-227位、序列1的第81-474位、序列1的第81-227位或序列1所示的蛋白质，或在上述蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的蛋白质。实验证明，在实际运用中可以利用CRRP调控野生型对镉的积累和对镉的抗性，也可以选育对镉的积累量高和抗镉性的植株。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中抗镉相关蛋白在调控植物的抗镉性及对镉的积累中的应用。

背景技术

目前重金属污染日益严重。重金属具有生物累积性，其污染很难自然降解，如铅、镉等重金属进入土壤环境，会长期蓄积并破坏土壤的自净能力，使土壤成为污染物的“储存库”。自然界中的重金属通过食物链进入人体，对人类的生命安全造成威胁。镉不是生物体的必需元素，对动物和植物的危害都很大。镉在植物体内积累可影响植物的光合作用、呼吸作用、气体交换、营养运输、抗氧化系统等，从而造成植物叶片皱缩失绿，根部褐化，生长停滞，最后使植物凋亡。

叶绿体是镉敏感的细胞器之一。在镉胁迫下，叶绿体结构、光合作用、电子传递链以及参与光合作用的酶都会受到伤害，从而产生活性氧反应(ROS)，光合速率降低等不良反应。植物修复是一种具有成本低，处理设施简单，适合大规模应用，利于土壤生态系统保持，对环境扰动小等特点的绿色修复方式。随着分子生物学和应用遗传工程的发展，运用转基因技术提高植物修复效率成为植物修复研究领域的重点和热点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗镉性及对镉的积累量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了抗镉相关蛋白在下述a1)、a2)、a3)或a4)中的应用：

a1)调控植物的抗镉性；

a2)调控植物对镉的积累；

a3)培育抗镉性增强的植物；

a4)培育对镉的积累量增高的植物；

所述抗镉相关蛋白，其名称为CRRP，是如下A1)、A2)、A3)、A4)、A5)或A6)：

A1)氨基酸序列为序列1的第1-227位的蛋白质；

A2)氨基酸序列为序列1的第81-474位的蛋白质；

A3)氨基酸序列为序列1的第81-227位的蛋白质；

A4)氨基酸序列为序列1的蛋白质；

A5)在A1)、A2)、A3)或A4)的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)、A2)、A3)或A4)衍生的蛋白质；

A6)在A1)、A2)、A3)、A4)或A5)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

其中，序列1由474个氨基酸残基组成。序列1的第236-474位为GFP的序列。

为了使A1)、A2)、A3)、A4)或A5)中的蛋白质便于纯化，可在A1)、A2)、A3)、A4)或A5)的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表、标签的序列

标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL

上述CRRP可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述CRRP的编码基因可通过将序列表中序列2的第1-681位、序列2的第241-1425位、序列2的第241-681位或序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中序列2所示的DNA片段编码序列1所示的蛋白质。

上述应用中，所述植物可为双子叶植物(如拟南芥)或单子叶植物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与CRRP相关的生物材料在所述a1)、所述a2)、所述a3)或所述a4)中的应用；所述生物材料为下述B1)至B14)中的任一种：

B1)编码CRRP的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B11)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；

B12)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子为如下b1)、b2)、b3)、b4)、b5)或b6)：

b1)核苷酸序列是序列2的第1-681位的cDNA分子或DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列2的第241-1425位的cDNA分子或DNA分子；

b3)核苷酸序列是序列2的第241-681位的cDNA分子或DNA分子；

b4)核苷酸序列是序列2的cDNA分子或DNA分子；

b5)与b1)、b2)、b3)或b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码CRRP的cDNA分子或基因组DNA分子；

b6)在严格条件下与b1)、b2)、b3)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码CRRP的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，序列2由1425个核苷酸组成，编码序列1所示的蛋白质。序列2的第1-240位编码序列1的第1-80位的蛋白质(将其命名为TP)，序列2的第241-681位编码序列1的第81-227位的蛋白质，序列2的第682-705位编码序列1的第228-235位的GFP，序列2的第706-1425位编码序列1的第236-474位的GFP。

上述应用中，B2)所述表达盒中，B1)所述核酸分子的表达由序列3所示的DNA分子或35S启动子启动。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码CRRP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的CRRP的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码CRRP且具有CRRP功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1的第1-227位、序列1的第81-474位、序列1的第81-227位或序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码CRRP的核酸分子的表达盒(CRRP基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达CRRP的DNA，该DNA不但可包括启动CRRP基因转录的启动子，还可包括终止CRRP基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature>

在本发明的一个实施例中，将载体p35S::TP-CRRP的HindⅢ和Xba I识别位点间的DNA片段替换为序列3所示的DNA分子(CAB2启动子)，得到重组载体，将该重组载体命名为pCAB2::TP-CRRP，pCAB2::TP-CRRP中CAB2启动子启动序列2所示的DNA分子的表达，pCAB2::TP-CRRP表达序列1所示的蛋白质。

可用现有的表达载体构建含有所述CRRP基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。所述农杆菌可为农杆菌C58。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

在本发明的一个实施方式中，CRRP的编码基因(即序列2的第241-681位所示的DNA分子)通过含有CRRP的编码基因的表达盒的重组载体导入农杆菌C58中。所述重组载体为用序列2的第241-681位所示的DNA分子替换pCAMBIA1301–N–GFP的XbaI和Kpn I识别序列间的DNA片段得到的重组载体p35S::CRRP，p35S::CRRP中35S启动序列2的第241-1425位所示的DNA分子的表达，p35S::CRRP表达序列1的第81-474位所示的蛋白质。

在本发明的另一个实施方式中，CRRP的编码基因(即序列2的第1-681位所示的DNA分子)通过含有CRRP的编码基因的表达盒的重组载体导入农杆菌C58中。所述重组载体为用序列2的第1-681位所示的DNA分子替换pCAMBIA1301–N–GFP的Xba I和Kpn I识别序列间的DNA片段得到的重组载体p35S::TP-CRRP，p35S::TP-CRRP中35S启动序列2的第1-681位所示的DNA分子的表达，p35S::TP-CRRP表达序列1所示的蛋白质。

上述应用中，所述植物可为双子叶植物(如拟南芥)或单子叶植物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述C1)或C2)的方法：

C1)培育抗镉性增强的转基因植物的方法，包括：向受体植物中导入CRRP的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比抗镉性增强；

C2)培育抗镉性增强的转基因植物的方法，包括：向受体植物中导入含有CRRP的编码基因的表达盒得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比抗镉性增强。

上述方法中，所述CRRP的编码基因的编码序列可为B1)所述核酸分子；

所述表达盒中所述CRRP的编码基因的表达可由序列3所示的DNA分子(CAB2启动子)或35S启动子启动。

在本发明的实施例中，所述CRRP的编码基因通过含有CRRP的编码基因表达盒的CRRP基因重组表达载体导入目的植物中。

上述方法中，其中所述CRRP的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述CRRP的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述CRRP基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geisersonand Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述CRRP的编码基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述植物可为双子叶植物(如拟南芥)或单子叶植物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述D1)或D2)的方法：

D1)培育对镉的积累量增高的转基因植物的方法，包括：向受体植物中导入CRRP的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比镉的积累量增高；

D2)培育对镉的积累量增高的转基因植物的方法，包括：向受体植物中导入含有CRRP的编码基因的表达盒得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比镉的积累量增高。

上述方法中，所述CRRP的编码基因的编码序列可为B1)所述核酸分子；

所述表达盒中所述CRRP的编码基因的表达可由序列3所示的DNA分子(CAB2启动子)或35S启动子启动。

在本发明的实施例中，所述CRRP的编码基因通过含有CRRP的编码基因表达盒的CRRP基因重组表达载体导入目的植物中。

上述方法中，其中所述CRRP的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述CRRP的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述CRRP基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geisersonand Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述CRRP的编码基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述植物可为双子叶植物(如拟南芥)或单子叶植物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了CRRP或所述生物材料。

实验证明，本发明的抗镉相关蛋白及其编码基因(CRRP基因)可以提高植物的抗镉性，序列3所示的DNA分子在作为启动子时(即CAB2启动子)以及序列1的第1-80位所示的多肽可以进一步提高植物对镉的抗性：在CdCl₂浓度为50μM时，转CRRP基因植株p35S::TP-CRRP6和p35S::TP-CRRP8以及CAB2启动子启动CRRP基因表达的植株pCAB2::TP-CRRP1的根长均显著高于野生型的根长，转CRRP基因且CAB2启动子启动CRRP基因表达的植株pCAB2::TP-CRRP4的单株鲜重显著高于野生型的单株鲜重；在CdCl₂浓度为75μM时，转CRRP基因植株p35S::TP-CRRP6和p35S::TP-CRRP8以及CAB2启动子启动CRRP基因表达的植株pCAB2::TP-CRRP4的根长均显著高于野生型的根长，转CRRP基因植株p35S::CRRP2、p35S::CRRP8和p35S::TP-CRRP8以及CAB2启动子启动CRRP基因表达的植株pCAB2::TP-CRRP1和pCAB2::TP-CRRP4的单株鲜重均显著高于野生型的单株鲜重；在CdCl₂浓度为100μM时，转CRRP基因植株

p35S::TP-CRRP8和CAB2启动子启动CRRP基因表达的植株pCAB2::TP-CRRP1的根长均显著高于野生型的根长，转CRRP基因植株p35S::TP-CRRP8的单株鲜重均显著高于野生型的单株鲜重。在实际运用中可以利用CRRP基因及其编码的蛋白质、序列3所示的DNA分子以及序列1的第1-80位所示的多肽调控植物对镉的抗性，也可以选育抗镉的植株。

实验证明，本发明的抗镉相关蛋白及其编码基因(CRRP基因)可以提高植物的对镉的积累量，序列3所示的DNA分子在作为启动子时以及序列1的第1-80位所示的多肽可以进一步提高植物对镉的积累量：在CdCl₂处理第7天，转CRRP基因植株以及CAB2启动子启动CRRP基因表达的转基因株系根的镉积累量均极显著高于野生型；在CdCl₂处理第16天，转CRRP基因植株以及CAB2启动子启动CRRP基因表达的转基因植株地上部分及根的镉积累量均显著高于野生型。而在CdCl₂处理的第2天和第7天，转CRRP基因植株以及CAB2启动子启动CRRP基因表达的转基因植株中镉从根转移至地上部分的转移系数均极显著小于野生型。在实际运用中可以利用CRRP基因及其编码的蛋白质、序列3所示的DNA分子以及序列1的第1-80位所示的多肽调控野生型对镉的积累，也可以选育对镉的积累量高的植株。

本发明的CRRP基因可在叶绿体中表达，可利用CRRP基因及其编码的蛋白质、序列3所示的DNA分子以及序列1的第1-80位所示的多肽实现在重金属污染的土壤上种植既能够耐受重金属胁迫又能够富集重金属离子的植物修复土壤，还可以获得新型的用于土壤修复的植物品种。

附图说明

图1为转基因拟南芥在DNA水平上的鉴定结果。其中，WT表示拟南芥哥伦比亚生态型,1-11为相应转基因拟南芥的株系编号；A为转空载体拟南芥(p35S::GFP)与野生型拟南芥(WT)的检测结果，B为转基因拟南芥的检测结果。

图2为转基因拟南芥在蛋白质水平上的鉴定结果。其中，1-9为相应转基因拟南芥的株系编号；A为转空载体拟南芥(p35S::GFP)与野生型拟南芥(WT)的检测结果，B为转基因拟南芥的检测结果。

图3为转基因拟南芥中目的基因编码蛋白质的亚细胞定位。其中A-G为p35S::cadR-GFP拟南芥的结果，A为整株拟南芥(GFP荧光)，B为叶表皮细胞(GFP荧光)，C为叶肉细胞(GFP荧光与叶绿体自发荧光重合)，D为下胚轴细胞(GFP荧光)，E为下胚轴细胞(GFP荧光与叶绿体自发荧光重合)，F为根毛(GFP荧光)，G为根尖(GFP荧光)；H-P为p35S::TP-cadR-GFP拟南芥的结果，H为整株拟南芥(GFP荧光)，I-K为叶肉细胞，I为GFP荧光，J为叶绿体自发荧光，K为GFP荧光与叶绿体自发荧光重合后的结果，L-N为下胚轴细胞，L为GFP荧光，M为叶绿体自发荧光，N为GFP荧光与叶绿体自发荧光重合后的结果，O根毛中质体的GFP荧光为，P为根中质体的GFP荧光；Q-Y为pCAB2::TP-cadR-GFP拟南芥的结果，Q为整株拟南芥(GFP荧光)，R-T为叶肉细胞，R为GFP荧光，S为叶绿体自发荧光，T为GFP荧光与叶绿体自发荧光重合后的结果，U-W为下胚轴细胞，U为GFP荧光，V为叶绿体自发荧光，W为GFP荧光与叶绿体自发荧光重合后的结果，X为GFP荧光通道与明场重合下的根毛，Y为GFP荧光通道与明场重合下的根。

图4为不同CdCl₂浓度的对转基因拟南芥的影响。其中，WT表示转空载体拟南芥，*表示与WT相比具有显著性差异，**表示与WT相比具有极显著差异；A为不同浓度下各转基因拟南芥株系外观，B为不同浓度下各转基因拟南芥株系的根长与单株鲜重。

图5为CdCl₂处理不同时间各转基因株系地上部分与根的镉积累量与转移系数。其中，WT表示转空载体拟南芥，*表示与WT相比具有显著性差异，**表示与WT相比具有极显著差异，叶表示地上部分。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的农杆菌C58(蔺晓丽，根癌农杆菌C58六型分泌系统关键组分ClpV结构和功能的初步研究，海南大学，2011年)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的拟南芥哥伦比亚生态型(Arabidopsis thaliana ecotypeColumbia)：记载于“Wei Chi,Jinfang Ma,Dongyuan Zhang,et al.ThePentratricopeptide Repeat Protein DELAYED GREENING1Is Involved in theRegulation of Early Chloroplast Development and Chloroplast Gene Expressionin Arabidopsis.Plant Physiology,June 2008,Vol.147,pp.573-584.”一文中，公众可从中国科学院植物研究所获得。

下述实施例中的YEB液体培养基的配制方法为：将10g蛋白胨、10g酵母提取物和5g NaCl用蒸馏水溶解，蒸馏水定容至1L，pH7.0，灭菌。YEB固体培养基为向YEB液体培养基中加入1.5％(1.5g/100mL)的琼脂得到的无菌培养基，pH7.0。

下述实施例中的0μM、25μM、50μM、75μM和100μM CdCl₂固体培养基为向固体培养基中添加CdCl₂得到的CdCl₂浓度分别为0μM、25μM、50μM、75μM和100μM的培养基，其中，固体培养基为向1/2MS液体培养基中加入琼脂粉和蔗糖得到的琼脂粉和蔗糖的浓度均为1g/100mL的培养基。

实施例1、转基因拟南芥的构建

本发明提供了来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的抗镉相关蛋白(CRRP)，其氨基酸序列为序列1的第81-227位，CRRP由序列2的第241-681位所示的抗镉相关蛋白基因(CRRP基因)编码。

一、重组载体及重组菌的制备

将载体pCAMBIA1301–N–GFP的Xba I和Kpn I识别位点间的DNA片段替换为序列2的第241-681位所示的CRRP基因，得到重组载体，将该重组载体命名为p35S::CRRP，p35S::CRRP中35S启动CRRP基因的表达，p35S::CRRP表达序列1的第81-474位所示的蛋白质。

其中，pCAMBIA1301-N-GFP载体的制备方法如下：用Hind III和EcoR I双酶切p221-GFP载体，回收大小为1460bp的目的条带(含GFP的表达框)，将其与经过同样双酶切的pCAMBIA1301载体的骨架片段相连，得到的重组载体命名为pCAMBIA1301-N-GFP载体。其中，p221-GFP载体记载于“Wei Chi,Jinfang Ma,Dongyuan Zhang,et al.The Pentratricopeptide Repeat Protein DELAYEDGREENING1Is Involved in the Regulation of Early Chloroplast Developmentand Chloroplast Gene Expression in Arabidopsis.Plant Physiology,June 2008,Vol.147,pp.573-584.”一文中，公众可从中国科学院植物研究所获得；pCAMBIA1301载体为Cambia公司产品。

将载体pCAMBIA1301–N–GFP的Xba I和Kpn I识别位点间的DNA片段替换为序列2的第1-681位所示的DNA分子，得到重组载体，将该重组载体命名为p35S::TP-CRRP，p35S::TP-CRRP中35S启动序列2的第1-681位所示的DNA分子的表达，p35S::TP-CRRP表达序列1所示的蛋白质。

其中，序列2由1425个核苷酸组成，编码序列1所示的蛋白质。序列2的第1-240位编码序列1的第1-80位的蛋白质(将其命名为TP)，序列2的第241-681位编码序列1的第81-227位的蛋白质，序列2的第706-1425位编码序列1的第236-474位的GFP。

将载体p35S::TP-CRRP的HindⅢ和Xba I识别位点间的DNA片段替换为序列3所示的DNA分子(CAB2启动子)，得到重组载体，将该重组载体命名为pCAB2::TP-CRRP，pCAB2::TP-CRRP中CAB2启动子启动序列2所示的DNA分子的表达，pCAB2::TP-CRRP表达序列1所示的蛋白质。

将p35S::CRRP、p35S::TP-CRRP、pCAB2::TP-CRRP和pCAMBIA1301–N–GFP分别导入农杆菌C58中，分别得到含有p35S::CRRP的重组菌、p35S::TP-CRRP的重组菌、pCAB2::TP-CRRP的重组菌和pCAMBIA1301–N–GFP的重组菌，将其分别命名为C58–p35S::CRRP、C58–p35S::TP-CRRP、C58–pCAB2::TP-CRRP和C58–pCAMBIA1301–N–GFP。

二、转基因拟南芥的构建

1、利用农杆菌介导的蘸花法转化野生型拟南芥

①从YEB固体培养基上挑取重组农杆菌C58–p35S::CRRP单克隆接种到10mL含相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃200rpm振荡培养至对数期。

②以1:50(体积比)的比例转接到50mL新鲜的YEB液体培养基中，同样条件下培养至OD₆₀₀约为1.0左右，6000rpm，离心5min收集菌体，弃上清液，用浓度为5％(5g/100ml)的蔗糖水溶液重悬菌体，重复洗一遍。然后，用5％(5g/100ml)蔗糖水溶液将菌体重悬至OD₆₀₀为0.8，加入si>

拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型种子播种于装有土壤(营养土和蛭石以1:1的体积比混合)小盆中，置于培养室中生长。拟南芥生长条件均为22℃，相对湿度为60％-70％，16h光照，8h黑暗。约35d后，选已经抽苔正在开花的拟南芥，剪去角果，将整个花序浸泡在上述准备的转化液中，浸约15s左右。将农杆菌侵染后的拟南芥放于阴暗处保湿培养24h，然后转移至培养室中正常生长。

③为获得较高的转化效率，可在一周后浸蘸第二次。将得到的转基因拟南芥命名为p35S::CRRP-GFP拟南芥。

2、转基因拟南芥的抗生素筛选

①收获成熟的T1代p35S::CRRP拟南芥种子，经过表面消毒灭菌，平铺在含有40μg/mL潮霉素的固体培养基(该固体培养基为在1/2MS液体培养基中另加1％(1g/100ml)琼脂粉，pH值为5.8)的平板上；

②4℃低温春化两天后，置于光照培养箱避光生长。条件为22℃，相对湿度为60％-70％，16h光照，8h黑暗；

③4d后，观察培养皿中拟南芥幼苗的胚轴。胚轴长的即为抗潮霉素的阳性植株T1代p35S::CRRP拟南芥幼苗，移植到土壤中继续培养。其中，1/2MS液体培养基的配方为500mL蒸馏水中加入1.11g MS盐(Sigma-Aldrich)，pH5.8。

按照步骤1和2的方法，将C58–p35S::CRRP分别替换为C58–p35S::TP-CRRP、C58–pCAB2::TP-CRRP和C58–pCAMBIA1301–N–GFP，其他步骤均不变，得到三种转基因拟南芥，将其分别命名为p35S::TP-CRRP-GFP拟南芥、pCAB2::TP-CRRP-GFP拟南芥和转空载体拟南芥(p35S::GFP)。

三、转基因拟南芥的鉴定

1、DNA水平

分别提取步骤二抗生素筛选后的p35S::CRRP-GFP拟南芥、p35S::TP-CRRP-GFP拟南芥、pCAB2::TP-CRRP-GFP拟南芥叶片基因组DNA进行鉴定，并用转空载体拟南芥和拟南芥哥伦比亚生态型作为对照。鉴定p35S::CRRP-GFP拟南芥的正向引物为GCTCTAGAATGAAGATCGGAGAACTGGC(下划线为限制性内切酶的识别序列)，反向引物为GCAGTACTCTTGTACAGCTCGTCCATGC(下划线为限制性内切酶的识别序列)，鉴定p35S::TP-CRRP-GFP拟南芥、pCAB2::TP-CRRP-GFP拟南芥的正向引物为GCTCTAGAATGGCTTCCTCTATGCTCTCT(下划线为限制性内切酶的识别序列)，反向引物为GCAGTACTCTTGTACAGCTCGTCCATGC(下划线为限制性内切酶的识别序列)，结果如图1所示。结果显示，转空载体拟南芥和拟南芥哥伦比亚生态型中均不含有目的条带，p35S::CRRP-GFP拟南芥、p35S::TP-CRRP-GFP拟南芥、pCAB2::TP-CRRP-GFP拟南芥均含有相应的目的条带。

2、蛋白质水平

分别提取步骤二抗生素筛选后的p35S::CRRP-GFP拟南芥、p35S::TP-CRRP-GFP拟南芥、pCAB2::TP-CRRP-GFP拟南芥叶片总蛋白，利用western-blot在蛋白水平上进行鉴定，并用转空载体拟南芥和拟南芥哥伦比亚生态型作为对照。用到的一抗均为GFP抗体(Abmart，M20004S)，内参为CBB，结果如图2所示。结果显示，转空载体拟南芥和拟南芥哥伦比亚生态型中均未检测到目的蛋白，除p35S::CRRP-GFP拟南芥的编号为3的株系，其余p35S::CRRP-GFP拟南芥、p35S::TP-CRRP-GFP拟南芥、pCAB2::TP-CRRP-GFP拟南芥均有目的基因的表达。选取目的基因表达量高的转基因拟南芥进行后续实验，选取的株系为编号为2和8的p35S::CRRP-GFP拟南芥(分别简称为p35S::CRRP2和p35S::CRRP8)，编号为6和8的p35S::TP-CRRP-GFP拟南芥(分别简称为p35S::TP-CRRP6和p35S::TP-CRRP8)，编号为1和4的pCAB2::TP-CRRP-GFP拟南芥(分别简称为pCAB2::TP-CRRP1和pCAB2::TP-CRRP4)。

3、目的基因编码蛋白质的亚细胞定位

分别观察步骤二抗生素筛选后的p35S::CRRP-GFP拟南芥、p35S::TP-CRRP-GFP拟南芥和pCAB2::TP-CRRP-GFP拟南芥中目的基因编码蛋白质的定位情况，结果如图3所示，p35S::CRRP-GFP拟南芥、p35S::TP-CRRP-GFP拟南芥和pCAB2::TP-CRRP-GFP拟南芥中目的基因在叶肉、叶表、下胚轴和根部的细胞质中均有表达。p35S::TP-CRRP-GFP拟南芥和pCAB2::TP-CRRP-GFP拟南芥中目的基因在叶绿体中有表达。

实施例2、转基因拟南芥的抗镉性鉴定

按照如下方法鉴定转基因拟南芥的抗镉性，实验重复三次：

分别在0μM、25μM、50μM、75μM和100μM CdCl₂固体培养基中播种实施例1的p35S::CRRP2、p35S::CRRP8、p35S::TP-CRRP6、p35S::TP-CRRP8、pCAB2::TP-CRRP1和pCAB2::TP-CRRP4的种子，每个株系的种子均在上述五种培养基中进行播种，每个培养基60粒种子，在8小时光照/16小时黑暗，25℃条件下进行将培养基竖直放置进行培养，将播种当天记为处理第0天。将转空载体拟南芥和拟南芥哥伦比亚生态型(WT)作为对照。

在播种第10天统计各转基因拟南芥的根长(表1)与单株鲜重(表2)，结果如图4所示。用HSD turkey检验方法在p<0.05和p<0.01水平上对各转基因株系与WT之间差异的显著性进行比较。

表1、不同CdCl₂浓度处理后的根长(cm)

表2、不同CdCl₂浓度处理后的单株鲜重(mg/株)

结果显示，WT与转空载体拟南芥在不同CdCl₂浓度下的根长与单株鲜重均无显著差异。在CdCl₂浓度为25μM时，各转基因株系的根长均显著高于WT的根长，各转基因的单株鲜重与WT均无显著差异；在CdCl₂浓度为50μM时，p35S::TP-CRRP6、p35S::TP-CRRP8和pCAB2::TP-CRRP1的根长均显著高于WT的根长，pCAB2::TP-CRRP4的单株鲜重显著高于WT的单株鲜重；在CdCl₂浓度为75μM时，p35S::TP-CRRP6、p35S::TP-CRRP8和pCAB2::TP-CRRP4的根长均显著高于WT的根长，p35S::CRRP2、p35S::CRRP8、p35S::TP-CRRP8、pCAB2::TP-CRRP1和pCAB2::TP-CRRP4的单株鲜重均显著高于WT的单株鲜重；在CdCl₂浓度为100μM时，p35S::TP-CRRP8和pCAB2::TP-CRRP1的根长均显著高于WT的根长，p35S::TP-CRRP8的单株鲜重均显著高于WT的单株鲜重。表明，CRRP基因及其编码的蛋白质可以提高拟南芥对镉的抗性，序列3所示的DNA分子在作为启动子时可以进一步提高拟南芥对镉的抗性，序列1的第1-80位所示的多肽也可以进一步可以提高拟南芥对镉的抗性。在实际运用中可以利用CRRP基因及其编码的蛋白质、序列3所示的DNA分子以及序列1的第1-80位所示的多肽调控拟南芥对镉的抗性，也可以选育抗镉的植株。

实施例3、转基因拟南芥镉积累的鉴定

按照如下方法鉴定转基因拟南芥的镉积累，实验重复三次：

①将实施例1的p35S::CRRP2、p35S::CRRP8、p35S::TP-CRRP6、p35S::TP-CRRP8、pCAB2::TP-CRRP1和pCAB2::TP-CRRP4的种子分别在1/2MS固体培养基上培养14d，转移至水培营养液(水培营养液为由水和溶质组成的液体，其中溶质及其浓度分别为：1.5mM Ca(NO₃)₂·4H₂O,1.25mM>3,0.75mM>4·7H₂O,0.42mM>2PO₄,38μM>3BO₃,12μM>4·H₂O,0.99μM>4,0.69μM>4·5H₂O,0.24μMNa₂MoO₄·2H₂O,100μM>2SiO₃·5H₂O,50μM>2水培营养液(CdCl₂水培营养液为向水培营养液中添加CdCl₂得到的CdCl₂浓度为20μM的液体)，继续培养，将更换为CdCl₂水培营养液的当天记为培养第0天。

②将培养第2天、培养第7天和培养第16天的拟南芥取出，依次用自来水和去离子水冲洗植株，然后分别收集地上部分和根部，80℃烘干至恒重。

③材料称干重后，倒入消煮管中，加入6mL浓硝酸冷消化过夜。

④第二天加入2mL 30％(体积百分比浓度)的过氧化氢，静置15min后，盖上盖子。用微波消解的方法对样品进行消煮。

⑤消煮完全后，将液体从消煮管中转移至容量瓶，定容至50mL，过滤。

⑥用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)检测植株中镉离子积累量。

按照上述方法，分别用和拟南芥哥伦比亚生态型(WT)进行实验作为对照。

鉴定结果参看附图5与表3，并计算转移系数(表4)，转移系数＝地上部分镉含量/根中镉含量，用HSD turkey检验的方法在p<0.05和p<0.01水平上对各转基因株系与WT之间差异的显著性进行比较。

表3、CdCl₂处理不同时间后地上部分与根的镉积累量(μg/g干重)

表4、CdCl₂处理不同时间后镉的转移系数

结果显示，WT与转空载体拟南芥在CdCl₂处理不同时间时，地上部分与根的镉积累量以及转移系数均无显著差异。在CdCl₂处理第2天，各转基因株系地上部分的镉积累量与WT均无显著差异，除pCAB2::TP-CRRP4外，其余各转基因株系根的镉积累量均显著高于WT；在CdCl₂处理第7天，各转基因株系地上部分的镉积累量与WT均无显著差异，各转基因株系根的镉积累量均极显著高于WT；在CdCl₂处理第16天，各转基因株系地上部分及根的镉积累量均显著高于WT。而在CdCl₂处理的第2天和第7天，各转基因株系转移系数均极显著小于WT。表明，CRRP基因及其编码的蛋白质可以促进拟南芥对镉的积累，序列3所示的DNA分子在作为启动子时也可以促进拟南芥对镉的积累。在实际运用中可以利用CRRP基因及其编码的蛋白质、序列3所示的DNA分子以及序列1的第1-80位所示的多肽调控拟南芥对镉的积累，也可以选育对镉的积累量高的植株。