MrgprX2高表达的重组细胞及MrgprX2高表达膜受体固定相及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种MrgprX2高表达的重组细胞及MrgprX2高表达膜受体固定相及制备方法和应用，该重组细胞以HEK293细胞为宿主细胞，转染包含MrgprX2全长基因的表达载体，其细胞膜上能够稳定表达MrgprX2受体大分子，而且具有完整的受体生物活性。该MrgprX2高表达膜受体固定相由活化硅胶吸附MrgprX2高表达的重组细胞的细胞膜制成，可应用于特异性筛选识别由MrgprX2引发的类过敏组分。本发明通过实际应用发现盐酸青藤碱可以特异性与MrgprX2相结合，同时细胞水平的过敏实验表明盐酸青藤碱均可以刺激肥大细胞释放组胺和β氨基己糖苷酶，证实MrgprX2高表达膜受体固定相确实可以应用于特异性识别类过敏组分。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及MrgprX2高表达的重组细胞及基于该重组细胞特异性识别类过敏组分的MrgprX2高表达膜受体固定相及其构建方法和应用。

背景技术

随着中药临床应用的日益增长，中药安全性“事件”时有发生，尤其是中药注射剂的临床安全性问题倍受关注。类过敏反应又称为假过敏反应，是外源刺激物直接刺激肥大细胞，导致其释放组胺类活性递质，类过敏反应一般不由IgE介导，在患者首次用药即可产生。研究证明类过敏刺激物所激活的G蛋白为MRGPRS(MAS-Related G Protein-CoupledReceptors)，而MrgprX2(Mas-related GPR family member X2)主要分布在人肥大细胞表面，且该类受体不依赖IgE，其可能是基础促分泌素的受体，可直接介导肥大细胞活化，诱导肥大细胞脱颗粒。约翰霍普金斯大学研究人员确定MrgprX2受体将是解决药物过敏反应的极其重要的靶点。

细胞膜色谱技术是一种有效的从复杂体系中直接筛选识别目标组分的新技术。目前还没有能够特异性识别类过敏组分MrgprX2高表达膜受体固定相的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种MrgprX2高表达的重组细胞及MrgprX2高表达膜受体固定相及制备方法和应用，以构建的MrgprX2高表达的重组细胞为基础，进一步构建出MrgprX2高表达膜受体固定相，能够用于筛选作用于MrgprX2的类过敏组分。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

一种MrgprX2高表达的重组细胞，所述重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含MrgprX2全长基因的表达载体。

所述MrgprX2全长基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述包含MrgprX2全长基因的表达载体是LV5-MrgprX2homo慢病毒。

基于所述的MrgprX2高表达的重组细胞的MrgprX2高表达膜受体固定相，所述MrgprX2高表达膜受体固定相是由活化硅胶吸附MrgprX2高表达的重组细胞的细胞膜制成的。

所述的MrgprX2高表达膜受体固定相的制备方法，包括以下步骤：

1)制备细胞膜混悬液

将培养好的MrgprX2高表达的重组细胞离心、清洗，然后在冰浴条件下，将MrgprX2高表达的重组细胞超声破碎，通过差速离心除去细胞器，分离出细胞膜，再将细胞膜用生理盐水重悬，制得细胞膜混悬液；

2)制备MrgprX2高表达膜受体固定相

将硅胶活化后置于具支试管中，真空条件下，向具支试管中加入步骤1)制得的细胞膜混悬液，涡旋振荡，然后静置过夜，得到MrgprX2高表达膜受体固定相。

所述的MrgprX2高表达膜受体固定相在筛选以MrgprX2为靶点的类过敏组分方面的应用。

所述MrgprX2高表达膜受体固定相经湿法装柱后制得用于识别作用于MrgprX2的类过敏组分的细胞膜色谱柱，利用该细胞膜色谱柱筛选识别以MrgprX2为靶点的类过敏组分。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明将包含MrgprX2全长基因的表达载体转染入HEK293宿主细胞，并经过筛选，获得了稳定的MrgprX2高表达的重组细胞，记为HEK293-MrgprX2细胞。本发明构建的包含MrgprX2基因全长的重组HEK293-MrgprX2细胞的细胞膜能够稳定的表达MrgprX2分子，最高表达MrgprX2受体量较转染前提高5000倍，而且具有完整的分子活性。

2、作为宿主细胞的HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，该细胞本身含有的各种受体表达量相对较低；而重组后的HEK293-MrgprX2细胞的MrgprX2配体的相对表达量比HEK293明显增高，相对于其他细胞表面分子占据表达优势地位，在结合MrgprX2受体方面处于有利地位；这样就大大提高了筛选以MrgprX2为靶点药物的灵敏性及特异性；同时能为进一步研究MrgprX2生物学特性提供较好的细胞模型。

3、本发明提供的用于特异性识别类过敏组分的MrgprX2高表达膜受体固定相，是在载体活化硅胶中吸附MrgprX2高表达的重组细胞的细胞膜而制成的，具有表达特定MrgprX2的膜受体，MrgprX2受体为能够与类过敏组分特异性结合的受体。在细胞膜色谱柱中填充MrgprX2高表达膜受体固定相可以提高复杂样品中“类过敏组分”筛选的特异性，能够针对复杂样品中的“类过敏组分”进行特异性的识别，提升分析效率，对提高筛选效率、阐明作用机理具有重要的意义。

4、本发明提供的MrgprX2高表达膜受体固定相的制备方法，将MrgprX2高表达的重组细胞的细胞膜分离出来，加入活化硅胶中，使活化硅胶吸附细胞膜，即得到MrgprX2高表达膜受体固定相。该方法工艺简单，操作方便。进一步的，将制得的MrgprX2高表达膜受体固定相湿法装柱后，还可制得用于识别作用于MrgprX2的类过敏组分的细胞膜色谱柱，便于进行复杂样品中类过敏组分的筛选。

5、运用本发明构建的MrgprX2高表达膜受体固定相筛选盐酸青藤碱，发现盐酸青藤碱在MrgprX2高表达膜受体固定相可发生保留，保留时间为35min左右，说明盐酸青藤碱可与MrgprX2结合。通过体外实验发现盐酸青藤碱可以刺激肥大细胞发生脱颗粒反应，释放β氨基己糖苷酶及组胺等过敏介质。因此上述结果表明MrgprX2高表达膜受体固定相可以应用于以MrgprX2为靶点的药物引发类过敏组分的筛选。

附图说明

图1为LV5-MrgprX2 homo慢病毒感染效率图；其中a为NC-HEK293细胞(感染LV5-NC病毒的HEK293细胞)明场图；b为NC-HEK293细胞荧光图；c为MrgprX2-HEK293细胞明场图；d为MrgprX2-HEK293细胞荧光图。

图2为嘌呤霉素筛选的阳性细胞培养图；其中a为MrgprX2-HEK293细胞嘌呤霉素筛选后生长状态图；b为MrgprX2-HEK293细胞嘌呤霉素筛选后阳性细胞生长图；c为NC-HEK293细胞嘌呤霉素筛选后生长状态图；d为NC-HEK293细胞嘌呤霉素筛选后阳性细胞生长图。

图3为mRNA水平MrgprX2表达水平的RT-PCR检测图；

图4为蛋白水平MrgprX2蛋白的Westernblot检测图；

图5为钙成像监测胞内钙流浓度变化图；其中a为A+P作用于HEK293细胞；b为A+P作用于NC-HEK293细胞；c为A+P作用于MrgprX2-HEK293细胞；d为C48/80作用于HEK293细胞；e为C48/80作用于NC-HEK293细胞；f为C48/80作用于MrgprX2-HEK293细胞。

图6为盐酸青藤碱在MrgprX2高表达细胞膜色谱柱上的色谱图；

图7为盐酸青藤碱刺激肥大细胞释放组胺。

图8为盐酸青藤碱刺激肥大细胞释放β氨基己糖苷酶。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明。

本发明在构建MrgprX2全长基因的真核表达载体LV5-MrgprX2慢病毒的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定的MrgprX2高表达的重组细胞，将其记为HEK293-MrgprX2细胞，并以HEK293-MrgprX2细胞为基础制备MrgprX2高表达膜受体固定相。即采用差速离心方法将MrgprX2高表达的重组细胞的细胞膜提取分离，将分离的细胞膜与活化硅胶物理吸附制成MrgprX2高表达膜受体固定相。用装柱机将MrgprX2高表达膜受体固定相进行湿法装柱，即得到用于识别作用于MrgprX2的类过敏组分的细胞膜色谱柱。待MrgprX2细胞膜色谱柱充分平衡后，对待分析的复杂样品进样分析，若有组分在MrgprX2细胞膜上保留，则该组分即为类过敏组分。

下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1.高表达MrgprX2重组细胞的构建：

(1)转导：

1)第一天：

铺板：使用含有MrgprX2基因的慢病毒颗粒(购买于上海吉玛公司)对HEK293细胞进行感染，常规培养HEK293细胞，在24孔板中接种0.5×10⁵个细胞/孔，加入0.5mL完全培养基，保证病毒感染时细胞的融合率达40％-60％，因为Lentivirus的表达时间较长。将细胞板置5％CO₂孵箱中37℃培养过夜，待细胞贴壁。

2)第二天：

a.稀释病毒：准备2个无菌的1.5mL EP管，分别吸入450μL完全培养基，吸取50μL的9×10⁸TU/mL的病毒(预先从-80℃取出在冰上融化)加入到第一个管子中，轻柔混匀，勿产生泡沫，进行10倍稀释，并从第一个管中吸取45μL到第二个管子中，混匀。这样就得到了两个不同梯度的病毒：10倍稀释液，100倍稀释液。计算可知，两个不同浓度病毒的MOI值分别为10和1。

b.添加Polybrene(聚凝胺)：Polybrene可在大部分细胞中有效地提高感染效率，在步骤a所获得的稀释病毒液中分别加入相适应体积的原液浓度为5mg/mL的Polybrene，保证病毒稀释液中Polybrene的终浓度为5μg/mL。

c.感染细胞：移去24孔板中旧的细胞培养液，加入步骤b中的病毒液，同时建立空白对照和阴性对照，将细胞放回培养箱孵育，37℃，5％CO₂过夜。

3)第三天：12-24h后移去细胞侵染后的病毒液，加入0.5mL的完全培养基，37℃，5％CO₂过夜。

4)第四、五天：感染效率检测，感染48-96h后：在倒置荧光显微镜观察绿色荧光表达情况，估计慢病毒感染HEK293细胞的效率，结果如图1所示，可见感染效率较高。

感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定慢病毒对HEK293细胞的感染情况。感染期间根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液，如有需要，可以消化细胞，分出1/3-1/5，加入0.5mL的完全培养基，继续培养24-48h，以保证细胞良好的生长状态。

(2)Puromycin(嘌呤霉素)筛选：

1)确定最优筛选浓度

a.取对数生长期的HEK293细胞(一般在铺满培养器皿底部的70％～80％时)，用新鲜完全培养基DMEM制成1.5×10⁵个/mL的细胞悬液。向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100μL(使每孔细胞数在1.5×10⁴个)，然后向每孔加新鲜DMEM培养基适量，培养箱中静置培养过夜。

b.第二天将浓度为8mg/mL的嘌呤霉素储备液用DMEM培养基分别稀释为0.25-2.5μg/mL间共13个浓度梯度的药液，分别按分组替换各孔中的旧的培养基。

c.每日检查细胞活力，由于HEK293细胞生长过快，每隔一天更换一次含有嘌呤霉素的培养基。

d.观察培养2-3天后，能够导致所有细胞死亡的嘌呤霉素的最小浓度便作为最优筛选浓度，其用于筛选感染后的细胞。

2)Puromycin筛选感染后细胞。

a.病毒感染后48h后，便可换用含最优浓度puromycin的培养基来筛选NC-HEK293细胞和MrgprX2-HEK293细胞，同时设立一个HEK293细胞对照皿，加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。

b.每隔一天换用含puromycin的培养基，以替换含大量死细胞的培养基，直到抗性群落能被识别出。结果见图2，可见用嘌呤霉素筛选后，感染病毒LV5-MrgprX2的HEK293细胞大部分出现皱缩，死亡现象，但有少量细胞仍然处于贴壁生长，如图2a所示，所获得的具有嘌呤霉素抗性基因的阳性MrgprX2-HEK293细胞，如图2b所示。感染病毒LV5-NC的HEK293细胞的用嘌呤霉素筛选后的生长状态见图2c所示。

c.待抗性细胞长满后，转入10cm培养皿，收获细胞，在mRNA或蛋白水平鉴定基因表达情况。同时留存细胞进行传代培养，待鉴定成功后冻存，以用于后续实验。

2.RT-PCR检测MrgprX2在所得细胞中转录水平的表达情况。

(1)总RNA的提取：

采用Trizol试剂提取未感染的HEK293细胞、感染NC病毒、MrgprX2病毒的HEK293细胞的总RNA。

1)吸尽培养基，用PBS轻轻洗一次，吸掉PBS。按10cm大培养皿加3mL Trizol，晃动3-5下，再用枪吹打多下，直至枪尖提起时不再有丝状物，确保全部裂解后(不再呈粘稠状)，吸至1.5mL离心管中，涡旋或剧烈震荡一下。

2)室温静置5-15分钟。于4℃，12000rpm离心10min，取上清，按照每毫升Trizol加入0.2mL氯仿，Vortex混合或猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。

3)于4℃，12000rpm离心15min，小心吸取含总RNA的上层水相至一新的1.5mL离心管中，每毫升Trizol约可吸取0.4-0.5mL，每管加入与上清等体积的异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟或4℃放置2小时。

4)于4℃，12000rpm离心15min，在管底可见胶状RNA沉淀，弃上清，每管用0.8mL75％酒精洗两次(上下晃动，均匀离心去上清，75000rpm，5min，4℃)，无水乙醇洗一次，再用离心机甩一下(﹥5000rpm，离心1秒)，用小枪头小心吸尽液体，不要碰到RNA沉淀。

5)真空抽干或自然晾干3-5分钟，待RNA略干后，加入DEPC处理过的去离子水20μL溶解沉淀，于-80℃冻存。

6)琼脂糖凝胶电泳:称取0.3g琼脂糖粉末，溶解于30mL TEA缓冲液中，微波条件下中火2分钟加热，待温度降至50-60℃时，用枪向溶液中加入2μL EB摇晃均匀，迅速倒入制胶槽中插入制孔梳制孔，待胶凝固后将胶浸入电泳槽内的电泳缓冲液内，按RNA:6×LoadingBuffer:DEPC水＝1:1:4的比例在封口膜上混合，用枪吸取混合液加入到上样孔中，恒压(电流调至最大值)120V的条件下进行电泳，电泳开始不超过15-20分钟后将凝胶取出，将凝胶放置在凝胶成像仪下，开启紫外光进行检视。理想的提取的RNA经过凝胶分离后的条带中28S的亮度应为18S的两倍，且不出现5S条带。若提取的RNA符合上述原则，则为所提取的RNA质量较好，可进行后续的逆转录操作。

7)采用NanoDrop ND-1000型紫外/可见分光光度计测定RNA纯度和含量。

(2)逆转录RNA为cDNA

采用Takara公司的PrimeScrip^TMRT>

1)去除基因组DNA反应：

冰上配制反应混合液，为保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Maste Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。10μL反应体系配制如下，可根据需要相应扩大。

配好反应体系后，手指轻弹EP管底部，离心10秒，放入PCR仪中，设置反应程序：42℃2min(或者室温5min^*2)，4℃∞。

试剂使用量5×gDNA Eraser Buffer2.0μLgDNA Eraser1.0μLToal RNA*1RNase Free dH₂Oup to 10μL

*1:20μL反转录反应体系中，SYBR Green qPCR法中最多可使用1μg的Toal RNA。

*2：室温反应时，可以延长至30分钟。

2)逆转录反应：

采用<SYBR Green qPCR法>于冰上配制反应液，按反应数+2的量配制Maste Mix，然后再分装200μL反应管中^*3，轻柔混合后立即进行逆转录反应。

配好反应体系后，手指轻弹EP管底部，离心10秒，放入PCR仪中，设置反应程序：37℃15min；85℃5sec；4℃∞。合成的cDNA于-20℃或更低温度保存。

试剂使用量步骤1)的反应液10.0μLPrimeScript Enzyme Mix Ⅰ1.0μLRT Primer Mix1.0μL5×PrimeScript Buffer 2(for real time)4.0μLRNase Free dH₂O4.0μLToal20μL

*3：如不配制Master Mix，向步骤1的反应液中添加试剂时，要先加入RNase FreedH₂O和5×PrimeScript>

3)Real Time PCR扩增：

选择Takara公司的SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒，应用Thermal Cycler Dice Real Time System扩增仪，利用第一链cDNA作为模板，用特定引物进行扩增，采用25μL的反应体系，具体方法如下：

a.根据目的基因MrgprX2的序列，设计引物如下：

上游：5'CAGGACATTGCTGAGGTGGA 3'

下游：5'AGTTCAGCAAATCAGACAGACAGG 3'

引物由Takara公司合成，目的片段为可以代表MrgprX2表达丰度的长993bp的MrgprX2基因片段。

b.引物加水溶解备用。

c.冰上配制PCR反应体系，组成如下：

试剂使用量终浓度SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)12.5μL1×PCR Forward Primer(20μM)0.5μL0.4μMPCR Reverse Primer(20μM)0.5μL0.4μMRT反应液(cDNA溶液)2.0μLdH₂O(灭菌蒸馏水)9.5μLToal25μL

d.经PCR扩增后得到各细胞在转录水平的表达结果，见图3，可见MrgprX2-HEK293细胞中MrgprX2基因在mRNA水平的表达量与HEK293细胞和NC-HEK293细胞相比有了显著的提高。

3.Western blot检测MrgprX2的表达量。

4℃条件下，将未感染的HEK293细胞、嘌呤霉素筛选后扩大培养的具有抗性的MrgprX2-HEK293细胞、NC-HEK293细胞用RIPA裂解液裂解，超声破碎仪破碎，提取细胞总蛋白，并用BCA法测定蛋白含量。所提蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗和用ECL化学发光检测蛋白表达，检测MrgprX2蛋白的表达。结果如图4所示，泳道1所示的HEK293细胞的MrgprX2表达量明显低于泳道2所示的重组MrgprX2-HEK293细胞。从Westernblot的结果得出，MrgprX2-HEK293细胞中重组表达的MrgprX2表达量显著提高。

4.钙成像技术监测各种细胞内游离Ca²⁺浓度变化。

(1)相关液体的配制：

1)试剂母液的配制：

a.多聚赖氨酸：用无菌三蒸水溶解多聚赖氨酸粉末配制成0.1mg/mL，即0.01％的多聚赖氨酸工作液，现用现配，或4℃保存最多一两周。

b.Fluo-3(规格100ug)加入17.7μL DMSO溶解。

c.F-127取5mg加入44.2μL DMSO溶解，于-20℃避光保存。

d.CIB:分别按照NaCl 125mM,KCl 3mM,CaCl₂>2>3>

2)所用药品的配制：

根据所设定的浓度，将溶解于DMSO的阳性药C48/80的母液加入相应体积的CIB中，稀释到阳性药的作用浓度。

3)孵育液的配制：

HEK293细胞为贴壁细胞，其孵育液为：0.7μL Fluo-3+4μL F-127+995.3μL CIB。孵育液要现配现用。

(2)实验步骤：

1)多聚赖氨酸包被细胞板：HEK293细胞虽为贴壁细胞，但其贴壁不牢，极易用胰酶消化，所以接种前一天需用多聚赖氨酸包被96孔板，具体处理为：于96孔板每孔加入多聚赖氨酸工作液100μL，包被过夜，第二天用无菌三蒸水洗2-3次，PBS洗1次以起平衡盐作用，注意洗液的量大于包被液的量，超净台紫外照射半小时，并风干。

2)接种细胞：用胰酶消化HEK293、NC-HEK293、MrgprX2-HEK293细胞，按约5×10³个/孔接入96孔板，放入培养箱，37℃，5％CO₂过夜，待细胞贴紧。

3)孵育：吸弃培养基，每孔加入加热至37℃的CIB 100μL清洗1遍；吸弃CIB，在避光条件下加入孵育液100μL，置于培养箱中孵育40min。

4)荧光显微镜下监测：吸弃孵育液，每孔加入CIB清洗1遍后弃上清，再次加入CIB100μL，于荧光显微镜蓝光下，按细胞分组每孔依次吸弃CIB后加入阳性药C48/80 200μL，并立即拍照，曝光时间为1s，每秒拍一张，拍照时间为3min。监测结果如图5所示。

通过对HEK293、NC-HEK293细胞和MrgprX2-HEK293细胞用A23187和PMA同时刺激，得到的细胞内钙流变化分别如图5a、b、c所示，可见胞内钙离子增加。通过用阳性药C48/80分别刺激HEK293、NC-HEK293细胞和MrgprX2-HEK293细胞，结果分别如图5d、e、f所示，可见，HEK293、NC-HEK293细胞的荧光强度没有变化，而MrgprX2-HEK293细胞的荧光强度有了明显的提高，即MrgprX2-HEK293细胞胞内钙离子浓度明显提高，说明MrgprX2-HEK293细胞内的MrgprX2受体与胞内钙离子浓度增大有关。至此证实MrgprX2-HEK293细胞构建成功。

5.MrgprX2高表达膜受体固定相的制备

(1)MrgprX2高表达膜受体固定相的制备

选取对数生长期的HEK293-MrgprX2细胞，应用0.25％胰蛋白酶将贴壁生长的HEK293-MrgprX2细胞消化下来，置于离心管中，于4℃条件下1000g离心10min，去除上清的培养液，沉淀细胞，加入生理盐水重新混悬后于4℃条件下1000g离心10min，洗去细胞表面残留的培养基，生理盐水清洗过程重复2次。之后向细胞中加入5mL 50mM的Tris-HCl溶液，置于细胞超声破碎仪。将细胞膜和细胞器的混悬液于1000g 4℃条件下离心10min，此时取离心管中上清液于12000g 4℃条件下离心10min，沉淀即为细胞膜，沉淀用生理盐水重悬，并再次于12000g 4℃条件下离心20min，将得到的细胞膜清洗1次。最后将得到的细胞膜沉淀用5mL的生理盐水混悬，并将细胞膜悬液在真空条件下加入到0.05g已预先活化的大孔硅胶内，置于磁力搅拌器上于4℃条件搅拌30min，保证细胞膜与硅胶充分混匀后静置过夜，利用物理吸附作用使细胞膜与大孔硅胶充分结合，得到MrgprX2高表达膜受体固定相。

(2)MrgprX2高表达膜受体色谱模型筛选

1)细胞膜固定相制备

将细胞悬液于4℃条件下5000rpm离心10min，去除上清的培养液，沉淀即为细胞，加入生理盐水重新混悬后于上述条件离心，生理盐水清洗过程重复2次。向得到的细胞中加入5mL预冷的Tris-HCl溶液，置于超声仪内冰浴超声30min破碎细胞，以保证细胞膜的活性。同时称取0.02g硅胶于具支试管中，置于105℃烘箱中活化30min。超声破碎细胞后，用细胞破碎仪再次破碎，程序为工作3s，间歇1s，6次。于4℃条件下1500g离心10min，吸取上清液于另外一只离心管中，4℃条件下12000g离心10min，得到沉淀即为细胞膜，沉淀用生理盐水重悬，并再次于4℃条件下12000g离心10min，将得到的细胞膜清洗一次。沉淀用5mL的生理盐水混悬，吸入5ml注射器中，于真空涡旋震荡条件下与已经活化的硅胶混匀，置于磁力搅拌器上于4℃条件搅拌30min，静置过夜，得到细胞膜固定相悬液。

2)CMC柱的制备

次日，将细胞膜固定相悬液涡旋混匀，转移至10mL离心管中，4℃条件下2000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入约5mL生理盐水涡旋混匀，重复上述操作2次，去除多余的未包裹在硅胶上的细胞膜，向沉淀中加入约5mL生理盐水涡旋混匀，倒入事先已经冲洗过的装柱机中，流动相为水，流速为2.0mL/min，装柱时的压力不超过10MPa，装柱时间5min，即可将细胞膜固定相装入柱芯中，将装填好的细胞膜色谱柱装入液相色谱仪中使用。

(3)色谱条件

岛津LC-20A高效液相色谱仪(岛津，日本)，包含DGU-20A3在线脱气机，LC-20AB液相色谱泵，SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，SPD-M20A自动进样器，Shimadzu LCLabsolution软件。

细胞膜色谱条件1：超纯水为流动相，流速0.2mL/min，PDA检测器检测。

细胞膜色谱条件2：流动相：50mmol/L PBS；流速：0.2mL/min；柱温箱：37℃；PDA检测。

6.盐酸青藤碱的过敏介质释放试验

(1)肥大细胞和嗜碱性粒细胞的高尔基体内的组氨酸经组氨酸脱羧酶作用，脱去羧基后形成的具有血管活性的胺类物质，组胺一般储存在人的肺部和皮肤组织中，每个细胞的组胺含量相似，一般为2～5个pg，其主要是通过与靶细胞表面的组胺受体结合引起气道平滑肌收缩、血管扩张等过敏反应。

首先以标准品浓度作为X轴，相应的吸光度值作为Y轴，进行Logit-Log直线拟合，得到以下曲线方程。

p＝OD/OD0，q＝1-p，

y＝ln(p/q)，x＝lg(浓度)，

其中:OD为反应值，OD0为浓度为0的反应值的均值，则方程为：

y＝a+b*x

表1-1组胺对照品溶液浓度和对应的吸光度值

其中a＝4.69239，b＝-3.36197，r^2＝0.84483。

表1-2组胺标准曲线拟合值

求得残差平方和为1.93324。

将待测样品的吸光度值带入方程，求得相应的组胺浓度。

(2)β-氨基己糖苷酶为肥大细胞激活脱颗粒标志物，检测盐酸青藤碱诱导的β-氨基己糖酶的释放评价肥大细胞激活效应。以盐酸青藤碱浓度为横坐标，β-氨基己糖苷酶释放率为纵坐标，描述随着盐酸青藤碱浓度的增大β-氨基己糖苷酶释放率的变化；以C48/80作为阳性对照，缓冲液做阴性对照。

1)接种细胞：将对数生长期的LAD2细胞，用0.25％胰蛋白酶溶液消化制成单细胞悬液，细胞计数后，以一定密度接种于96孔板中(5×10⁴个/孔)，细胞悬液体积为150μL/孔。每组设4个平行孔，于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

2)加药：培养24h，待细胞贴壁后，用新鲜的培养基稀释盐酸青藤碱并充分混合均匀，用新鲜的培养基10倍稀释30mg/mL的Compound48/80作为阳性药。吸弃各孔培养基，每孔依次加入药物溶液和阳性药液100μL，阴性对照组加入等体积新鲜培养基，37℃培养30min。

3)取上清检测：吸取上清4℃下2000g离心10min，用0.1％的Trition X-100裂解液裂解阴性对照组细胞5min，取裂解液4℃下2000g离心10min。在干净的96孔板中加入1mmol/Lβ-氨基己糖50μL作为反应底物，再加入50μL各药物浓度的细胞上清液和阴性对照组细胞的裂解液，充分混合，37℃培养箱孵育1h，然后加入150μL 0.1mol/L的碳酸钠/碳酸氢钠终止液终止反应，在酶联免疫检测仪上选择405nm的波长测定各孔的吸光度值，记录结果，根据公式计算各浓度的释放率。公式如下：

β-氨基己糖苷酶释放率(％)＝给药组细胞上清的吸光度/(阴性组细胞上清的吸光度+阴性组细胞裂解液的吸光度)×100％。

如图6所示，运用本发明构建的MrgprX2高表达膜受体固定相筛选盐酸青藤碱，发现盐酸青藤碱在MrgprX2高表达膜受体固定相可发生保留，保留时间为35min左右，说明盐酸青藤碱可与MrgprX2结合。如图7和图8所示，通过体外实验发现盐酸青藤碱可以刺激肥大细胞发生脱颗粒反应，释放β氨基己糖苷酶及组胺等过敏介质。上述结果表明MrgprX2高表达膜受体固定相可以应用于以MrgprX2为靶点的药物引发类过敏组分的筛选。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

核苷酸序列表

<110> 西安交通大学

<120> MrgprX2高表达的重组细胞及MrgprX2高表达膜受体固定相及制备方法和应用

<160> 1

<210> 1

<211> 2130

<212> DNA

<213> MrgprX2

<400> 1

gtttgccagt cccaggaaag cacttctcaa ctcaccaact ccagtagaaa gaagggtgtt 60

aaggggcacc agtggaggtt ttctgagcat ggatccaacc accccggcct ggggaacaga 120

aagtacaaca gtgaatggaa atgaccaagc ccttcttctg ctttgtggca aggagaccct 180

gatcccggtc ttcctgatcc ttttcattgc cctggtcggg ctggtaggaa acgggtttgt 240

gctctggctc ctgggcttcc gcatgcgcag gaacgccttc tctgtctacg tcctcagcct 300

ggccggggcc gacttcctct tcctctgctt ccagattata aattgcctgg tgtacctcag 360

taacttcttc tgttccatct ccatcaattt ccctagcttc ttcaccactg tgatgacctg 420

tgcctacctt gcaggcctga gcatgctgag caccgtcagc accgagcgct gcctgtccgt 480

cctgtggccc atctggtatc gctgccgccg ccccagacac ctgtcagcgg tcgtgtgtgt 540

cctgctctgg gccctgtccc tactgctgag catcttggaa gggaagttct gtggcttctt 600

atttagtgat ggtgactctg gttggtgtca gacatttgat ttcatcactg cagcgtggct 660

gattttttta ttcatggttc tctgtgggtc cagtctggcc ctgctggtca ggatcctctg 720

tggctccagg ggtctgccac tgaccaggct gtacctgacc atcctgctca cagtgctggt 780

gttcctcctc tgcggcctgc cctttggcat tcagtggttc ctaatattat ggatctggaa 840

ggattctgat gtcttatttt gtcatattca tccagtttca gttgtcctgt catctcttaa 900

cagcagtgcc aaccccatca tttacttctt cgtgggctct tttaggaagc agtggcggct 960

gcagcagccg atcctcaagc tggctctcca gagggctctg caggacattg ctgaggtgga 1020

tcacagtgaa ggatgcttcc gtcagggcac cccggagatg tcgagaagca gtctggtgta 1080

gagatggaca gcctctactt ccatcagata tatgtggctt tgagaggcaa ctttgcccct 1140

gtctgtctga tttgctgaac tttctcagtc ctgattttaa aacagttaag agagtccttg 1200

tgaggattaa gtgagacagt gcctatgaaa caaacactaa gtgcagtgtc tctggaactg 1260

ccttactcac aggcttccac cacagcccta tgagagcttt gccaactctg cggtccatga 1320

ctgttcccac ttttaatgaa tcctaccttt cgcagaaggc tgaaagcagg gcagaaaaga 1380

tctacatttc tttggacact gcacttgata gggactcaaa gaatgttata tttttaatta 1440

atttcttttt ctcttccgta caatttctgt ctcaacaaaa ttagaagaat taaatttaaa 1500

actagctcca aaagagcagt cgtctttcat tttggcagac cttagaatat ccccctagct 1560

taataaatct ttgttgaatg gcttaatgaa tgaataaact ggttaatgtt taagttaaac 1620

ctctgaaaag tctccattta ccagatttga gtcactaaat ttattgcttt cactactttt 1680

gaattttgca aacatgaaat taagttttat aattagataa atcaatgtca acacatattt 1740

aaagtttgag gtacactgtc ttcctgtggt ttcctttcac atgccatccc ttaaaatccc 1800

agctacacgc cttcccattc cttccccttt gcctttgttc taatcttccc tctctggggg 1860

ctctctaatt cgtcctggaa gtttccagtg gtcttataga ctccatgttc ttggaggaca 1920

ggctgtatgt cagatttacc ttttattccg aagaactcgg agcatttatt ttgttaatta 1980

aattgcacat atttttaaaa gttacgtgtt ccacagaata aaatactaat tgtaaaaaaa 2040

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2130