一种分子标志物在口腔鳞状细胞癌诊断和治疗中的应用

摘要

本发明公开了一种分子标志物在口腔鳞状细胞癌诊断和治疗中的应用，所述生物标记物为GDPD2，通过qPCR实验发现，GDPD2基因在口腔鳞状细胞癌组织和细胞中表达下调，GDPD2基因过表达可以抑制细胞的增殖和降低癌细胞的侵袭率。本发明提供了GDPD2的促进剂在口腔鳞状细胞癌诊治中的应用，同时本发明还公开了一种抑制细胞增殖的方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种分子标志物在口腔鳞状细胞癌诊断和治疗中的应用，具体的该分子标志物为GDPD2。

背景技术

口腔鳞癌是口腔部位及周边最为常见的恶性肿瘤，其发病率占到口腔部位肿瘤总发病率的80％以上，是值得引起人们高度关注和重视的恶性疾病之一。虽然在欧美等发达国家口腔鳞癌的发病率有所下降，但在全世界范围内发病率仍然呈现上升趋势。近年来随着医疗水平的不断提高，许多恶性肿瘤的治疗方面取得了不小的进步，通过治疗提高了患者的5年生存率。但在口腔鳞癌的治疗方面，由于此疾病的发生早期不易被患者察觉等特殊性，致使该疾病的治疗滞后，癌症晚期的治疗难度加大。因而有必要加大对口腔鳞癌治疗的关注度，寻找出口腔鳞癌的更好的治疗方法。

口腔鳞癌的治疗方面，常规的治疗方法包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、免疫治疗等。这些治疗方法虽然在一定程度上会抑制肿瘤的发生发展，但又存在较大的治疗弊端。例如放疗、化疗会不可避免的引起严重副反应而手术治疗存在操作不易进行等特点，单纯手术治疗无法根治肿瘤等方面的缺陷。免疫治疗的疗效并不明显。而基因治疗和分子靶向治疗为近年来新兴的肿瘤治疗手段，由于其副反应小、疗效确切等方面的优势得到了科研工作者的青睐。

分子靶向治疗是指在细胞分子水平上，调控肿瘤相关基因、干预肿瘤异常的信号通路或阻断能量通路，寻找可干预的分子靶点对口腔鳞癌的靶向治疗具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于口腔鳞状细胞癌诊断和治疗的生物标志物。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了GDPD2基因或其表达产物的用途，用于制备诊断口腔鳞状细胞癌的产品。

进一步，所述产品包括通过通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测GDPD2基因和/或其表达产物的变化。

进一步，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增和基于核酸序列的扩增。

本发明提供了一种诊断口腔鳞状细胞癌的产品，所述产品能够通过检测样本中GDPD2基因基因和/或其表达产物的变化来诊断口腔鳞状细胞癌。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒或制剂。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒或制剂。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测GDPD2基因转录水平的针对GDPD2基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的GDPD2蛋白的特异性抗体或配体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测GDPD2基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括GDPD2蛋白的特异性抗体或配体。

本发明所述的基因芯片或基因检测试剂盒可用于检测包括GDPD2基因在内的多个基因(例如，与口腔鳞状细胞癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白芯片或蛋白免疫检测试剂盒可用于检测包括GDPD2蛋白在内的多个蛋白质(例如与口腔鳞状细胞癌相关的多个蛋白质)的表达水平。将口腔鳞状细胞癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高口腔鳞状细胞癌诊断的准确率。

本发明提供了GDPD2基因在制备治疗口腔鳞状细胞癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括GDPD2基因和/或其表达产物的促进剂。

进一步，所述促进剂包括GDPD2基因表达产物、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物

本发明提供了一种抑制细胞增殖的方法，所述方法为向培养体系中加入GDPD2基因、蛋白或其促进剂。

本发明提供了一种组合药物，所述组合药物包括上述的药物组合物、和含抗肿瘤剂的药物组合物。

进一步，抗肿瘤剂的药物组合物包括但不限于免疫治疗剂如西妥昔单克隆抗体，化学治疗剂或化学放射性治疗剂如卡波铂或者是一种相关类别的铂类药物、紫杉烷或者是一种类别的紫衫烷，或者是两者。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了分子标志物GDPD2与口腔鳞状细胞癌发生发展相关，通过检测受试者GDPD2的变化，可用于口腔鳞癌的诊断。

本发明提供了一种治疗口腔鳞状细胞癌的分子手段，通过改变口腔鳞癌的分子靶标的表达从而干预或者抑制口腔鳞状细胞癌。

附图说明

图1显示利用QPCR检测GDPD2基因在口腔鳞状细胞癌组织中的表达情况；

图2显示利用QPCR检测GDPD2基因在口腔鳞状细胞癌细胞中的表达情况；

图3显示利用QPCR检测GDPD2基因在口腔鳞状细胞癌中的转染情况；

图4显示MTT法检测GDPD2对口腔鳞状细胞癌细胞增殖活性的影响；

图5显示利用transwell小室检测GDPD2基因对口腔鳞状细胞癌细胞侵袭的影响。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次发现了在口腔鳞状细胞癌中GDPD2呈现特异性低表达。实验证明，通过特异提高GDPD2的表达平或表达产物的活性，能够有效地抑制口腔鳞状细胞癌的生长和侵袭，从而达到抑制口腔鳞状细胞癌的效果。在此基础上完成本发明。

GDPD2蛋白是一种甘油磷酸二酯磷酸二酯酶，用于水解甘油磷酸肌醇产生1-磷酸肌醇和甘油。该蛋白在成骨分化和生长中起着重要的作用。

可用于本发明的GDPD2多核苷酸或蛋白(多肽)序列包括各种来源和物种的GDPD2，并且包括野生型、突变型的GDPD2，或其活性片段。在本发明的一些实施方案中，所述GDPD2来源于人类，一种代表性的人GDPD2的编码序列或氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

编码GDPD2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码GDPD2蛋白的多核苷酸。

本发明的人GDPD2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明中术语“生物标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。

本文包含用于检测生物标志物表达的现有技术中任何可用方法。本发明生物标志物的表达可在核酸水平上被检测(如，RNA转录物)或蛋白质水平。通过“检测表达”旨在确定RNA转录物或其生物标志物基因的表达产物的数量或存在。因此，“检测表达”包含一生物标志物被确定不能被表达、不能被检测表达，表达在低水平、表达在正常水平或过表达的实例。为了确定低表达，被检查的所述身体样本能够与相应的来自健康人的身体样本比较。那就是说，所述表达的“正常”水平是生物标志物的表达水平，例如在来自人类主体或未被口腔鳞状细胞癌折磨的病患的宫颈组织样本中的生物标志物表达水平。这个样本可以以标准化形式呈现。在一些实施例中，生物标志物过表达的确定需不比较身体样本和相应来自健康人的身体样本。

本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。

本发明中术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

作为探针，可以使用荧光标记、放射标记、生物素标记等对癌检测用多核苷酸进行了标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。可通过如下方法检查试样中是否存在受试核酸：固定受试核酸或者其扩增物，与标记探针进行杂交，洗涤，以及然后测定与固相结合的标记。备选地，还可固定癌检测用多核苷酸，使受试核酸与其杂交，然后应用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。在这种情况下，结合于固相上的癌检测用多核苷酸也称为探针。使用多核苷酸探针测定受试核酸的方法在本领域也是公知的。可以如下进行该方法：在缓冲液中使多核苷酸探针与受试核酸在Tm或者其附近(优选在±4℃以内)接触用于杂交，洗涤，然后测定杂交的标记探针或者与固相探针结合的模板核酸。

在作为探针使用的多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为20个或更多个核苷酸，以及编码区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。

术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

在本发明中，术语“抗体”是指选择性结合目标抗原的天然或合成抗体。该术语包括多克隆和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子外，那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物以及选择性结合目标抗原的免疫球蛋白分子的人类或人源化形式也包括在术语“抗体”的范围内，只要它们展现出期望的生物学活性即可。“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。

单克隆抗体还包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性即可。

多克隆抗体包含对产生人抗体的动物(例如，小鼠)免疫GDPD2蛋白质而得的抗体。当制备了嵌合抗体或人源化抗体之后，可以将可变区(例如，FR)和/或恒定区中的氨基酸用其他氨基酸替换等。

本发明中的GDPD2促进剂，当在治疗上进行施用(给药)时，可促进GDPD2基因和/或蛋白的表达或活性，从而抑制口腔鳞状细胞癌。在本发明的具体实施方案中，所述GDPD2促进剂包括GDPD2基因表达产物、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。

通常可将这些促进剂配置于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳的pH约为6-8，尽管pH值可随被配置物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配置好的药物组合物可以通过常规途径给药，其中包括但并不限于口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、或通过植入的贮药装置给药。本发明中术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织即可。

本发明中的药物组合物，含有安全有效量的本发明GDPD2蛋白或其促进剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类药物组合物，可以通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制备。活性成分的给药量是治疗的有效量。

本发明的药物组合物可以用于补充内源性的GDPD2蛋白的缺失或不足，通过提高GDPD2蛋白的表达或增强GDPD2蛋白的功能，从而治疗因GDPD2蛋白减少导致的口腔鳞状细胞癌。

本发明的药物还可与其他治疗口腔鳞状细胞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

本发明中术语“治疗”是指以治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症为目的对患者进行的医学管理。该术语包括积极疗法，即专门以改善疾病、病理状态或病症为目的的治疗，并且还包括病因治疗，即以除去相关疾病、病理状态或病症的病因为目的的治疗。此外，该术语还包括姑息治疗，即设计用于缓解症状而非治愈疾病、病理状态或病症的治疗；预防性治疗，即以最大程度降低或者部分或完全抑制相关疾病、病理状态或病症的发展为目的的治疗；以及支持性治疗，即用于补充另一种以改善相关疾病、病理状态或病症为目的的特定疗法的治疗。

本发明中术语“样本”是指从目标患者得到的组合物，其包含细胞和/或其他分子体—将进行特征化和/或识别，例如，根据物理、生化、化学和/或生理特征。例如，短语“临床样本”或“疾病样本”及其变体，是指从目标患者获得的任何样本，将预期或已知所述样本中能够获得细胞和/或分子体，例如将被特征化的生物标志物。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 筛选与口腔鳞状细胞癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集6例周围正常粘膜组织和口腔鳞状细胞癌组织，均经病理学诊断证实，所有患者术前未接受任何形式的治疗。手术切下的样本于液氮中冻存，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备(利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行操作)

取出冻存于液氮中的组织样本，把组织样本放入已预冷的研钵中进行研磨，按照试剂盒中的说明书提取分离RNA。具体如下：

1)加入Trizol，室温放置5min；

2)加入氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5-10min；

3)12000rpm离心15min，将上层水相移到另一新的离心管中(注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质)，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；

4)12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混匀，4℃，12000rpm离心5min；

5)弃去乙醇液体，室温下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；

6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃冰箱。

3、逆转录和标记

用Low RNA Input Linear Amplification Kit将mRNA逆转录成cDNA，同时用Cy3分别标记实验组和对照组。

4、杂交

基因芯片采用Aglient公司的人全基因组表达谱芯片,每张芯片包括45015个寡核苷酸，其中有43376个人基因探针和1639个实验控制探针。按芯片使用说明书的步骤进行，温度在65℃，经17h 10r/min滚动杂交，37℃洗片。

5、数据处理

杂交后芯片用Agilent扫描仪扫描,分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％PMT各扫描1次，2次结果Agilent软件自动合并。扫描图像数据采用Feature Extraction进行处理分析，得到的原始数据应用Bioconductor程序包进行后续数据处理。最后Ratio值为实验组和对照组。差异基因筛选标准：ratio≥4为上调基因，ratio≤0.25为下调基因。

6、结果

与正常粘膜组织相比，GDPD2基因在口腔鳞状细胞癌组织中的表达量显著下调。

实施例2 QPCR测序验证GDPD2基因的差异表达

1、对GDPD2基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择正常粘膜组织和口腔鳞状细胞癌组织各80例。

2、RNA提取 步骤如实施例1所述。

3、逆转录：

1)反应体系：

2)逆转录反应条件

按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中逆转录反应条件进行。

42℃60min，99℃2min，5℃5min。

3)聚合酶链反应

1)引物设计

根据Genebank中GDPD2基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

GDPD2基因：

正向引物为5’-TACCGTATCCACCGAAGA-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-CAAGTAGATGACCAGGACAA-3’(SEQ ID NO.4)。

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)

2)按照表1配制25μl PCR反应体系：

表1 PCR反应体系

3)PCR反应条件：94℃4min，(94℃20s，60℃30s、72℃30s)×30个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，每个样进行3次重复实验。

5、统计学方法

以GAPDH为内参，计算口腔鳞状细胞癌组织与正常粘膜组织荧光定量RT-PCR的实验结果，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，以P<0.05具有统计学差异。

6、结果

如图1所示，与对照组相比，GDPD2基因在口腔鳞状细胞癌组织中表达显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3 GDPD2基因在口腔鳞状细胞癌细胞系中的差异表达

1、细胞培养

口腔鳞状细胞癌细胞系Tca8113、HN13，正常粘膜上皮细胞系HIOEC购自于上海交通大学附属第九人民医院。HIOEC的培养基为K-SFM；Tca8113、HN13的培养基为DMEM；以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、细胞总RNA的提取

1)当细胞达80-90％融合时终止培养，0.25％胰蛋白酶消化收集细胞于1.5m1EP管中，每管中加入lm1Trizol缓慢摇动破碎细胞，冰上放置10min。

2)去蛋白，去DNA：每个1.5m1EP管加入0.2ml三氯甲烷，摇晃15s，室温放置10min。4℃，12000rpm离心15min。

剩余操作步骤同组织中RNA提取过程。

3、逆转录

具体步骤同实施例2.

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2所示，与正常粘膜上皮细胞相比，GDPD2基因在口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113、HN13中表达均下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例4 GDPD2基因的过表达

1、细胞培养

人口腔鳞状细胞癌细胞株Tca8113，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、GDPD2基因的过表达

GDPD2基因过表达载体的构建

根据GDPD2基因的编码序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增引物，引物序列如下：

正向引物：5’-CCGAAGCTTGCCACCATGGACTGGTCCCTGGCATT-3’(SEQ ID NO.7)

反向引物：5’-CGGCTCGAGCTCCATCATGAAATTGTTGATCC-3’(SEQ ID NO.8)

从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的GDPD2基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶HindIII和XhoI双酶切后插入到经限制性内切酶HindIII和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-GDPD2用于后续实验。

3、转染

将口腔鳞状细胞癌细胞分为三组，分别为对照组(Tca8113)、空白对照组(转染pcDNA3.1-NC)、和GDPD2过表达组(转染pcDNA3.1-GDPD2)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-GDPD2的转染浓度均为0.5μg/ml。

4、QPCR检测GDPD2基因的转录水平

4.1细胞总RNA的提取

具体步骤同实施例3。

4.2逆转录 步骤同实施例2。

4.3 QPCR扩增 步骤同实施例2。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，GDPD2基因过表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图3显示，与非转染组与转染空白质粒组相比，转染GDPD2组中过表达GDPD2，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5 MTT法检测Tca8113细胞增殖活性

应用MTT法检测GDPD2基因过表达对Tca8113细胞增殖活性的影响。

1、细胞培养 将Tca8113细胞按1×10³/孔接种于96孔板，每孔100μ1，37℃，5％CO₂孵箱内孵育培养。

2、细胞转染 步骤同实施例3。

3、MTT检测

1)分别于转染1～7天时，弃掉各孔培养基，加入MTT(5mg/ml)20μl。继续常规培养4h。

2)吸去混合液，每孔加入DMSO 200μl，震荡10min使结晶充分溶解。在酶联免疫仪上测490nm处的光吸收值，记录结果。

4、以时间为横轴，光吸收值(OD)为纵轴绘制细胞生长曲线。

5、结果：

结果如图4所示，与对照相比，转染pcDNA3.1-GDPD2组的细胞增殖显著降低。

实施例6 Transwell细胞体外侵袭实验

细胞转染第6天收集不同组别的Tca8113细胞，重悬于培养液中，使细胞终浓度为2×10⁶/ml，吸取100μl细胞悬液加入Transwell小室中。应用Transwell小室方法观察GDPD2基因过表达对Tca8113细胞侵袭性的影响。

1、将Matrigel(4μg/μl)放入4℃融化，准备冰盒(冰浴环境)。Matrigel用DMEM稀释8倍后使用。在Transwell小室滤膜(8μm孔径)的外表面涂8μg人纤粘连蛋白，置超净台内风干。

2、在6孔Transwell小室滤膜的内表面铺以100μ1/孔的Matrigel胶，37℃、5％CO₂孵箱内孵育1h，形成一个基质屏障层备用。

3、在6孔板每孔内加入含20％FBS的DMEM培养液2.5m1。

4、收集对数生长期的细胞，重悬于培养液中，终浓度为2×10⁶/ml。

5、将细胞悬液加入Transwell小室中，每孔100μ1，将小室浸于6孔板的条件培养基中，37℃、5％CO₂孵箱内孵育24h。

6、将Transwell小室取出，滤膜用甲醇固定1分钟。

7、HE染色：苏木精染色3min，水洗；伊红染色10～30s，水洗。并用棉签擦掉未穿过膜的细胞。

8、显微镜下观察、照相并计数侵袭细胞数，每膜计数上下左右中5个不同视野的透过细胞数，计算平均值。每组平行设3个滤膜。

9、数据处理

用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

10、结果

结果如图5所示，Tca8113、pcDNA3.1-GDPD2、pcDNA3.1-GDPD2组细胞在transwell小室中培养24h后，pcDNA3.1-GDPD2组聚碳酸酯膜下室面的细胞数显著减少。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 一种分子标志物在口腔鳞状细胞癌诊断和治疗中的应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atggactggt ccctggcatt cctgctggtc atctctctac tggtcacata tgcatccttg 60

ctattggtcc tggccctgct cctgcggctt tgtagacagc ccctgcatct gcacagcctc 120

cacaaggtgc tgctgctcct cattatgctg cttgtggcgg ctggccttgt gggactggac 180

atccaatggc agcaggagtg gcatagcttg cgtgtgtcac tgcaggccac agccccattc 240

cttcatattg gagcagccgc tggaattgcc ctcctggcct ggcctgtggc tgataccttc 300

taccgtatcc accgaagagg tcccaagatt ctgctactgc tcctattttt tggagttgtc 360

ctggtcatct acttggcccc cctatgcatc tcctcaccct gcatcatgga acccagagac 420

ttaccaccca agcctgggct ggtgggacac cgaggggccc ccatgctggc tcccgagaac 480

accctgatgt ccttgcggaa gacagctgaa tgcggagcta ctgtgtttga gactgatgtg 540

atggtcagct ccgatggggt ccccttcctc atgcatgatg agcacctcag caggaccacg 600

aatgtagcct ctgtattccc aacccgaatc acagcccaca gcagtgactt ctcctggact 660

gaactgaaga gactcaatgc tggatcctgg ttcctagaga ggcgaccctt ctggggggcc 720

aaaccgctgg caggccctga tcagaaagag gctgagagtc agacggtacc agcattagaa 780

gagctattgg aggaagctgc agccctcaac ctttccatca tgttcgactt gcgccgaccc 840

ccacagaacc acacatacta tgacactttt gtgatccaga cattggagac tgtgctgaat 900

gcaagggtgc cccaagccat ggtcttttgg ctaccagatg aagatcgggc taatgtccaa 960

cgacgggcac ctggaatgcg ccagatatat ggacgtcagg gaggcaacag aacggagagg 1020

ccccagtttc ttaacctccc ctatcaagat ctgccactat tggatatcaa ggcattgcat 1080

aaggataatg tctcggtgaa cctatttgta gtgaacaagc cctggctctt ctctctgctt 1140

tggtgtgcag gggtggattc ggtcaccacc aacgactgcc agctgctgca gcagatgcgt 1200

taccctatct ggcttattac ccctcaaacc tacctaatca tatgggtcat taccaattgt 1260

gtttccacca tgctgctttt gtggaccttc ctcctccaaa gaagatttgt taagaagaga 1320

gggaaaactg gcttagaaac agcagtgctg ctgacaagga tcaacaattt catgatggag 1380

tga 1383

<210> 2

<211> 460

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Asp Trp Ser Leu Ala Phe Leu Leu Val Ile Ser Leu Leu Val Thr

1 5 1015

Tyr Ala Ser Leu Leu Leu Val Leu Ala Leu Leu Leu Arg Leu Cys Arg

202530

Gln Pro Leu His Leu His Ser Leu His Lys Val Leu Leu Leu Leu Ile

354045

Met Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Val Gly Leu Asp Ile Gln Trp Gln

505560

Gln Glu Trp His Ser Leu Arg Val Ser Leu Gln Ala Thr Ala Pro Phe

65707580

Leu His Ile Gly Ala Ala Ala Gly Ile Ala Leu Leu Ala Trp Pro Val

859095

Ala Asp Thr Phe Tyr Arg Ile His Arg Arg Gly Pro Lys Ile Leu Leu

100 105 110

Leu Leu Leu Phe Phe Gly Val Val Leu Val Ile Tyr Leu Ala Pro Leu

115 120 125

Cys Ile Ser Ser Pro Cys Ile Met Glu Pro Arg Asp Leu Pro Pro Lys

130 135 140

Pro Gly Leu Val Gly His Arg Gly Ala Pro Met Leu Ala Pro Glu Asn

145 150 155 160

Thr Leu Met Ser Leu Arg Lys Thr Ala Glu Cys Gly Ala Thr Val Phe

165 170 175

Glu Thr Asp Val Met Val Ser Ser Asp Gly Val Pro Phe Leu Met His

180 185 190

Asp Glu His Leu Ser Arg Thr Thr Asn Val Ala Ser Val Phe Pro Thr

195 200 205

Arg Ile Thr Ala His Ser Ser Asp Phe Ser Trp Thr Glu Leu Lys Arg

210 215 220

Leu Asn Ala Gly Ser Trp Phe Leu Glu Arg Arg Pro Phe Trp Gly Ala

225 230 235

Lys Pro Leu Ala Gly Pro Asp Gln Lys Glu Ala Glu Ser Gln Thr Val

245 250 255

Pro Ala Leu Glu Glu Leu Leu Glu Glu Ala Ala Ala Leu Asn Leu Ser

260 265 270

Ile Met Phe Asp Leu Arg Arg Pro Pro Gln Asn His Thr Tyr Tyr Asp

275 280 285

Thr Phe Val Ile Gln Thr Leu Glu Thr Val Leu Asn Ala Arg Val Pro

290 295 300

Gln Ala Met Val Phe Trp Leu Pro Asp Glu Asp Arg Ala Asn Val Gln

305 310 315 320

Arg Arg Ala Pro Gly Met Arg Gln Ile Tyr Gly Arg Gln Gly Gly Asn

325 330 335

Arg Thr Glu Arg Pro Gln Phe Leu Asn Leu Pro Tyr Gln Asp Leu Pro

340 345 350

Leu Leu Asp Ile Lys Ala Leu His Lys Asp Asn Val Ser Val Asn Leu

355 360 365

Phe Val Val Asn Lys Pro Trp Leu Phe Ser Leu Leu Trp Cys Ala Gly

370 375 380

Val Asp Ser Val Thr Thr Asn Asp Cys Gln Leu Leu Gln Gln Met Arg

385 390 395 400

Tyr Pro Ile Trp Leu Ile Thr Pro Gln Thr Tyr Leu Ile Ile Trp Val

405 410 415

Ile Thr Asn Cys Val Ser Thr Met Leu Leu Leu Trp Thr Phe Leu Leu

420 425 430

Gln Arg Arg Phe Val Lys Lys Arg Gly Lys Thr Gly Leu Glu Thr Ala

435 440 445

Val Leu Leu Thr Arg Ile Asn Asn Phe Met Met Glu

450 455 460

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cggctcgagc tccatcatga aattgttgat cc 32