鉴定转基因植物或者转基因玉米双抗12‑5外源基因插入染色体位置的方法及其应用

摘要

本发明提供了一种鉴定转基因植物或者转基因玉米双抗12‑5外源基因插入染色体位置的方法及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明提供的鉴定转基因植物外源基因插入染色体位置的方法，通过筛选与阴性转基因个体连锁的分子标记引物，并根据分子标记引物所在的位置确定外源基因的位置，能够实现对基因组相对复杂的物种如玉米，大豆等作物的外源基因插入位置的快速准确识别。此外，本发明还提供了该方法在转基因玉米双抗12‑5中的应用，准确识别了双抗12‑5中，外源基因插入染色体的位置。另外，本发明还提供了上述方法在转基因作物育种，分子特征安全性评价以及转基因产品溯源等方面中的应用，具有良好的应用前景和可观的市场价值。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种鉴定转基因植物或者转基因玉米双抗12-5外源基因插入染色体位置的方法及其应用。

背景技术

最新数据表明：2015年，全球转基因作物种植面积达到1.81亿公顷，比1996年的170万公顷增长了100倍以上(James 2015)。以基因工程为核心的现代生物技术已广泛渗入到农业的各个领域，逐步改变了传统农业的研究和生产模式。转基因作物已被快速、持续地用于商业化生产。无论在发达国家还是发展中国家，转基因作物都对环境、经济、能源、卫生及社会产生了巨大影响。在我国转基因植物必须经过转基因植物安全评价后才能在国内进行种植并进行相关农产品的加工贸易，其中对于转基因外源片段插入在本体植物染色体的位置是对其分子特征安全性评价以及转基因产品溯源，鉴定的关键分子数据(CodexAlimentarius Commission 2003；OECD 1986,1992,2003；Sparrow 2010)。

目前鉴定转基因植物外源片断插入染色体位置的方法主要根据载体特异片段设计引物进行染色体步移的方式获取侧翼片段，然后通过生物信息学比对来确外源片断插入染色体位置(Codex 2003)，获得侧翼片段的方法主要有热不对称交错PCR(TAIL-PCR)等，通过这种方法成功的获得了我国自主研发的转基因水稻TT51-1和KF6等一系列转基因植物的外源基因插入位置(Cao et al.2011；Wang et al.2011)。然而这种方法在遇到像小麦，玉米等基因组复杂并且基因组中富含多个相似重复片段的物种时就很难通过序列比对的方式获取外源片段插入染色体位置的信息。

因此，就需要提供一种能够准确识别外源基因插入转基因植物染色体位置的方法。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定转基因植物外源基因插入染色体位置的方法，以准确的鉴定外源基因插入染色体的位置。

本发明提供的一种鉴定转基因植物外源基因插入染色体位置的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)以转基因植株和非转基因植株为亲本进行杂交，获得F1代，所述F1代自交获得F2代分离群体；

(b)从植物基因组数据库中，随机下载大量的SSR引物，再从所述SSR引物中，筛选出与所述转基因植株和所述非转基因植株存在多态性的多态性SSR引物；

(c)从所述F2代分离群体中筛选出阴性转基因个体；

(d)将所述多态性SSR引物与所述阴性转基因个体进行连锁分析，得到与所述阴性转基因个体连锁的分子标记的引物，所述分子标记的引物在染色体的位置即为所述外源基因插入染色体的位置。

进一步的，所述植物包括玉米或者大豆。

进一步的，步骤(b)中，所述多态性SSR引物的筛选方法包括：

分别以所述转基因植株和所述非转基因植株的基因组DNA为模板，用所述SSR引物进行PCR，并对PCR产物进行分析，能够使所述转基因植株的PCR产物和所述非转基因植株的PCR产物不相同的所述SSR引物，即为所述多态性SSR引物。

进一步的，步骤(d)中，所述连锁分析的方法包括：

以所述阴性转基因个体、所述转基因植株和所述非转基因植株的基因组DNA为模板，用所述多态性SSR引物进行PCR反应，并对PCR产物进行分析，能够使所述阴性转基因个体与所述非转基因植株的PCR反应产物相同的所述多态性SSR引物，即为与所述阴性转基因个体连锁的分子标记的引物。

另外本发明的第二个目的在于提供一种鉴定转基因玉米双抗12-5外源基因插入染色体位置的方法，为准确的识别转基因玉米双抗12-5品种中，外源基因在染色体中的插入位置提供一种新方法。

本发明提供了一种鉴定转基因玉米双抗12-5外源基因插入染色体位置的方法，所述外源基因为cry1Ab/cry2Aj基因以及G10evo基因，所述方法包括以下步骤：

(a)以转基因玉米双抗12-5和非转基因玉米昌7为亲本进行杂交，获得F1代，所述F1代自交获得F2代分离群体；

(b)从玉米数据库MaizeGDB中，随机下载大量的SSR引物，再从所述SSR引物中，筛选出与所述转基因玉米双抗12-5和所述非转基因玉米昌7存在多态性的多态性SSR引物；

(c)从所述F2代分离群体中筛选出阴性转基因个体；

(d)将所述多态性SSR引物与所述阴性转基因个体进行连锁分析，得到与所述阴性转基因个体连锁的分子标记的引物，所述分子标记的引物在染色体的位置即为所述外源基因插入染色体的位置。

进一步的，

步骤(b)中，筛选得到的所述多态性SSR引物共85对；

步骤(c)中，所述从所述F2代分离群体中筛选出阴性转基因个体的方法采用PCR方法以及草甘膦筛选法，筛选得到的所述阴性转基因个体共29个。

进一步的，所述分子标记的引物为引物umc1191和引物umc1691，

所述引物umc1191的序列为：

umc1191-F：5'-ACTCATCACCCCTCCAGAGTGTC-3'(SEQ ID NO.1)

umc1191-R：5'-AAGTCATTGCCCAAAGTGTTGC-3'(SEQ ID NO.2)

所述引物umc1691的序列为：

umc1691-F：5'-TCGTCTAAACTGCATAAAAGGGGA-3'(SEQ ID NO.3)

umc1691-R：5'-ACGGAGATAGATGCACACAAACAC-3'(SEQ ID NO.4)。

另外，本发明还提供了所述鉴定转基因植物外源基因插入染色体位置的方法和所述鉴定转基因玉米双抗12-5外源基因插入染色体位置的方法，在转基因作物育种、分子特征安全性评价以及转基因产品溯源中的应用。

本发明提供的鉴定转基因植物外源基因插入染色体位置的方法，通过筛选与分离群体中阴性转基因个体连锁的分子标记的引物，并根据分子标记的引物所在染色体的位置得到外源基因的位置，该方法准确可靠，能够实现对基因组相对复杂的物种如玉米，大豆等作物的外源基因插入位置的快速准确识别。此外，本发明还提供了鉴定转基因玉米双抗12-5外源基因插入染色体位置的方法，准确识别了转基因玉米品种双抗12-5中，外源基因插入染色体的位置。另外，本发明还提供了上述方法在转基因作物的育种、分子特征安全性评价以及转基因产品溯源等方面的应用，具有良好的应用前景和可观的市场价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例2中筛选出与转基因玉米双抗12-5和非转基因玉米C7存在多态性SSR引物的PCR结果图；

图2为本发明实施例2中与阴性转基因个体连锁的两个分子标记的PCR结果图；

图3为本发明实施例2中转基因玉米双抗12-5外源基因插入染色体位置示意图；

图4为本发明实施例2提供的方法的流程示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了有助于更清楚的理解本发明，现结合具体的实施例对本发明内容进行详细的介绍。如未明确指出，实施例中涉及的方法为常见的分子生物学方法，所述的试剂为市售常规试剂。

实施例1

本实施例提供了一种鉴定转基因植物外源基因插入染色体位置的方法，包括以下步骤：

(a)以转基因植株和非转基因植株为亲本进行杂交，获得F1代，F1代自交获得F2代分离群体。

需要注意的是，以外源基因A为例，转基因植株为含有外源基因A的植株；非转基因植株为不含有外源基因A的植株(即也可以含有与外源基因A不相关的外源基因B)。

(b)从植物基因组数据库中，随机下载大量的SSR引物，再从SSR引物中，筛选出与转基因植株和非转基因植株存在多态性的多态性SSR引物。

本步骤中，首先从植物基因组数据库中选取SSR引物，这些SSR引物最好均匀分布在待鉴定植株的基因组上。然后再从这些SSR引物中，筛选出与转基因植株和非转基因植株存在多态性的多态性SSR引物。

其中，几个常用的植物基因组数据库如表1所示。

表1常见的植物基因组数据库

本步骤中，筛选多态性SSR引物的方法为：分别以转基因植株和非转基因植株的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR，并对PCR产物进行分析，能够使转基因植株的PCR产物和非转基因植株的PCR产物不相同的SSR引物，即为多态性SSR引物。

(c)从F2代分离群体中筛选出阴性转基因个体。

本步骤中，筛选阴性转基因个体的方法，可以采用PCR方法，也可以根据外源基因产生的具体性状进行筛选，也可以采用两种方法的结合，优选采用PCR方法进行筛选。其中PCR方法为以F2代分离群体的DNA为模板，用外源基因的引物进行PCR，PCR产物有目标条带即为阳性转基因个体，PCR产物没有目标条带即为阴性转基因个体。

(d)分别提取F2代分离群体中的阴性转基因个体、转基因植株和非转基因植株亲本的DNA，并分别以三个样本的DNA为模板，用步骤(b)中的获得的多态性SSR引物进行PCR反应，并对PCR产物进行分析，PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析，筛选得到能够使阴性转基因个体与非转基因植株的PCR反应产物带型一致的多态性SSR引物，即为与阴性转基因个体连锁的分子标记的引物，该分子标记的引物在染色体的位置即为外源基因插入染色体的位置。

该方法能够实现对基因组相对复杂的物种，例如玉米、大豆或者小麦等作物的外源基因插入染色体位置的快速准确识别，且对转入的外源基因没有限制，对任何已知序列的外源基因均适用。该方法克服了当外源基因插入到植物基因组的重复序列区域而导致无法精确识别外源基因在染色体位置的困扰。

实施例2

本实施例提供了一种鉴定转基因玉米双抗12-5外源基因插入染色体位置的方法。其中，转基因玉米双抗12-5的外源基因为cry1Ab/cry2Aj基因以及G10evo基因。转基因玉米双抗12-5品种来自于浙江大学，昆虫所。

该方法具体包括以下步骤：

(a)以转基因玉米双抗12-5(以下简称“双抗12-5”)和非转基因玉米昌7(以下简称“C7”)为亲本进行杂交，获得F1代，F1代自交获得F2代分离群体。

(b)从玉米数据库MaizeGDB(http://www.maizegdb.org)中，随机下载大量的SSR引物，再从这些SSR引物中，筛选出与双抗12-5和C7存在多态性的多态性SSR引物共85对。

筛选多态性SSR引物的方法采用PCR方法，分别以双抗12-5和C7的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR(针对每一对引物分别进行PCR)，然后对PCR产物进行分析，当转基因植株的PCR产物和非转基因植株的PCR产物不相同时，表明该SSR引物即为多态性SSR引物。

具体的PCR方法如下：

PCR引物为：从玉米数据库MaizeGDB(http://www.maizegdb.org)中，随机下载的大量SSR引物。

PCR反应体系为：10μL的反应体系，包括1μL 10×PCR反应缓冲液、0.6μL 25mmol/LdNTP溶液、1μL 5μmol/L正向引物，1μmol/L 5μmol/L反向引物，0.25μL 2U/μL Taq DNA聚合酶，4.35μL超纯水，1μL样品DNA(即双抗12-5或者C7的基因组DNA)。若缓冲液含有MgCl₂，则不再加MgCl₂溶液，以加等体积无菌水替代。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性45s，50℃-65℃(根据引物序列Tm值确定)退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸8min，4℃保存。

对PCR产物进行电泳分析，以双抗12-5和C7的基因组为模板出现大小不一致的扩增条带则说明该引物存在多态性，如图1列出了10对多态性SSR引物的电泳图。由图1可以看出，分别以双抗12-5和C7的基因组为模板时，10对SSR引物的PCR产物扩增条带均不相同，即表明这10对SSR引物为多态性SSR引物。图1中，P1表示转基因玉米双抗12-5；P2表示非转基因玉米C7；F1表示双抗12-5与C7的杂交一代；M表示分子量Marker。

按照上述方法，分别对随机下载的大量SSR引物进行PCR筛选，最终得到了85对多态性SSR引物，具体的多态性SSR引物的序列如表2所示。虽然本实施例对大量的SSR引物进行了筛选，但考虑到除了筛选得到的85对多态性SSR引物之外的，不具有多态性的SSR引物对本实施例的最终结果不具有突出的贡献，因此，本实施例中仅记载了85对多态性SSR引物的核苷酸序列。

表2 85对多态性SSR引物的核苷酸序列

(c)转基因玉米双抗12-5的外源基因为cry1Ab/cry2Aj基因以及G10evo基因。其中，cry1Ab/cry2Aj基因能够使玉米具有抗虫性，G10evo基因能够使玉米具有耐除草剂(草甘膦)性。

为了筛选出不含cry1Ab/cry2Aj基因的个体，本实施例采用了PCR方法，具体方法如下。

PCR引物为：

Cry1Ab/Cry2Aj-F：5'-TTCACCACCCCCTTCAACTTC-3'(SEQ ID NO.5)

Cry1Ab/Cry2Aj-R：5'-TTCCACTCGGTCCACTCCTTC-3'(SEQ ID NO.6)

PCR反应体系为：10μL的反应体系，包括1μL 10×PCR反应缓冲液、0.6μL 25mmol/LdNTP溶液、1μL 5μmol/L正向引物，1μmol/L5μmol/L反向引物，0.25μL 2U/μL Taq DNA聚合酶，4.35μL超纯水，1μL样品DNA。若缓冲液含有MgCl₂，则不再加MgCl₂溶液，以加等体积无菌水替代。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸8min，4℃保存。

对PCR产物进行分析，PCR检测阴性的个体，即不含有cry1Ab/cry2Aj基因。

为了筛选出不含有G10evo基因的个体，本实施例采用了耐除草剂(草甘膦)筛选法。

除草剂的施用量为：农药登记标签的中剂量或者推荐剂量。

用药时间：转基因玉米双抗12-5的V3-V5生育期。

不能够在草甘膦除草剂存在的条件下存活的个体，即不含有G10evo基因。

采用上述PCR方法以及耐除草剂(草甘膦)筛选法相结合，从F2代分离群体中筛选得到不抗草甘膦且PCR阴性的个体，即为阴性转基因个体，共计29个。

(d)分别提取F2代分离群体中的阴性转基因个体、双抗12-5和C7的叶片DNA，并分别以三个样本的DNA为模板，用步骤(b)中的获得的多态性SSR引物进行PCR反应。

PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果发现用引物umc1191和引物umc1691分别进行PCR时，C7的扩增带型与29个阴性转基因个体的扩增带型均一致(如图2所示，其中P1表示转基因玉米双抗12-5；P2表示非转基因玉米C7；M表示分子量Marker)，而其他的引物在阴性转基因个体中带型为正常的自由分离。上述结果表明，用引物umc1191和引物umc1691进行PCR扩增的产物是与阴性转基因个体连锁的分子标记，而引物umc1191和引物umc1691则是与阴性转基因个体连锁的分子标记的引物，外源基因插入染色体的位置则与引物umc1191和引物umc1691在染色体的位置连锁。又根据根据玉米数据库MaizeGDB(http://www.maizegdb.org)的信息得知，这两个引物位于第九染色体Bin9.03，因此外源基因也位于第九染色体Bin9.03处(如图3所示)。

其中，引物umc1191的序列为：

umc1191-F：5'-ACTCATCACCCCTCCAGAGTGTC-3'(SEQ ID NO.1)

umc1191-R：5'-AAGTCATTGCCCAAAGTGTTGC-3'(SEQ ID NO.2)

引物umc1691的序列为：

umc1691-F：5'-TCGTCTAAACTGCATAAAAGGGGA-3'(SEQ ID NO.3)

umc1691-R：5'-ACGGAGATAGATGCACACAAACAC-3'(SEQ ID NO.4)。

为了有助于对本实施例的理解，图4描绘了本实施例的流程示意图，其中“郑58”为转基因玉米双抗12-5的商品名称，“昌7”即为非转基因玉米昌7。

按照本实施例提供的方法，能够快速、准确的鉴定转基因玉米品种双抗12-5中，外源基因cry1Ab/cry2Aj和G10evo的插入位置在第九染色体Bin9.03处。

需要注意的是，本实施例中的转基因玉米品种也可以为其他植物或者品种，转入的外源基因可以为其他基因，只需确定外源基因的基因序列，即可应用本方法快速、准确的鉴定外源基因插入转基因植物中染色体的位置。

除此之外，本发明还提供了上述鉴定转基因植物外源基因插入染色体位置的方法，以及鉴定转基因玉米双抗12-5外源基因插入染色体位置的方法在转基因作物育种、分子特征安全性评价以及转基因产品溯源等方面的应用。在我国转基因植物必须经过转基因植物安全评价后才能在国内进行种植并进行相关农产品的加工贸易，其中获取转基因外源片段插入在本体植物染色体的位置是必要的(转基因植物安全评价指南)，本方法通过筛选与双抗12-5外源基因连锁的分子标记获得了外源基因插入在玉米第九号染色体上，有利于转基因双抗12-5顺利获得安全证书并进一步商业化。同时本发明方法提供了转基因玉米双抗12-5与外源基因紧密连锁的分子标记，因此在后代杂交育种时可采用分子标记辅助选择育种对优良资源进行筛选。

此外，本发明提供的方法还可以与TAIL-PCR方法结合，相互补充，也可用于转基因作物育种，分子特征安全性评价以及转基因产品溯源等方面，具有良好的应用前景和可观的市场价值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院

<120> 鉴定转基因植物或者转基因玉米双抗12-5外源基因插入染色体位置的方法及

其应用

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actcatcacc cctccagagt gtc 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagtcattgc ccaaagtgtt gc 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgtctaaac tgcataaaag ggga 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acggagatag atgcacacaa acac 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttcaccaccc ccttcaactt c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttccactcgg tccactcctt c 21