用于检测COX‑1、COX‑2和GPIIIa基因多态性的核酸、试剂盒及方法

摘要

本发明公开了用于检测COX‑1、COX‑2和GPIIIa基因多态性的核酸及试剂盒，同时建立具有特异性强、灵敏度高、准确度高、操作简单的检测COX‑1、COX‑2和GPIIIa基因多态性的检测方法。其检测结果为阿司匹林抵抗提供指导性意义。本发明提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的核酸、试剂盒及方法。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异(包括置换、颠换、缺失和插入)形成的遗传标记，相比微卫星分子标记，其数量多，多态性丰富。一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3×10⁶个。因此，SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物敏感度或疾病的易感性等都可能与SNP有关。

随着我国人口老龄化，心脑血管病发病率逐年攀升，心脑血管疾病早已成为人类健康的第一大杀手，心脑血管疾病的高致死率、致残率和复发率已造成了极大的社会负担和经济负担。抗血小板药物(尤其是阿司匹林)在心脑血管病的防治中起着至关重要的作用，但是目前的调查结果表明很多心脑血管病患者即使服用了抗血小板药物，仍然反复再发卒中，这种现象称为抗血小板药物抵抗。

抗血小板药物抵抗与诸多因素相关，如心脑血管病的相关危险因素(糖尿病、代谢综合征、急性冠脉综合征疾病等)，患者依从性或药物剂量，药物相互作用及基因多态性等。其中基因多态性因素是目前研究热点。阿司匹林在体内主要是通过与内皮细胞环氧酶(Cyclooxygenase，COX)的结合使其失活，从而抑制血栓素A2(TXA2)和前列环素(PGI2)的产生，达到抗血小板的作用。既往研究发现，在体内影响阿司匹林作用的多个环节因子存在基因多态性，这种多态性直接影响其功能，从而使得不同个体服用阿司匹林后，对血小板的反应不同。据不完全统计，临床阿司匹林抵抗的患者高达40％。阿司匹林作为缺血性脑血管疾病二级预防的重要药物，尽快明确阿司匹林抵抗相关基因多态性至关重要。

COX有两种同工酶，即COX-1和COX-2。COX-l主要在成熟血小板表达，阿司匹林通过乙酰化COX-1活性位点530位的丝氨酸，不可逆抑制COX-1的活性，从而阻断血栓素A2(TXA2)介导的血小板活化，用于预防血栓性血管事件的发生。研究发现COX-1常见的4个多态性位点与阿司匹林抵抗的关系，发现SNP中A842G与阿司匹林抵抗有关，在用AA诱导测血小板聚集率时，阿司匹林抵抗患者中携带G等位基因的频率，要远高于阿司匹林敏感者，用PFA-100测血小板功能时，携带G等位基因的患者，有着更短的闭孔时间。COX-2为诱导型酶，生理情况下，在大多数组织和细胞中检测不到，离体情况下，许多刺激物，如生长因子、炎性细胞因子肿瘤诱导剂等可刺激细胞的COX-2表达。COX-2在动脉粥样斑块中表达，阿司匹林剂量需要达到抑制COX-1剂量的170倍，才能阻断COX-2，小剂量阿司匹林不能完全抑制COX-2诱导的TXA2生成，也是阿司匹林抵抗的原因之一。COX-2基因启动子-765G＞C多态位点研究表明GC杂合基因携带者与GG纯合基因携带者相比较，前者对阿司匹林药效不敏感的概率是后者的3.872倍。

血小板膜糖蛋白(Glycoprotein IIIa，GPIIIa)是主要的血小板整合素和激活剂，它是一种跨膜的糖蛋白复合物。其作用是作为受体，介导纤维蛋白原结合于血小板表面及随后的血小板聚集。GPIIIa基因编码的PLA存在多态性，表现为PLA1/A1和PLA2/A2纯合型、PLA1/A2杂合型。超过30％的心血管病患者为PLA2/A2纯合型，许多研究证实PLA2/A2纯合型与血小板活性增强有关，此型患者应用阿司匹林之后的抗血小板作用较差，说明此种单核苷酸多态性可能促成阿司匹林抵抗。迄今已发现5种GPIIIa的多态性，较为常见的是外显子2第1565位氨基酸的突变，即T1565C(Leu33/Pro，rs5918)，分别决定了PLA1和PLA2两种等位基因，编码Leu的位点称为PLA1，编码蛋白的位点称为PLA2。

目前，针对基因多态性检测的方法有多种，最简单的方法是PCR-RFLP，但该方法操作复杂，样本多时易造成PCR产物的交叉污染，且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性的结果，可靠性低。DNA测序法虽然是金标准，但步骤繁琐，过程复杂，容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败，另外测序仪价格超出了一般临床检验实验室的承受范围。高分辨率溶解曲线法，快速，简便，经济实用，但是受仪器温度控制，假阳性高。

发明内容

为克服以上现有检测技术的不足，本发明的提供了一组用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的核酸。本发明的另一个目的是提供一种用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的试剂盒及其检测方法，该试剂盒及其检测方法具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单等优点。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的核酸，该核酸包括以下的引物对和检测探针：

COX-1基因A842G野生型引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示；

COX-1基因A842G突变型引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

COX-1基因A842G检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

COX-2基因G-765C野生型引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示；

COX-2基因G-765C突变型引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；

COX-2基因G-765C检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

GPIIIa基因T1565C野生型引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示；

GPIIIa基因T1565C突变型引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.10，和SEQ ID NO.11所示；

GPIIIa基因T1565C检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

如上所述的核酸，优选的，所述核酸还包括内部质控，所述内部质控包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。

如上所述的核酸，优选的，所述核酸还包括如下阳性对照物：

COX-1基因A842G野生型阳性对照物：含有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；

COX-1基因A842G突变型阳性对照物：含有如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列；

COX-2基因G-765C野生型阳性对照物：含有如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；

COX-2基因G-765C突变型阳性对照物：含有如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列；

GPIIIa基因T1565C野生型阳性对照物：含有如SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；

GPIIIa基因T1565C突变型阳性对照物：含有如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列；

和质控阳性对照物：含有如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列。

一种用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的试剂盒，该试剂盒用于实时荧光PCR检测COX-1基因A842G位点、COX-2基因G-765C位点和GPIIIa基因T1565C位点的野生型和突变型，所述试剂盒包括如上所述的核酸，其中，各检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团，或/和质控探针的5＇端连接有不同于所述检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述检测探针的淬灭基团。

如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、矿物油、阴性对照物：水。

如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

一种检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的方法，该方法包括以下步骤：

(1)从样品中提取DNA；

(2)对提取的所述DNA，同时进行COX-1、COX-2和GPIIIa基因的野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；其中，在COX-1、COX-2和GPIIIa基因的野生型体系中含如上各基因的野生型引物对和对应的检测探针；在COX-1、COX-2和GPIIIa基因的反突变型体系中含如上各基因所述突变型引物对和对应的检测探针，各检测探针的5＇端连接有荧光基团，3＇端连接有淬灭基团；

(3)收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品的所述COX-1、COX-2和GPIIIa基因的野生型反应体系和突变型反应体系的荧光信号，达到设定阈值所需的循环次数Ct值的差值ΔCt值来确定样本中含COX-1、COX-2和GPIIIa基因的基因型。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，COX-1、COX-2和GPIIIa基因的所述野生型体系和所述突变型体系中均还包括有作为内部质控的质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，该质控探针的5＇端连接有不同于所述探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述探针的淬灭基团。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，在所述野生型体系和所述突变型体系中，各条引物和探针的终浓度为100-1000nmol/L；所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

如上所述的方法，优选地，步骤(2)中，所述实时荧光PCR扩增的反应程序为：

第一阶段：95℃5min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第三阶段:95℃5s，58℃30s，72℃30s，30个循环；

第三阶段:30个循环中72℃时，收集荧光信号。

如上所述的方法，优选地，所述检测探针的5＇端连接FAM，3＇端连接MGB，所述质控探针的5＇端连接JOE，3＇端连接BHQ1；

步骤(4)中，所述确定样本DNA的各基因型，各基因对应的野生型反应体系与突变型反应体系的Ct值按照如下计算确定样本类型：

ΔCt＝|野生型Ct值-突变型Ct值|≤2.5为杂合型样本；

ΔCt＝野生型Ct值-突变型Ct值>2.5为突变型样本；

ΔCt＝突变型Ct值-野生型Ct值>2.5为野生型样本。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，还设有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照是分别将含有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列的COX-1基因A842G野生型阳性对照物；含有如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列的COX-1基因A842G突变型阳性对照物；含有如SEQID No.18所示的核苷酸序列的COX-2基因G-765C野生型阳性对照物；含有如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列的COX-2基因G-765C突变型阳性对照物；含有如SEQ ID No.20所示的核苷酸序列的GPIIIa基因T1565C野生型阳性对照物；含有如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列的GPIIIa基因T1565C突变型阳性对照物为模板，加入各自基因对应的反应体系中进行检测；同时在该各自基因对应的反应体系均加入含有如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列的质控阳性对照物；进行所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；所述阴性对照为以无核酸酶水为模板，进行各自基因的所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；

在步骤(4)中，所述阳性对照的野生型体系和突变型体系的FAM均有明显的扩增曲线，JOE有明显的扩增曲线且JOE信号的Ct值小于25，符合要求，检测结果可靠；所述阴性对照的野生型体系和突变型体系的FAM都没有明显的扩增曲线，符合要求，检测结果可靠，否则应重新配置检测体系，重新进行检测。

本发明提供了一组用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的核酸及试剂盒，同时建立具有特异性强、灵敏度高、准确度高、操作简单的检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的检测方法，其检测结果为阿司匹林抵抗提供指导性意义。

本发明提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。

本发明提供的检测试剂盒及方法，用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性时，为了避免漏检、及初步判断样本DNA量是否在允许范围内，设有内部质控，为了判断检测体系是否正常，还设有阴性对照和检测引物的阳性对照；为了避免假阴性及漏检，设有阳性对照，其阳性对照检测呈阳性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阴性结果及漏检；为了避免假阳性及漏检，设有阴性对照，其阴性对照检测呈阴性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阳性结果及漏检；检测试剂盒及方法设计严谨，有效避免漏检、错检的可能。

与现有技术相比，本发明运用ARMS引物分野生型和突变型基因，有如下有益效果和显著进步：

(1)灵敏度高，可以准确检出低至0.01ng/μL的基因组DNA，检测结果可信，且对于保存时间过长以及口腔拭子这些提取浓度很低的样本能准确检出。

(2)特异性强，对于高至500ng的基因组DNA样本也能够准确检出。因此，可以减少稀释样本的过程，提取出的样本直接上母液都能准确检测而不会出现结果误判。

(3)适用于多种样本类型：本发明不仅能检测常规的EDTA抗凝的全血细胞DNA，还能检测提取质量差的口腔拭子，还可以直接检测全血细胞裂解红细胞后的白细胞，检测结果准确度高。

(4)成本低，ARMS分型法相对Taqman探针分型法，不仅能保留Taqman的高灵敏度和高特异性，而且还能节约成本，ARMS引物合成快速简单，合成成本低，扩增效果更佳。

(5)检测速度快，整个检测过程只需要90分钟。

(6)应用Applied Biosystems公司生产的Fast master Premix预混在反应体系中，制备成可直接加入样品检测的试剂盒，减少了酶与样本混合的步骤，减少了样本的污染，操作更简单，一步加样，避免了气溶胶污染引起的假阳性。

(7)安全：整个试剂盒不包含有毒有害物质，对操作人员和环境无危害。

本发明涉及的COX-1、COX-2和GPIIIA基因多态性检测试剂盒适用于临床多种样本类型检测，具有特异性强，灵敏度高，实验周期短，操作简单，安全无毒，成本低等显著优点。

附图说明

图1为本发明一优选试剂盒检测样本XY04中COX-1基因的扩增曲线。

图2为本发明一优选试剂盒检测样本XY04中COX-2基因的扩增曲线。

图3为本发明一优选试剂盒检测样本XY04中GPIIIa基因的扩增曲线。

图4为本发明一优选试剂盒检测样本KQ07中COX-1基因的扩增曲线。

图5为本发明一优选试剂盒检测样本KQ07中COX-2基因的扩增曲线。

图6为本发明一优选试剂盒检测样本KQ07中GPIIIa基因的扩增曲线。

图7为本发明一优选试剂盒灵敏度的扩增曲线。

图8为本发明一优选试剂盒特异性的扩增曲线。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1引物、探针、验证模板设计

本发明的具体原理是：针对不同基因位点分别设计野生型和突变型ARMS引物和Taqman-MGB探针，结合荧光定量PCR反应，对从人外周血细胞或口腔拭子中提取的基因组DNA进行检测，可以一次性在一条6联PCR反应条上实现对环氧化酶1(COX-1)基因A842G、环氧化酶2(COX-2)基因G-765C和血小板膜糖蛋白(GPIIIa)基因T1565C的基因多态性进行检测，通过实时荧光PCR仪上收集信号，计算野生型和突变型的ΔCt值来确定样本DNA的基因型。

分别针对人类COX-1基因A842G位点、COX-2基因G-765C位点、GPIIIa基因T1565C位点设计各基因对应的野生型上游引物、突变型上游引物、公用下游引物和公用检测探针，通过多次试验、优化、最后获得的引物及检测探针如下，核苷酸序列具体见表1：

COX-1基因A842G野生型ARMS引物：上游引物(AC1-FW)SEQ ID NO.1和下游引物(AC1-R)SEQ ID NO.3；

COX-1基因A842G突变型ARMS引物：上游引物(AC1-FM)SEQ ID NO.2，和下游引物SEQ ID NO.3；

COX-1基因A842G公用检测探针(AC1-P)：SEQ ID NO:4；

COX-2基因G-765C野生型ARMS引物：上游引物(AC2-FW)SEQ ID NO.5，下游引物(AC2-R)SEQ ID NO.7；

COX-2基因G-765C突变型ARMS引物：上游引物(AC2-FM)SEQ ID NO.6，下游引物SEQID NO.7；

COX-2基因G-765C公用检测探针(AC2-P)：SEQ ID NO:8；

GPIIIa基因T1565C野生型ARMS引物：上游引物(AGP-FW)SEQ ID NO.9，下游引物(AGP-R)SEQ ID NO.11；

GPIIIa基因T1565C突变型ARMS引物：上游引物(AGP-FM)SEQ ID NO.10，下游引物SEQ ID NO.11；

GPIIIa基因T1565C探针(AGP-P)：SEQ ID NO.12。

其中，COX-1基因A842G野生型引物对的扩增产物长度为84bp，突变型引物扩增片段长度为84bp。扩增产物可作为阳性对照，即COX-1基因A842G野生型阳性对照物含SEQ IDNo.16所示的核苷酸序列、COX-1基因A842G突变型阳性对照物含SEQ ID No.17所示的核苷酸序列。

COX-2基因G-765C野生型引物对的扩增产物长度为73bp，突变型引物扩增片段长度为74bp。扩增产物可作为阳性对照，即COX-2基因G-765C野生型阳性对照物含SEQ IDNo.18所示的核苷酸序列、COX-2基因G-765C突变型阳性对照物含SEQ ID No.19所示的核苷酸序列。

GPIIIa基因T1565C野生型引物对的扩增产物长度为81bp，突变型引物扩增片段长度为79bp。扩增产物可作为阳性对照，即GPIIIa基因T1565C野生型阳性对照物含SEQ IDNo.20所示的核苷酸序列、GPIIIa基因T1565C突变型阳性对照物含SEQ ID No.21所示的核苷酸序列；核苷酸序列具体见表1中所示。

进一步，为了对实时荧光PCR反应体系和实验操作过程进行质控，同时检测样本的质量，避免漏检，本发明设有内部质控，选用IL6基因作为内参基因，碱基序列为NCBI数据库中基因序列编号为NCBI数据库中基因序列编号为NT_007819.18第3147到3447位。针对这段序列设计的内部控制引物和内控探针，并对内控的上下游引物进行筛选，使非模版体系(NTC)没有明显的扩增曲线(不起线)，样本由明显的扩增曲线(起线)正常。并对上述的三对基因的引物对、探针及各自扩增产物均不能产生交叉反应，通过对内部质控的质控引物对、质控探针的筛选和体系优化，建立了实时荧光PCR内部质控检测体系，最后确定，质控引物对(IL6-F、IL6-R)核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示，质控探针(IL6-P)的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，具体见表1。

作为内部质控的质控引物对进行PCR扩增时，其扩增序列的大小为87bp，将该扩增序列作为内部质控阳性对照物，即包含如SEQ ID No.22所示序列，作为验证是否漏检的阳性对照。

表1本申请中引物探针及阳性对照物的序列

实施例2采用实时荧光PCR检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的方法

将实施例1筛选设计各基因的野生型上游引物、突变型上游引物、公用下游引物和公用检测探针进行合成，在检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团，其中，荧光基团可为FAM、JOE、CY3、HEX中任意一种，淬灭基团可为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

采用实时荧光PCR检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的方法。具体步骤如下：

(1)获得待测样品的DNA；

(2)应用设计的检测引物及检测探针，对待测样本的DNA中对COX-1、COX-2和GPIIIa基因的A842G、G-765C、T1565C位点多态性进行实时荧光PCR扩增检测，采用COX-1、COX-2和GPIIIa基因的野生型反应体系和突变型反应体系，均用40μL反应体系，PCR反应体系中组分如下：

10×PCR缓冲液：5～10μL

MgCl₂：2.0～5.0mmol

dNTP：0.2～0.8mmol

各条引物：0.1～1.0μmol

各条探针：0.1～1.0μmol

Fast master premix：5～10μL

样品DNA模板：10μL

其余用超纯水补足总体积：40μL。

实时荧光PCR扩增反应条件优选为：

第一阶段：95℃5min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第三阶段:95℃5s，58℃30s，72℃30s，30个循环；

第三阶段:30个循环中，72℃时收集荧光信号。

(3)收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品的所述COX-1、COX-2和GPIIIa基因的野生型反应体系和突变型反应体系的荧光信号，达到设定阈值所需的循环次数Ct值的差值ΔCt值来确定样本中含COX-1、COX-2和GPIIIa基因的基因型。

将各基因位点的野生型阳性对照物和突变型阳性对照物分别进行上述各基因野生型反应体系和突变型反应体系的实时荧光PCR扩增反应，结果显示，所设计的各基因检测引物及反应体系可有效扩增出其对应基因的野生型和突变型。

经过多次样品的检测，最后确定可根据如下判断样本的各基因的类型：ΔCt＝|野生型Ct值-突变型Ct值|≤2.5为杂合型样本；

ΔCt＝野生型Ct值-突变型Ct值>2.5为突变型样本；

ΔCt＝突变型Ct值-野生型Ct值>2.5为野生型样本。

对样品进行检测时，为避免漏检，如避免有的反应体系中未加检测样本的情况出现，在每个反应体系中均设置有内部质控，即将质控引物对和质控探针都加入上述各反应体系中，其质控引物对和质控探针具体序列如实施例1中所述。应当注意的是公用检测探针与质控探针荧光基团标记为不同检测模式的荧光基团。具体的实时荧光PCR扩增反应体系组成按上述PCR反应液组分配置。对于人血液样品或咽拭子样品的DNA检测时，质控探针的信号应有明显的扩增曲线，检测结果可靠，如果没有明显的扩增曲线，说明检加提取的检测样品，

在探针合成时，探针与荧光基团和淬灭基团相连，检测探针的荧光-淬灭基团为优选为FAM-MGB，质控探针的荧光-淬灭基团优选为JOE-BHQ1，当然，其它荧光-淬灭基团组合也同样适用，比如，HEX-BHQ1、HEX-TAMRA、FAM-TAMRA、FAM-BHQ1、CY3-BHQ1、CY3-BHQ2等，检测时选择相应的荧光检测模式。

本发明建立的方法中可用于每个反应体系检测单个检测一种基因，即当三种检测探针都标记为FAM-MGB时，应分别配置各个基因的反应体系，即COX-1基因A842G野生型反应体系中对应有COX-1基因A842G野生型引物对和COX-1基因A842G检测探针，COX-1基因A842G突变型反应体系中对应有COX-1基因A842G突变型引物对和COX-1基因A842G检测探针，其他两组基因以此类推。

本发明建立的方法中可用于每个反应体系检测同时检测三种基因，但是这三种基因的检测探针标记均不同的荧光基因与淬灭基团，即COX-1基因A842G检测探针、COX-2基因G-765C检测探针、GPIIIa基因T1565C检测探针应分别标记FAM-MGB、CY3-BHQ2、HEX-TAMRA，配置反应体系时，应将野生型反应体系中可同时加入三种基因的野生型引物和三种基因的检测探针，在突变型反应体系中同时加入三种基因的突变型引物和三种基因的检测探针，检测时，根据荧光信号的不同来判断各自基因的基因型，这种检测方法加样简单，配置反应体系只需配置2中体系野生型和突变性即可，加样品时，只要将样本分别加入这两个体系即可进行检测。

为了避免假阴性及漏检，检测方法中还设有野生型反应体系、突变性反应体系和内部质控的阳性对照(STD)，其阳性对照检测呈阳性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阴性结果及漏检；为了避免假阳性及漏检，设有检测引物和内部质控的阴性对照(NTC)，其阴性对照检测呈阴性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阳性结果及漏检；否则，应重新进行反应体系的配置及检测。阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准。

上述实时荧光PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪(例如MX4000，MX3000，MX3005)。

实施例3用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的试剂盒

用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的实时荧光PCR试剂盒包括以下成分：

COX-1基因A842G野生型引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示；

COX-1基因A842G突变型引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

COX-1基因A842G检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

COX-2基因G-765C野生型引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示；

COX-2基因G-765C突变型引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.6，下游引物SEQ IDNO.7所示；

COX-2基因G-765C检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

GPIIIa基因T1565C野生型引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示；

GPIIIa基因T1565C突变型引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.10，和SEQ ID NO.11所示；

GPIIIa基因T1565C检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

各自的检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；

COX-1基因A842G野生型阳性对照物：含有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；

COX-1基因A842G突变型阳性对照物：含有如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列；

COX-2基因G-765C野生型阳性对照物：含有如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；

COX-2基因G-765C突变型阳性对照物：含有如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列；

GPIIIa基因T1565C野生型阳性对照物：含有如SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；

GPIIIa基因T1565C突变型阳性对照物：含有如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列。

为了避免漏检，错检，还包括：作为内部质控的质控引物对、质控探针和质控阳性对照物，

其中，质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，该质控探针的5＇端连接有不同于检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于检测探针的淬灭基团，质控阳性对照物含有如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列。

为了防止反应体系在PCR扩增过程中挥发，影响检测效果，试剂盒还包括有矿物油。

为了便于反应体系的配置，试剂盒还包括10×PCR缓冲液；DNA聚合酶，阴性对照物：超纯水。其中DNA聚合酶可采用Fast master premix，采用ABI(美国应用生物系统公司)；10×PCRbuffer(Mg²⁺Plus)采用TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司，也可应用市场上其他公司的PCR缓冲液与DNA聚合酶。

实施例4快速检测试剂盒的制备

本实施例的试剂盒是在实施例3的基础上，制备成可以直接加入检测样品后，进行检测的试剂盒。该试剂盒有检测COX-1、COX-2、GPIIIa基因各自野生型和突变型体系的8联PCR反应条以及验证试剂盒性能分析时所需COX-1、COX-2、GPIIIa三个基因的野生型质粒、突变型质粒及内控质粒，各成分如表2所示，具体反应体系的配置见表3。其中，各基因的检测探针的5＇端连接FAM，3＇端连接MGB，则检测样本信号类型为FAM信号；内部质控的质控探针5＇端连接JOE，3＇端连接BHQ1，内部质控信号类型为JOE信号(内控作为对试剂盒、DNA质量以及操作本身的质控)；检测引物、探针可阳性对照物委托上海英骏生物技术有限公司合成。

表2试剂盒组成

表3反应体系的配置

最后配置的各反应体系进行存放时，防止试剂盒放置时或进行PCR扩展时，反应体系液体的挥发，在各反应体系中均加入20μL矿物油，冷冻保存。

其中，AB premix全称为Fast master premix，购自ABI(美国应用生物系统公司)；10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司，经过大量试验、验证该试剂盒为一种高灵敏、高特异性、高效的检测的检测试剂盒。

实施例5：实时荧光PCR法扩增临床样本DNA

一、临床样本DNA的提取

(1)、EDTA抗凝血样品

本实施例是从EDTA抗凝血样品(来自武汉大学中南医院)中提取基因组DNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用天根的血液基因组DNA提取试剂盒，具体操作见该DNA提取试剂盒说明书，最后，将提取的EDTA抗凝血样品DNA用紫外分光光度计进行定量，稀释DNA浓度到1ng/μL。

(2)、口腔拭子样本

本实施例是从口腔拭子(来自武汉大学中南医院)中提取基因组DNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用康为世纪的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒，具体操作详该DNA提取试剂盒说明书，最后，将提取的口腔拭子DNA用紫外分光光度计进行定量，稀释DNA浓度到1ng/μL。

二、检测

本实施例为采用实施例4制备的试剂盒、上述方法提取的DNA样品，进行实时荧光PCR扩增。

检测方法如下：

1)每次PCR反应中，同时进行非模板对照(No Template Control；NTC)、阳性对照和待测样本的检测，具体见实施例3中所述；

2)将阳性对照物取出解冻后震荡混匀，并离心30s；

3)将实施例4制备的8联PCR反应条取出解冻后离心30s，防止反应液在开盖时溅出；

4)将ddH₂O(NTC)、实施例6中提取的DNA样本、阳性对照物分别加入8联PCR反应条，每孔10μL；

5)将以上8联PCR反应条盖好管盖于离心机上离心30S，确保管壁上不沾有液滴；

6)将8联PCR反应条放于实时荧光PCR仪器中，按如下程序设定：

第一阶段：95℃5min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第三阶段:95℃5s，58℃30s，72℃30s，30个循环；

第三阶段:30个循环时，收集FAM和JOE信号。

本发明是利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过反应体系的突变型和野生型FAM信号的荧光强度差异来判断检测结果；JOE是内控信号，用于检测体系是否正常，样本是否漏加及初步判断样本DNA量是否在允许范围内，JOE信号应达到设定阈值(Ct值小于25)；FAM是检测信号，用于检测样本的基因多态性；在内控信号达到要求后，以每个SNP位点的突变型和野生型FAM信号达到设定阈值所需的循环次数Ct值的差值作为判断标准。选择1、2号管，根据FAM信号ΔCt值判断检测样本COX-1 842的基因A842G位点的多态性；选择3、4号管，根据FAM信号ΔCt值判断检测样本COX-2-765的基因G-765C位点的多态性；选择5、6号管，根据野生型和突变型FAM信号ΔCt值判断检测样本GPIIIA1565的基因T1565C位点的多态性。判断标准是ΔCt＝|野生型Ct值-突变型Ct值|≤2.5为杂合型样本，ΔCt＝野生型Ct值-突变型Ct值>2.5为突变型样本，ΔCt＝突变型Ct值-野生型Ct值>2.5为野生型样本，样本结果判定具体见表4。

表4各基因多态性检测结果判定

对来自武汉大学中南医院10人(一个人同时取血液和口腔两种不同类型的样本)的10个EDTA抗凝血样品(编号为XY01-XY10)和10个口腔拭子(编号为KQ01-KQ10)的检测结果见表5，其中，例举两个样本各基因多态性的扩增图作为代表，EDTA抗凝的全血提取的基因组DNA样本(编号XY04)的扩增曲线，如图1为COX-1基因A842G位点为AA即纯野生型；如图2为COX-2基因G-765C位点为GC即杂合型；如图3为GPIIIa基因T1565C位点为TT及纯野生型；口腔拭子提取的基因组DNA样本(编号KQ 07)的扩增曲线，如图4为COX-1基因A842G位点为AA即杂合型；如图5为COX-2基因G-765C位点为GG即纯野生型；如图6为GPIIIa基因T1565C位点为TC即杂合型。

表5样本检测结果

同时对上述这些样本的DNA进行测序，由武汉艾康健测序公司(采用Sanger金标准)进行测序检测，并将两者的检测能力进行比较，结果见表6。

表6本发明检测结果和Sanger测序金标准比较

表6的结果说明：EDTA抗凝血提取的基因组DNA和口腔拭子提取的基因组DNA用本发明的试剂盒检测的结果和Sanger测序的结果完全一致，说明本发明的试剂盒和检测方法准确度高，适应样本广。

实施例6：对实施例4中制备的试剂盒和实施例5检测的阳性基因组DNA进行灵敏度和特异性实验

1.灵敏度实验

对实施例4中制备的试剂盒进行实验，把实施例5提取的基因组DNA作为模板，分别进行3种浓度梯度为1ng/μL(10ng/反应)、0.1ng/μL(1ng/反应)和0.01ng/μL(0.1ng/反应)在荧光定量PCR仪上进行检测，三种不同浓度的基因组DNA作为模板的进行6个反应体系的检测，检测结果显示，均能准确检出0.01ng/μL的基因组DNA(结果扩增图如图7所示，仅例出一个反应体系的扩增图，其他反应体系的扩增图在此不在赘述)。因此，本试剂盒可以准确检出低至0.01ng/μL的基因组DNA，且对于保存时间过长以及口腔拭子这些提取浓度很低的样本能准确检出。

2.特异性实验

对实施例4中制备的试剂盒进行实验，把实施例5提取的阳性基因组DNA作为模板，分别进行3种浓度为50ng/μL(500ng/反应)、10ng/μL(100ng/反应)和1ng/μL(10ng/反应)在荧光定量PCR仪上进行6个反应系统的检测，结果显示，三种不同浓度的基因组DNA作为模板的检测，均能准确检出(结果扩增图如图8所示，仅例出一个反应体系的扩增图，其他反应体系的扩增图在此不在赘述)，说明当模板量为500ng时，检测结果不会受过高浓度而影响结果的判读。因此，对于高至500ng的基因组DNA样本也能够准确检出。因此，可以减少稀释样本的过程，提取出的样本直接上母液都能准确检测而不会出现结果误判。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉海吉力生物科技有限公司

<120> 用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的核酸、试剂盒及方法

<130>

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

aactgagcac ctactacacg ctgca 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aactgagcac ctactacatg caggg 25

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tcccagaggg tggttgtaag at 22

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttgtgtgcat tccctc 16

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gaggagaatt taccgttccc g 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgaggagaat ttacctgtcc cc 22

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gaaatactgt tctccgtacc ttcacc 26

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ctctctttcc aagaaac 17

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ctgtcttaca ggacctgcca ct 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gtcttacagt ccctgccttc 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

attctggggc acagttatcc t 21

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

acctcgctgt gacctg 16

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

acatgccagc cccacact 18

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gagatcaaga gaggccagac aaa 23

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

agccaagttg ctgcttcctc cctgtg 26

<210> 16

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

aactgagcac ctactacatg ctggacactg caccaggaga tttgtgtgca ttccctcatt 60

gaatcttaca accaccctct ggga 84

<210> 17

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

aactgagcac ctactacatg ctgggcactg caccaggaga tttgtgtgca ttccctcatt 60

gaatcttaca accaccctct ggga 84

<210> 18

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

gaggagaatt tacctttccc gcctctcttt ccaagaaaca aggagggggt gaaggtacgg 60

agaacagtat ttc 73

<210> 19

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

tgaggagaat ttacctttcc cccctctctt tccaagaaac aaggaggggg tgaaggtacg 60

gagaacagta tttc 74

<210> 20

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

ctgtcttaca ggccctgcct ctgggctcac ctcgctgtga cctgaaggag aatctgctga 60

aggataactg tgccccagaa t 81

<210> 21

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

gtcttacagg ccctgcctcc gggctcacct cgctgtgacc tgaaggagaa tctgctgaag 60

gataactgtg ccccagaat 79

<210> 22

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

acatgccagc cccacactgg tggcatagga agccaagttg ctgcttcctc cctgtgcact 60

cccatttgtc tggcctctct tgatctc 87