一株诱变湛江等鞭金藻及其培养方法

摘要

本发明公开了一株经室温常压等离子体诱变的湛江等鞭金藻藻株-IM130005以及其在高温培养中的应用。湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)诱变藻株IM130005，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2015年11月09日，保藏编号CGMCC No.11418。本发明的湛江等鞭金藻是通过室温常压等离子诱变技术诱变获得的诱变藻株，相对与野生株具有更宽的温度耐受性，其在35-40℃的生长速率较野生株提升30％以上，且40-45℃区间的存活率较野生株提高一倍以上，适宜作为户外培养的工程藻株。

说明书

技术领域

本发明涉及一株诱变湛江等鞭金藻及其在高温培养的应用。

背景技术

微藻为自养型微生物，因其细胞内存在光合作用系统也称为微藻植物。微藻具有高效吸收太阳能、固定二氧化碳产生生物质的能力(即光合作用能力)；同时微藻作为微生物的一种，其增殖速度较快。作为单细胞生物，微藻的主要组成为蛋白、脂肪、碳水化合物和核酸等。目前，微藻已经是重要的养殖饵料被养殖企业广泛应用，同时微藻也已经成为类胡萝卜素、蛋白质、多糖等保健食品的来源。随着化石能源枯竭的预期加剧，微藻在能源制品和精细化学品的潜在应用也得到了极大关注。如本专利申请所涉及的湛江等鞭金藻，属于定鞭藻门，等鞭藻目，等鞭藻科，等鞭金藻属，富含不饱和脂肪酸，营养价值丰富，是我国非常重要的经济藻类。

目前，实际生产应用的藻种多从自然界直接分离获得，后代的性状单一，容易出现对环境的适应能力差以及藻种退化等问题，如野生湛江等鞭金藻在水温低于15℃或高于35℃时停止生长甚至死亡，极大限制了其应用，需要从藻种入手予以改良。在以太阳光为光源的规模培养过程中，一方面需要充足的光照作为微藻生长的能量，另一方面，连续光照将导致培养系统温度过高使得藻类无法存活，因此在光照充足的6-9月，存在持续光照导致培养系统温度过高而需要通过遮光降温的矛盾。

常压室温等离子体(ARTP)是近几年来发展起来的一种新的等离子体源，能够在常压(1am)下产生温度在25～40℃之间的、具有高活性粒子(如处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流。科学研究表明，等离子体中适当剂量的活性粒子作用于微生物(包括微藻)，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生致畸突变。该方法已被证明能够有效的应用于湛江等鞭金藻的诱变育种中【基于常压室温等离子体技术的金藻诱变筛选方法，中国生物工程杂志，2014,34(12)：84-90】。

湛江等鞭金藻IM130005正是利用上述技术所获得的一株诱变藻株，具有较野生株强的高温耐受能力。

发明内容

本发明的目的是提供一株湛江等鞭金藻诱变藻株IM130005，其具有可在35-45℃水温条件下仍可进行培养的能力。

本发明所提供的湛江等鞭金藻IM130005(Isochrysis zhangjiangensisIM130005)，是利用常压室温等离子体诱变技术获得的一株具有较野生株更宽温度耐受范围的诱变藻株，已于2015年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.11418。所述湛江等鞭金藻在标准F/2培养基培养条件下的形态特征：卵圆形或圆形，细胞长6～7μm，宽5～6μm，厚4～5μm，具有两条等长从细胞顶端伸出的、长度5～7μm的鞭毛；无细胞壁，由双层膜构成的质膜包被，质膜外是2～4层的鳞片层；具有单个细胞核。

野生金藻的最适培养温度在15-35℃之间。野生湛江等鞭金藻经过室温常压等离子诱变技术诱变后，以生长速率、脂肪酸成分等指标，以经典的F/2培养基为营养，在不同温度下进行培养测定，最终找到一株诱变株IM130005【基于常压室温等离子体技术的金藻诱变筛选方法，中国生物工程杂志，2014,34(12)：84-90】。其在正常培养条件下生长速度和总脂含量高于野生株，同时能够在高达35-45℃的水温条件下生长。因此，以该株诱变金藻为出发，大大延长了户外规模培养金藻的可培养区间，尤其是减缓了夏季培养过程中充足光照与高温之间的矛盾，具有高的实际应用前景。

湛江等鞭金藻诱变株IM130005(Isochrysis zhangjiangensisIM130005)已于2015年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC N0.11418。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：湛江等鞭金藻诱变株IM130005(Isochrysiszhangjiangensis IM130005)的种子液培养。

挑取生长于含有F/2营养盐的琼脂平板上IM130005单克隆于20mL含有F/2营养盐的灭菌海水(培养基)中，在100mL三角瓶中进行培养。培养条件为：温度(25±1)℃，光暗时间比14h∶10h，日光灯作光源，光强为(50±5)μmol/m²/s，培养至指数期接种使用。所使用的F/2营养盐主要成分的终浓度为NaNO₃>2PO₄·2H₂O>12>1>3·6H₂O3.16mg/L,Na₂EDTA·2H₂O>4·5H₂O>2MoO₄·2H₂O>4·7H₂O>2·6H₂O>2·4H₂O>

实施例2：湛江等鞭金藻诱变藻株IM130005与野生株在25℃条件下进行培养，对比其生长和总脂含量。接种细胞浓度约300万细胞/毫升，培养基同实施例1，培养七天，测定细胞数和总脂含量。其中总脂含量为氯仿甲醇提取后重量法测定，脂肪酸构成使用气相色谱外标法测定。结果表明，二者在25℃条件下脂肪酸构成相近，但是无论是最大比生长速率还是总脂含量，IM130005较野生株具有明显优势。详见表1和表2。

实施例3：湛江等鞭金藻诱变藻株IM130005与野生株在35-45℃条件下进行培养，对比其生长和脂肪酸构成。接种细胞浓度约1000万细胞/毫升，培养基同实施例1，其中脂肪酸构成使用气相色谱外标法测定。结果表明，二者在35-40℃条件下，IM130005生长仍维持较快速率，0.71d^-1，而野生株平均比生长速率下降至0.56d^-1；在40-45℃时，IM130005存活率达到70％以上，而野生株存活率不足30％。GC结果表明，随着微藻进入到高温培养，IM130005在处于高温培养时，其多不饱和脂肪酸含量较野生株下降更为迅速，有助于其调节细胞膜的流动性降低高温损伤。详见表2。

实施例4：湛江等鞭金藻诱变株IM130005的18s rDNA序列扩增使用标准真核细胞通用18s rDNA扩增引物，其中：

18s-F 5'-CCGAATTCGTCGACAACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'，

18s-R 5'-CCCGGGATCCAAGCTTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3'。扩增产物经测序获得湛江等鞭金藻诱变株IM130005(Isochrysis zhangjiangensisIM130005)18s rDNA序列如下。

湛江等鞭金藻诱变株IM130005(Isochrysis zhangjiangensisIM130005)

18s rDNA序列表

AACTTGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAAATGATAAGGTTCGGACAGCTTCCCGCGACGCCAGCGCTGGAGAACCAGCGGCGGCGCCGCAGTCCGGGGGCCTCACCGGATCATTCAATCGGTAGGAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGTGCGCTGATGACACACGCTTACTAGGAATTCCTCGTTGAAGATTAATAGTTGCAATAATCTATCCCCATCACGATGCAAGTTCACAAGATTACCCGGACCTCTCGGTCAAGGGAGACGACTCGCTGAATGCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGAACTTCCACTTGTTGAAGACAAGTTGTCCCTCTAAGAAGCGAGCCCCAACAGRGGGTTGGGGACACTATTTAGCAGGCTGCGGTCTCGTTCGTTAACGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATCGAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTCACAATGTCTGGACCTGGTAAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCGGAACCCAAAGACTTTAGTTTCCCGAAAGGTGCTGAAGGAGTCACAAACGGAACATCCTCCAATCCCTAGTCGGCATGGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCTTGATCAGTGAAAACATCCCTGGCAAATGCTTTCGCAGTCGTTCGTCTTCCGCTGGTCTGAGAATTTCACCTCTCTCGGCGGAATACGAGTGCCCCTGACTGTCCCTGTTAACCATTACTCCGGTGCTCGAAACCAACAAAATAGCACCAGAGTCCTATTTCATTATCCCATGCTAATCCATGCAAGAGCGACTGCCTGCTTGAAACACTCTGATTTTTTCAAAGTAAACATCCCGTCTCCGACCACCGCTCAGTTAAGAGTAGCGGCCGTCTCCGGGAGGAAGGACGCGCCCGCCAGTGCGTACCCATCGGCAGACCGGCGGGCCCGCCCCGAAATCCGACTACGAGCGTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGATCCTCGTGAAGAGATGTAAATTGTACTCATTCCAATTACAAGACTCGAAGAGCCCTGTATTGTTATTTCTTGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTCGGGCAATTTACGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCATTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCTCCGTTACCCGTTAACGCCATGGTAGGCCTCTATCCTACCATCGAAAGCTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCAGCGTAAAGCCGTGCGATTCGAGCAGTTAGTATGACTCAGCACGCAACCGGAGACCGGTTTGGTTTCTTATCTAATAAATACATCCCTTCCGAAGTCGGGAACTCCTGCATGTATTAGCTCTAGAATTACTACGGTTATCCAAGTAGCAAGGTACCATCAAATAAACCATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATACTCGCTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTGAGACAAGC

表1、25℃条件下IM130005与野生株生长和总脂含量对比

表2、25℃和40℃条件下IM130005与野生株脂肪酸含量对比