抗肿瘤功效提高的铂(IV)络合物

摘要

本发明涉及抗肿瘤功效实质上提高的新的铂(IV)络合物。本发明还公开了制备所述络合物的方法和含有所述络合物的用于肿瘤疾病治疗的药物组合物。

说明书

发明领域

本发明涉及抗肿瘤功效实质上提高的新的铂(IV)络合物。本发明还公开了制备所述络合物的方法和含有所述络合物的用于肿瘤疾病治疗的药物组合物。

发明背景

铂(II)络合物(例如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)或奥沙利铂(oxaliplatin))是肿瘤疾病治疗中广泛和长期使用的细胞抑制剂(此后称为CTS)。它们的优势是非常良好的临床经验和良好的抗肿瘤功效。铂CTS的一个大优势是它们通过癌细胞的细胞DNA的直接交联(特别是在鸟嘌呤位点上)杀死已经存在的癌细胞。此外，铂CTS诱导应激激酶活化，导致死亡受体在细胞表面上的表达增加，以及可溶性死亡配体(FAS配体)的转录和翻译增加。这导致外部受体凋亡途径的活化。铂CTS优选地结合鸟嘌呤，其还抑制具有富含鸟嘌呤的频繁序列TTAGGG的端粒。因此，铂CTS的作用令人惊讶地是多能性的，并且它们特别适合于与其他CTS药剂联合治疗癌症，其他CTS药剂包括细胞信号传导途径的靶向抑制剂。铂(II)CTS的缺点源自对癌细胞和健康细胞中的细胞DNA具有相同的作用，这导致了严重的副作用和毒性。由于它们在施用后反应性大且稳定性较差，其也不能口服施用。还描述了在顺铂长期使用后，肿瘤对于顺铂具有获得性耐药性。

铂CTS以及包括靶向抑制剂的其他CTS是生物异源物质，并且它们在施用到身体后被免疫系统和酶系统迅速捕获、破坏和消除。结果，一小部分残余的施用剂量到达靶向的癌组织。因此，铂CTS的稳定性的改善是极其重要的。此外，亲脂性细胞膜从根本上限制了包括铂CTS的任何药物渗透进入细胞，并且只有一部分的残余部分剂量到达细胞内环境。因为铂CTS的DNA交联作用机制需要进入细胞，铂CTS穿过亲脂性细胞膜的能力是极其重要的。一旦该部分的残余部分剂量到达细胞内环境，同时其治疗作用被具有谷胱甘肽的酶系统降低或破坏，然后借助p-糖蛋白通过增加的流出物，将降解的代谢物从细胞移除。因此，铂CTS的疗效及其施用后其降解及从体内消除在一定时间内是动力学竞争变量。

铂(IV)络合物是一类相对新的铂类抗癌药物，其提供不同于铂(II)络合物的更好的稳定性、增加的亲脂性、较低的毒性和口服施用可能性。它们还克服了对顺铂的肿瘤耐药性。通式(I)的铂(IV)络合物具有最受关注的抗肿瘤功效，该铂(IV)络合物具有围绕中心Pt(IV)-离子的配体的顺式、反式、顺式几何构型：

A₁和A₂是保持在铂络合物中的赤道氨基配体。B₁和B₂是轴配体，其在细胞内环境下应被还原成铂(II)物质。C₁和C₂是赤道离去配体，其被水解成反应性水性-铂(II)物质(reactive>

在以下内容和实施方式的实例中，当成对分组按顺序书写时，缩写”c-t-c”用于表示配体的“顺式-反式-顺式”构型，以具体说明围绕中心Pt(IV)-离子的配体的立体化学。关于”c-t-c”铂(IV)络合物的优化结构、它们的抗肿瘤功效以及制备这样的络合物的方法的基本信息描述在例如EP 0328274(Johnson Matthey,Inc.)、EP 0423707(Bristol-Myers Squibb Co.)和US 6,503,943(Lachema,a.s.)中。

之前最有前景的”c-t-c”铂(IV)络合物具有式(II)：

其中R₁是甲基，并且A₂是环己胺(该络合物的商标名为“Satraplatin(赛特铂)”，参见EP>1基团优选在脂族链中含有1至10个碳原子，或在碳环中含有3至7个碳原子(参见EP>

金刚烷是三环(3.3.1.1^3,7)癸烷，其具有独特的高度亲脂性和类似于金刚石的高度对称结构。金刚烷基衍生物被提议用于改善现有技术中的许多化合物(包括药物)的性质，例如Chem.Rev.2013,No.113,3516。即使金刚烷基衍生物提供了极好的用于改善药物稳定性和亲脂性的工具，其在铂(IV)络合物中尚未被完全开发利用。现有技术中仅描述了非常少的具有1-金刚烷基的铂络合物，此外，这些络合物仅含有一个1-金刚烷基。其除了LA-12外是其具有“全反式”配体构型的Pt(IV)类似物(J.Inorg.Biochem.2008,No.102,1077)，以及另外的具有“顺式”构型(Gynecol.Oncol.2006,No.102,32)和“反式”构型(J.Inorg.Biochem.2008,No.102,1077)的1-金刚烷基胺的顺铂的Pt(II)类似物，然而，其抗肿瘤功效低。

具有不同轴羧酸盐配体的B₁和B₂的根据式(I)的”c-t-c”铂(IV)络合物通常通过过量的合适羧酸酐与”c-t-c”Pt(C₁,C₂)(OH)₂(A₁,A₂)中间体反应来制备(例如EP0328274，实施例1至5；J.Med.Chem.1997,40,112)。反应通常在室温下花费几天，收率为23-87％，并且纯度为70-95％。在赛特铂的情况中，需要进一步的纯化，以实现高于98％和约68％的收率(参见CN1557821)。使用活性更强的羧酸氯化物代替其酸酐来降低反应时间是可能的，但是收率仅为14％(参见EP>

因此，对于抗肿瘤功效改善的用于肿瘤疾病治疗的新铂(IV)络合物仍然存在持续的需求。

发明概述

根据本发明的第一方面，提供了式(III)的具有“顺式-反式-顺式”配体构型的铂(IV)络合物：

我们惊讶地发现，由于体积大的中心Pt(IV)-离子，式(II)的铂(IV)络合物中引入多于一个1-金刚烷基是可能的，并且本发明的式(III)的铂(IV)络合物(下文也称为TU-31或“c-t-c”PtCl₂(1-金刚烷基羧酸根基)₂(NH₃,1-金刚烷基胺))在抗肿瘤功效IC₅₀(IC₅₀＝化合物抑制特定生物或生物化学功能的半数最大抑制浓度)方面显著超过了暂时最佳的”c-t-c”Pt(IV)络合物赛特铂和LA-12。不希望受到理论束缚，所述效果能够通过TU-31的实质上提高的亲脂性和稳定性来解释，其通过三个体积大的、高度亲脂性的且对称的1-金刚烷基对中心Pt(IV)-离子的空间保护，导致更好地渗透通过脂质细胞膜和在体内更好的稳定性。我们测试了式(II)的铂(IV)络合物(其中R₁是甲基)的IC₅₀对赤道氨基配体A₂的结构和亲脂性的依赖性，并且我们发现不存在明显的依赖性，但是1-金刚烷基胺作为赤道氨基配体A₂(即LA-12络合物)具有最佳结果。我们还测试了1-金刚烷基胺作为赤道配体A₂的式(II)的铂(IV)络合物的IC₅₀对轴羧酸盐配体中的基团R₁的结构和亲脂性的依赖性，并且我们发现不存在根据现有技术的明显的依赖性，但是令人惊讶的例外是1-金刚烷基作为基团R₁具有最佳结果，这是新的且令人惊讶的认识。我们还发现1-金刚烷基羧酸盐配体本身具有低细胞毒性，并且因此，TU-31还提供了提高的治疗指数。氯化物作为生理学物质被优选作为TU-31中的离去配体。

TU-31不仅具有相对于赛特铂或LA-12的最佳体外IC₅₀结果，还由于实质上提高的亲脂性和稳定性，提供了“体内”抗肿瘤功效的改善。

根据本发明的第二方面，提供了通过“c-t-c”PtCl₂(OH)₂(NH₃,1-金刚烷基胺)与1-金刚烷基碳酰氯和胺在非极性非质子溶剂(优选1,4-二氧六环)中反应来制备式(III)的铂(IV)络合物的方法。优选地，胺是吡啶或三烷基胺。最优选吡啶。

在现有技术中，例如在US 4,604,463实施例2和3(第16栏第25行)所公开的，吡啶成功地用做HCl的清除剂和反应中的溶剂，但是我们惊讶地发现使用吡啶作为溶剂严重阻碍了这一反应的转化，并且优选使用相对于1-金刚烷基-碳酰氯1-2化学计量的吡啶成功地将“c-t-c”PtCl₂(OH)₂(NH₃,1-金刚烷基胺)转化成式(III)的铂(IV)络合物。

在本发明的一个优选实施方案中，用于制备式(III)的铂(IV)络合物的方法是通过‘c-t-c’PtCl₂(OH)₂(NH₃,1-金刚烷基胺)与1-金刚烷基碳酰氯和吡啶在非极性非质子溶剂(优选1,4-二氧六环)中反应来提供，吡啶与1-金刚烷基碳酰氯的化学计量比率或摩尔比率为1至2份吡啶:1份1-金刚烷基碳酰氯，优选比率为2:1，优选比率为1.5:1，最优选比率为1:1。

在现有技术中，使用CH₂Cl₂作为制备另一铂(IV)络合物的溶剂，且使用丙酰氯和三乙胺作为HCl清除剂，但收率仅为14％，参见EP>2Cl₂得到了收率和品质非常好的式(III)的铂(IV)络合物。

在一个优选的实施方案中，本方法进行0.5至6小时，优选1至5小时，优选1至4小时。

本方法优选在19至26℃、优选20至24℃、优选20至22℃、优选室温的温度下进行。

优选地，产物从溶剂中沉淀出来，而相关的杂质保留在溶剂中。

在一个优选的实施方案中，产物例如通过过滤或离心分离，优选通过水和溶剂洗涤，并且优选在升高的温度下在真空下干燥。产物的收率优选高于80％，且纯度高于98％，优选高于98.5％，优选为98.6％。

本发明还涉及通过本发明的方法可获得的、特别是通过该方法获得的式(III)的铂(IV)络合物。

根据本发明的第三方面，提供了用于肿瘤疾病治疗的药物组合物，其含有TU-31和至少一种亲脂性且药学上可接受的添加剂作为粘合剂、载体或表面活性剂。

在本发明的一个优选实施方案中，药物组合物的特征在于TU-31含量为基于所述组合物的总重量的0.5至50重量％，优选1至45重量％，优选5至40重量％，优选10至30重量％。

我们发现，TU-31由于其高亲脂性，与大多数亲脂性且药学上可接受的粘合剂、载体或表面活性剂非常良好地相容。我们还惊讶地发现，TU-31在升高的温度下甚至可溶于亲脂性且药学上可接受的粘合剂、载体或表面活性剂中，优选在约60℃的温度下溶于作为优选表面活性剂的Gelucire 50/13(也称为硬脂酰聚乙二醇-32甘油酯)中。这一热熔融溶液和/或悬浮液在其冷却后形成TU-31在Gelucire 50/13中的固体溶液和/或悬浮液。溶液和/或悬浮液在组合物中的比例依赖于TU-31在Gelucire 50/13中的含量。表面活性剂Gelucire 50/13在口服施用之后防止TU-31受到消化道中(特别是胃中)的亲水性胃液的侵蚀作用。我们证实了TU-31在具有表面活性剂Gelucire 50/13的组合物中在37℃下在0.1N-HCl中在至少1个小时期间内的稳定性。此外，表面活性剂Gelucire 50/13完全或至少部分地将TU-31浸入(emulgate)消化道的外部亲水相中，这增加了口服施用后TU-31在胃肠系统中的生物利用度。所得的包含TU-31和Gelucire 50/13的固体药物组合物能够通过公知的程序分解，然后封装在硬明胶或羟丙基甲基纤维素胶囊中或软明胶胶囊或珠粒(pearl)中。在一个优选的实施方案中，本发明还提供了液体药物组合物，优选TU-31在Gelucire 50/13中的水性乳液。

因此，在本发明的优选实施方案中，提供了包含本发明的式(III)的铂(IV)络合物和硬脂酰聚乙二醇-32甘油酯(Gelucire 50/13)的药物组合物。

可进一步考虑加入惰性固体赋形剂，例如微晶纤维素，以实现组合物所需的物理性质。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物旨在优选地通过口服施用治疗肿瘤疾病，优选恶性肿瘤。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的式(III)的铂络合物和/或本发明的组合物可以以溶液、悬浮液、胶囊、片剂、丸剂等形式配制，优选无菌形式的。

根据本发明的另一方面，提供了的本发明的式(III)的铂(IV)络合物，其用于治疗肿瘤疾病的方法中。

在本发明的另一方面，提供了治疗需要其的受试者的肿瘤疾病的方法，包括以合适的剂量和剂量方案向需要其的患者施用本发明的药物组合物或式(III)的铂(IV)络合物，以获得对肿瘤疾病的有效治疗。

进一步优选的实施方案是从属权利要求的主题。

通过下列的实施方案实施例进一步解释和举例说明本发明，但并不是限制本发明。

实施例1：

合成根据式(II)和(III)的铂(IV)络合物

a)合成关键中间体“c-t-c”PtCl₂(OH)₂(NH₃,烷基胺或环烷基胺或多环烷基胺)

根据专利US 6,503,943实施例2a(第4栏第45行及以下)中描述的一般程序进行合成。

b)合成“c-t-c”PtCl₂(烷基羧酸根基)₂(NH₃,烷基胺或环烷基胺或多环烷基胺)(即根据式(II)的铂(IV)络合物)

根据EP 0328274第4页实施例1至5中描述的一般程序进行合成。

c)合成TU-31(即“c-t-c”PtCl₂(1-金刚烷基羧酸根基)₂(NH₃,1-金刚烷基胺))

在无光下进行合成。将1.0g纯度99％的“c-t-c”PtCl₂(OH)₂(NH₃,1-金刚烷基胺)(2.1mmol)、20ml纯度>99％的1,4-二氧六环、1.05ml纯度>99％的吡啶(12.9mmol)和2.2g纯度>95％的1-金刚烷碳酰氯(10.5mmol)在室温下搅拌3小时。使所得混合物在室温下静置8小时。通过过滤分离沉淀的TU-31，用水和1,4-二氧六环重复洗涤，然后在45℃、真空下干燥。TU-31的产量为1.43g(基于理论值为86％)，纯度为98.6％(通过HPLC检测)。

实施例2:

制备TU-31(即“c-t-c”PtCl₂(1-金刚烷基羧酸根基)₂(NH₃,1-金刚烷基胺))与Gelucire>

将1.0g的TU-31和4.0g的Gelucire 50/13加热至65℃，以产生黄色熔融物。将这一熔融物倾倒入聚丙烯模具中，并在-18℃冷却1小时。然后将固体组合物机械磨碎成颗粒，每个重量为约5mg，并含有20重量％的TU-31。将磨碎的组合物填充到羟丙基甲基纤维素胶囊，剂量为每个胶囊1.0g含200mg活性物质的组合物。

实施例3:

测定制备的铂(IV)络合物的体外细胞毒性IC₅₀

所用化合物的缩写：

DMSO：二甲基亚砜

PBS：磷酸盐缓冲盐水

XTT：2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑-5-羰基苯胺盐

PMS：N-甲基-二苯并吡嗪甲基硫酸盐

FBS：胎牛血清

NEAA：非必需氨基酸

L-glu：L-谷氨酰胺

DMEM：Dulbecco改性Eagle培养基(SigmaAldrich)

PMS：吩嗪硫酸甲酯

测试化合物：

根据表中具体说明的铂(IV)络合物

使用的肿瘤细胞系：

MCF-7乳腺癌

CaCo-2结肠腺癌

HL60早幼粒细胞白血病(HL60promyelotic leukaemia)

A2780/cis卵巢癌顺铂耐药性

LNCaP前列腺癌

COR-L23肺癌

培养条件：37℃，5％CO₂

生长培养基：DMEM，10％FBS，2mM L-glut.，NEAA 100x

工作程序：

刚好在加入到孔中的细胞系之前，将测试化合物溶解在DMSO中，并通过PBS稀释到测试浓度范围。PBS用作阳性对照，最终浓度20％的DMSO用作阴性对照。化合物的所有浓度一式三份测定。每个测定进行两次，并对实验者设盲。测试在96孔板上进行。肿瘤细胞的用量为每孔约2.5x10⁴个细胞，生长培养基的用量为每孔100μl。24小时之后，吸出生长培养基，并向孔加入80μl新鲜的生长培养基和20μl具有不同浓度的测试物质的溶液。72小时之后，吸出培养基，并向孔加入100μl含有XTT和PMS的Optimem试剂的溶液。在另外4小时之后，在450nm测量吸光度(对照在630nm)。根据归一化的细胞活力相对于物质浓度对数绘制的图评价IC₅₀结果。

实施例4：

根据式(II)的铂(IV)络合物的IC₅₀对赤道氨基配体A₂的结构和亲脂性的依赖性研究，其中R₁基团是甲基

根据实施例1制备了根据式(II)的铂(IV)络合物，其中R₁基团是甲基，并且A₂基团是不同的氨基化合物。使用肿瘤细胞系MCF-7(乳腺癌)和CaCo-2(结肠腺癌)。根据实施例3的程序测量IC₅₀。使用市售的顺铂和奥沙利铂作为对照化合物。结果显示在表1中。

表1：根据式(II)的铂(IV)络合物的IC₅₀对赤道氨基配体A₂的结构和亲脂性的依赖性研究，R₁基团是甲基

由表1中结果得出：

1.赤道氨基配体A₂的类型和亲脂性与IC₅₀之间没有明确的关系。

2.根据现有技术的具有1-金刚烷基胺赤道配体的铂(IV)络合物具有最佳结果。

3. 1-金刚烷基骨架到3,5-二甲基-1-金刚烷基骨架的改变导致抗肿瘤功效变差，可能是由于1-金刚烷基对称性变差。1-金刚烷骨架的类似于金刚石的高度对称性在这类铂(IV)络合物中可能是重要的。

4. 1-金刚烷基骨架到2-金刚烷基骨架的改变也导致抗肿瘤功效变差，可能是由于中心Pt(IV)-离子的空间保护变差。

5. 1-金刚烷骨架和中心Pt(IV)-离子之间的距离增加导致抗肿瘤功效变差，可能是由于中心Pt(IV)-离子的空间保护变差。

实施例5：

根据式(II)的铂(IV)络合物的IC₅₀对基团R₁的结构和亲脂性的依赖性研究，赤道氨基配体A₂是1-金刚烷基胺

根据实施例1制备根据式(II)的铂(IV)络合物，其中A₂是1-金刚烷基胺，并且R₁基团是不同的烷基或1-金刚烷基。使用肿瘤细胞系MCF-7(乳腺癌)和CaCo-2(结肠腺癌)。根据实施例3的程序测量IC₅₀。结果显示在表2中。

表2：根据式(II)的铂(IV)络合物的IC₅₀对轴基团R₁的结构和亲脂性的依赖性研究，赤道氨基配体A₂是1-金刚烷基胺

由表2中结果得出：

1.R₁基团的脂族链中碳原子数目之间没有明确的关系。甲基作为R₁的LA-12具有良好的结果，但是在所有的测试脂族链中，根据现有技术的叔丁基作为R₁的铂络合物(参见EP0328274，权利要求1-3)显示出是最佳的。

2. 1-金刚烷基令人惊讶地超过了所有测试基团R₁，包括叔丁基。

实施例6：

TU-31(即式(III)的铂(IV)络合物)与对照铂(II)络合物奥沙利铂和暂时最佳的铂(IV)络合物LA-12对较宽肿瘤细胞系组的IC₅₀比较

测试的肿瘤细胞系组：

MCF-7乳腺癌

CaCo-2结肠腺癌

HL60早幼粒细胞白血病

A2780/cis卵巢癌顺铂耐药性

LNCaP前列腺癌

COR-L23肺癌

表3：TU-31(即式(III)的铂(IV)络合物)与对照铂(II)络合物奥沙利铂和暂时最佳的铂(IV)络合物LA-12对较宽肿瘤细胞系组的IC₅₀比较

由表3中结果得出：

1.TU-31(即根据本发明的铂(IV)络合物)在六个测试癌细胞系的四个中超过了最佳的铂(II)络合物奥沙利铂和暂时最佳的铂(IV)络合物LA-12。

2.奥沙利铂在肿瘤细胞系LNCaP中具有更好的结果，而抗肿瘤功效随着铂络合物亲脂性升高而降低。