公开/公告号CN106755399A
专利类型发明专利
公开/公告日2017-05-31
原文格式PDF
申请/专利权人 杭州艾诺医学检验所有限公司;
申请/专利号CN201611189175.7
发明设计人 俞萍;
申请日2016-12-21
分类号C12Q1/68(20060101);C12N15/11(20060101);
代理机构11282 北京中海智圣知识产权代理有限公司;
代理人胡静
地址 310000 浙江省杭州市余杭区良渚街道七贤桥村良渚大学科技园2幢2楼
入库时间 2023-06-19 02:16:22
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-11-15
授权
授权
2017-06-23
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20161221
实质审查的生效
2017-05-31
公开
公开
技术领域
本发明涉及分子生物学及基因检测领域,尤其涉及一种I型神经纤维瘤病致病基因突变及基于此基因突变的病因学诊断试剂。
背景技术
I型神经纤维瘤病(Neurofibromatosis type I,NF1)由von Recklinghausen于1882年首次报道,故又称为von Recklinghausen病。I型神经纤维瘤病一般为常染色体显性遗传,部分为散发。临床上主要表现为皮肤咖啡斑、多发性皮肤软纤维瘤;非暴露部位(如腋窝、腹股沟)出现的雀斑和虹膜黑色素错构瘤;也可累及多个器官和系统,如眼、骨骼、血管、内分泌系统、中枢及外周神经系统等,并可伴有智力发育障碍、先天性发育不良、极罕见恶变者。
该病由NF1基因发生突变引起。NF1基因定位于染色体17q11.2,包含57个组成性外显子和3个可变剪接外显子,全长283kb,有3个大小为11~13kb的成熟转录本,编码相对分子质量为327000、由2818个氨基酸组成的神经纤维(Neurofibromin)蛋白,大量表达于神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、肾上腺细胞、性腺细胞和白细胞。NF1基因是肿瘤抑制基因,不少研究表明NF1基因突变可通过干扰Ras循环的cAMP信号转导通路从而引发肿瘤。NF1基因自发突变率约为1/10000,是人类基因突变率最高的基因位点之一,约50%患者为新突变,至今仍有未明确的突变点,但发现了一些突变集中区域。其中外显子4b、7、10b、13、15、20、28,29,31可能为突变热点,而32号外显子突变可能是中国人NF1基因突变热点区域之一。目前发现的基因突变已超过700多种,包括碱基的转换、颠换、插入、缺失、移码突变、拼接突变及染色体平衡易位等。在这些突变中,约有82%突变造成神经纤维蛋白的截短,蛋白的截短对蛋白的功能结构产生重要的影响。
目前,针对I型神经纤维瘤病高发病率检测的需求日益增加,设计研究科学合理且精准的检测试剂盒十分必要。由于NF1基因片段较大,突变情况复杂,易造成漏检。而该病不同患者的临床表现不同,且同一家族的不同患者临床表现也不同,大大增加了临床诊断的难度,因此建立快速且准确的诊断技术、攻克I型神经纤维瘤病的诊断难题,对其临床治疗和科学研究都具有重要的价值。
但目前所发现的突变热点不足以解决临床上I型神经纤维瘤病基因筛查、诊断的难题。寻找新的致病突变,丰富NF1神经纤维瘤病突变谱,将为临床上方便快捷的筛查和诊断I型神经纤维瘤病患者提供重要的靶点及理论依据,这一直是本领域研究人员孜孜不倦的探究领域。
由于NF1基因包含58个组成性外显子和3个可变剪接外显子,传统的针对每一个外显子的测序分析方法耗时长,每个测序样本完成检测一般需六、七天。而其他检测方法如NGS、FISH或MLPA等,需配备价格昂贵的大型仪器设备,实验条件要求高,导致检测成本大大升高。
另外,NF1基因的突变类型除点突变外,还存在大片断缺失、一个或多个外显子的重复/缺失等多种类型。通过单一方法检测NF1基因突变易漏检,这也是目前NF1致病基因突变检测困扰临床遗传诊断人员的一个难题。
综上所述,寻找对诊断有效的新致病突变,并研制省时、精准、且实验条件要求较低的诊断试剂对NF1基因突变全面检测,是解决I型神经纤维瘤病诊断难题的根本方法。
发明内容
有鉴于此,为攻克现有技术中的难题,本发明人经过艰辛研究,发现一种可有效诊断I型神经纤维瘤病致病基因的突变,并研制出基于此基因突变的病因学诊断试剂。该试剂可在短时间内获得诊断结果,实验条件要求低,诊断结果准确。
本发明公开一种I型神经纤维瘤病致病基因突变,所述突变位于NF1基因第48号外显子区域,其编码第7106位的鸟嘌呤替换为腺嘌呤从而引起第2369位的色氨酸突变为终止密码子(c.7106G>A,p.W2369X)。
本发明公开的I型神经纤维瘤病致病基因突变与I型神经纤维瘤病高度相关,该突变(c.7106G>A,p.W2369X)使神经纤维蛋白截短而失去正常功能,造成常染色体显性遗传病的I型神经纤维瘤病。
本发明还提供基于上述I型神经纤维瘤病致病基因突变的神经纤维瘤病因学诊断试剂,所述诊断试剂包括点突变分析试剂盒,所述试剂盒包括1)总RNA提取体系试剂盒:被测个体外周静脉血总RNA提取;2)RNA反转录及cDNA扩增体系试剂盒;3)cDNA测序体系试剂盒;所述cDNA测序体系试剂盒:对反转录获得的cDNA以SEQ ID NO.7-16所示五个引物对进行PCR扩增,再对扩增得到的cDNA五个大片段以SEQ ID NO.17-60所示引物对同时进行巢式PCR扩增并测序,并与原NF1基因编码DNA序列比对,当扩增产物中c.7106G>A,p.W2369X突变存在时为I型神经纤维瘤病患者。
进一步,所述诊断试剂还包括NF1基因外显子缺失分析试剂盒:以所述反转录获得的NF1基因cDNA为模板,以SEQ ID NO.61-70所示引物对分别对NF1的外显子3、11、25、34、58进行实时荧光定量PCR扩增,以2-ΔΔCt法进行数据分析,计算得到五个外显子的相对基因含量,当五个外显子的相对基因含量均在0.5左右时为外显子缺失携带者,并提示NF1基因缺失或部分缺失。
进一步,所述诊断试剂还包括NF1全基因大片段缺失分析试剂盒,所述试剂盒包括1)DNA提取体系试剂盒:被测个体外周静脉血基因组DNA提取;2)基因内微卫星多态标志分析试剂盒:以所述基因组DNA为模板,以SEQ ID NO.1-6所示的三对引物对27AC28.4、27CAGT、38TG53.0三个多态性位点进行PCR扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物,当PCR产物中三个引物对扩增的片段均为纯合子时NFI基因存在全基因大片段缺失的可能性。
进一步,所述对cDNA进行PCR扩增获得五个大片段时,引物退火温度为60℃;对五个大片段进行巢式PCR扩增时,引物退火温度为62℃。
进一步,所述实时荧光定量PCR扩增合成引物片段不超过350bp。
进一步,所述27CAGT扩增片段的大小为201bp左右,27AC28.4扩增片段的大小为214bp左右,38TG53.0扩增片段的大小为479bp左右。
本发明还提供上述病因学诊断试剂的使用方法,包括如下步骤:1)以被测个体外周静脉血为样本,以所述点突变分析试剂盒分析样本中包括c.7106G>A,p.W2369X突变的点突变是否存在,如存在为I型神经纤维瘤病患者,如不存在进行下述步骤;2)以NF1全基因大片段缺失分析试剂盒分析样本中全基因大片段缺失存在的可能性,如存在杂合子,则排除全基因大片段缺失的可能性;如均为纯合子,则疑为全基因大片段缺失突变患者,进行下述步骤;3)以NF1基因外显子缺失分析试剂盒分析是否为外显子缺失携带者,如是缺失携带者则诊断为患者,如不是则为其他基因突变或正常个体。
本发明还提供病因学诊断试剂中用于检测NF1基因突变的引物对组,包括用于检测NF1基因大片段缺失的引物对,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-6所示;用于扩增cDNA获得五个大片段的引物对,其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-16所示;用于对cDNA的五个大片段进行巢式PCR扩增的引物对,其核苷酸序列如SEQ ID NO.17-60所示;用于检测NF1基因外显子缺失的引物对,其核苷酸序列如SEQ ID NO.61-70所示。
上述病因学诊断试剂的制备方法,包括如下步骤:将所述引物对组中的70条单链DNA分别单独包装后,与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内:PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
实现本发明的具体实验方法与步骤如下:
1.扩增引物的设计与合成
从NCBI数据库获得NF1基因核酸序列,应用Primer-BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计cDNA外套引物、cDNA巢式引物、STR标志引物、Real>
2.样品前处理(核酸提取)
2.1总RNA的提取(RNAisoTMPlus,日本TaKaRa)
2.1.1抽取外周血,取100μl外周血于1.5ml EP管中。
2.1.2加入1ml RNAiso Plus,反复吹打胞至细胞彻底裂解。
2.1.3加入200μl氯仿,充分振荡15sec使溶液充分乳化,室温静置5min。
2.1.4 12000rpm 4℃离心15min后,将上清液转移至新1.5ml离心管中(分为三层,切勿吸入中下两层)。
2.1.5加入等体积的异丙醇,充分混合后,室温静置10min。
2.1.6 12000rpm,4℃离心10min后,弃去上清液,留沉淀。
2.1.7加入1ml 75%乙醇溶液,洗涤沉淀。12000rpm,4℃离心5min。
2.1.8吸净上清后,室温干燥30min(在超净工作台中进行)。
2.1.9加入20μl DEPC水,55-60℃水浴10min溶解RNA。
2.1.10测定RNA浓度,保存于-80℃冰箱内备用。
2.2全血DNA抽提(天根血液基因组DNA提取试剂盒-离心柱法)
2.2.1取300μl的抗凝全血,在样品中加入600μl细胞裂解液CL,颠倒混匀,10000rpm离心1min,吸去上清,留下细胞核沉淀。
2.2.2重复上述步骤一次。
2.2.3向离心收集到的细胞核沉淀中加200μl缓冲液GS,振荡至彻底混匀。
2.2.4加入20μl Proteinase K溶液,混匀。
2.2.5加入200μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,56℃放置10min,其间颠倒混匀数次,直至溶液应清亮。
2.2.6加200μl无水乙醇,充分颠倒混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
2.2.7将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入2ml收集管中),12,000rpm离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入新的2ml收集管中。
2.2.8向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD,12,000rpm离心30sec,倒掉收集管中的废液,再将吸附柱CB3放入新的2ml收集管中。
2.2.9向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW,12,000rpm离心30sec,倒掉收集管中的废液,再将吸附柱CB3放入新的2ml收集管中。
2.2.10重复操作步骤9。
2.2.11 12,000rpm离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
2.2.12将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加100μl洗脱缓冲液TB,室温放置2-5min,12,000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中。
2.2.13取1μl DNA于Nanodrop紫外分光光度计测定OD260nm/280nm比值,其余DNA保存于4℃冰箱内,用于后续研究。
3.核酸扩增
3.1利用三个基因内微卫星多态标志分析(27AC28.4,38TG53.0,27CAGT),排查全基因大片段缺失的可能性。
3.1.1聚丙烯酰胺凝胶(8%)130ml配制:
3.1.2将以上配制的液体倒入制胶板,待凝胶聚合后,以1×TBE作为电泳缓冲液,预电泳半小时后将PCR产物小心加到相应的凝胶孔中,100V电泳约4-5h。
3.1.3用银染的方法来检测DNA分子是一种灵敏而简单的手段。利用银离子可与核酸结合的特性,在甲醛作用下银离子还原使凝胶中DNA条带显色。其操作过程如下:
①电泳完的聚丙烯酰胺凝胶用10%的酒精浸泡5分钟。
②弃酒精,加入1%HNO3,3分钟。
③弃HNO3,用清水清洗两次。
④加入AgNO3,染色20分钟。
⑤用ddH2O清洗一次。
⑥加入显影液,至可见清淅的DNA电泳条带为止。
⑦弃显影液,加入10%的乙酸定影5分钟。
⑧弃乙酸,在清水中浸泡5分钟以上。
⑨用玻璃纸包胶干燥,观察分析及扫描存档。
3.2RNA反转录及cDNA扩增,RT-PCR
3.2.1反转录PCR
反转录PCR反应体系如下(PrimeScriptTM RT reagent Kit,日本TaKaRa):
反转录PCR反应条件如下:
37℃15min
85℃5s
产物-20℃保存备用。
3.2.2cDNA测序:
先扩增NF1基因cDNA1、2、3、4、5共5个大片段,这些大片段覆盖了基因的全长。
反应体系:30ul
PCR反应循环条件:
巢式测序:
cDNA1-1、1-2、1-3、1-4;cDNA2-1、2-2、2-3、2-4、2-5;cDNA3-1、3-2、3-3、3-4、3-5;cDNA4-1、4-2、4-3、4-4;cDNA5-1、5-2、5-3、5-4共22对引物。
PCR反应循环条件:30ul
*Exon31为可变剪切,所以cDNA3-2、3-3有两个条带。
3.2.3Real time PCR
已合成的引物中选择符合条件片段大小不超过350bp(最适宜片段大小在300bp以下)和退火温度60℃的有exons 3、11、25、34、58进行Real time PCR。反应在ABI 7500real-time PCR system(Applied Biosystem,Foster City,CA)仪器上进行,DNA样品浓度稀释至5ng/μl,反应体系参照下述配制,每份样品每次反应做3个复孔。
反应体系及条件:
反应条件如下:
数据分析:
实验所用的数据分析方法为2-ΔΔCt法。Ct值就是在荧光PCR扩增过程中,当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。它与模版的拷贝数存在着线性关系,起始拷贝数越多,经过的循环数就越少,Ct值也就越小,反之亦然。平均Ct(mCt)为每份样品三个复孔Ct值的平均值。ΔCt为NF1基因外显子与内参基因(β-globin)Ct值的差值。ΔΔCt的计算公式为:ΔΔCt=[mCtNF1exon(待测)–mCtβ-globin(待测)]–[mCtNF1>(对照)–mCtβ-globin(对照)]。每对引物选取3个正常女性作为对照。根据此方法计算得到每个待测样本的相对基因含量,0.5左右为缺失携带者,1左右表示正常个体。
目前用于检测基因的方法有Sanger测序法、二代测序法、多重连接探针扩增MLPA(multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)法、荧光原位杂交FISH(Fluorescence in situ hybridization,FISH)法等,然而这检测方法要么耗时过多,要么需配备价格昂贵的大型仪器设备,导致检测成本大大升高。本发明采用巢式扩增后的测序以及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术使检测时间大大缩短,检测成本大大降低。
传统Sanger测序方法仅能检出点突变、小片段插入和缺失,不能检出外显子缺失和整个NF1基因的缺失或重复等。本发明在巢式测序的点突变检测后,更进一步采用STR标志分析和Real time PCR联合对NF1基因全片段缺失进行快速且准确的全面检测。实践证明STR标志分析法可有效地运用于NF1整个基因的缺失的检测。Real time PCR的高灵敏、高特异性和精确定量的特点,可对NF1整个基因的缺失或重复进行准确诊断。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
1.本发明公开的I型神经纤维瘤病致病基因突变与I型神经纤维瘤病高度相关,运用此方法已经成功检出十几例患者。其中突变(c.7106G>A,p.W2369X)使神经纤维蛋白截短而失去正常功能,造成常染色体显性遗传病的I型神经纤维瘤病。
2.本发明采用巢式扩增后的测序使检测时间大大缩短,检测成本大大降低。
3.本发明采用STR标志分析与Real time PCR分析相互佐证的方法来判断基因大片段缺失的存在,其结果更加精准。
4.本发明结合Sanger测序,Real time PCR和STR标志分析法等多种技术的各自优点,针对NF1基因的点突变、移码突变、拼接突变、大片段缺失和重复进行快速且准确的全面检测。
5.本发明试剂盒所提供的引物对组,采用价格低廉的普通DNA聚合酶即可快速、准确、高效的鉴定神经纤维瘤遗传缺陷,获得检测结果。
6.本发明诊断试剂基于核酸扩增技术而开发设计,具有设备要求低、检测时间短、准确率高、漏检率极低,方便快捷等特点。
7.本发明NF1基因突变的准确检出,为产前诊断和后续辅助生殖提供可能,可进一步预防出生缺陷,提高出生人口质量。
8.本发明为神经纤维瘤遗传缺陷基因的分子筛查提供参考和借鉴。
附图说明
图1:利用核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物对进行DNA的扩增结果;
图中字母A代表27CAGT标记名称,后面的数字表示该STR标记的每个等位基因型,按照扩增片段大小递增排列。出现A1、A2或者A3其中一个片段即为纯合子,出现其中任意二个片段的组合A1/A2、A1/A3、A2/A3为杂合子。
胶图中A1为CA重复数14个,如检出A2或者A3其中一个片段即为纯合子。
图2:利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物对进行DNA的扩增结果;
图中字母D代表27AC28.4标记名称,后面的数字表示该STR标记的每个等位基因型,按照扩增片段大小递增排列。出现D1、D2或者D3其中一个片段即为纯合子,出现其中任意二个片段的组合D1/D2、D1/D3、D2/D3为杂合子。
胶图中D1为AC重复数15个,如检出D3一个片段即为纯合子。
图3:利用核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物对进行DNA的扩增结果;
图中字母C代表38TG53.0标记名称,后面的数字表示该STR标记的每个等位基因型,按照扩增片段大小递增排列。出现C1、C2或者C3其中一个片段即为纯合子,出现其中任意二个片段的组合C1/C2、C1/C3、C2/C3为杂合子。
胶图中C1为9个重复数,如检出C2一个片段即为纯合子。
图4:利用核苷酸序列如SEQ ID NO.7-16所示的引物对进行扩增cDNA五个大片段的扩增结果;
图5:利用核苷酸序列如SEQ ID NO.17-60所示的引物对进行巢式PCR的扩增结果;
图6:Sanger测序结果;
图7:本发明诊断试剂检测流程图。
具体实施方式
实施例1
I型神经纤维瘤病NF1基因突变的发现
发明人对13例患者进行了基因突变分析,详细步骤如下:
1)采用突变分析试剂进行检测:所述试剂包括1)总RNA提取体系试剂;2)RNA反转录及cDNA扩增体系试剂;3)cDNA测序体系试剂。
2)抽取疑似患者和正常对照样本EDTA抗凝外周血样本各2ml,进行总RNA的提取,反转录PCR,cDNA扩增获得cDNA1、2、3、4、5共5个大片段(结果见图4);对5段cDNA大片段进行巢式PCR,共22对引物,PCR产物琼脂糖电泳结果(图5)和测序结果(图6)。
I型神经纤维瘤病为常染色体显性遗传,本研究结合家系实际情况以及NF1基因高自发突变率的特点,发现13位患者中有1位存在NF1基因c.7106G>A,p.W2369X突变(图6)。预期该突变使蛋白截短而失去正常功能,该结果均与临床诊断相符(患者乙样本来自某三甲医院,8个以上皮肤咖啡牛奶斑,有腋窝或腹股沟雀斑,有3个神经纤维瘤,初步诊断为1型神经纤维瘤)。3例表型正常人均未发现上述突变。由此,可初步推断上述基因突变为该患者致病突变。其余患者为其他类型突变,具体如下:
1)NF1基因检测结果为c.2835delT,p.Phe945Leufsx10突变阳性
2)NF1基因杂合性缺失(测序以外的其他检测方法检测的结果)
3)NF1基因测序检测结果为c.2447G>A p.R816Q和c.7352delC p.Pro2451Leufs*17杂合突变阳性
4)NF1基因检测结果为c.6772C>T p.R2258X杂合突变阳性
5)NF1基因检测结果为p.T1923K杂合突变阳性
6)NF1基因检测结果为c.989C>T P.A330V突变阳性
7)NF1基因检测结果为c.4786C>T P.Q1596X杂合突变阳性
8)NF1基因exon28检测为c.3826C>T P.R1276X杂合突变阳性
9)NF1基因检测结果为exon28c.3721C>T,p.R1241X杂合突变阳性
10)NF1基因检测结果为c.1019_1020delCT,p.Ser340Cysfsx12杂合突变阳性
11)NF1基因检测结果为c.989C-T p.A330V杂合突变阳性
12)患者甲基因检测结果为基因大片段缺失(测序以外的其他检测方法检测的结果)
实施例2
应用本发明试剂盒进行诊断的使用方法和应用例。
一、获取临床样本并设置实验组和对照组
1)患者甲
患者甲,男性,样本来自某三甲医院,6个皮肤咖啡牛奶斑,有腋窝或腹股沟雀斑,有9个神经纤维瘤,初步诊断为1型神经纤维瘤。
2)患者乙
患者乙样本来自某三甲医院,8个及以上的皮肤咖啡牛奶斑,有腋窝或腹股沟雀斑,有3个神经纤维瘤,初步诊断为1型神经纤维瘤。
3)对照组
选取3例正常人为对照组。
二、实验方案与步骤
采用本发明点突变分析试剂盒进行检测:所述试剂盒包括1)总RNA提取体系试剂盒;2)RNA反转录及cDNA扩增体系试剂盒;3)cDNA测序体系试剂盒。
具体操作如下:
1.抽取疑似患者甲、患者乙和正常对照样本EDTA抗凝外周血样本各2ml。
2.总RNA的提取:
2.1抽取待测者新鲜血液2ml,取100μl的血液与1.5mlEP管中。
2.2加入1ml RNAiso Plus,反复吹打至彻底裂解。
2.3加入200μl氯仿,充分振荡15sec使溶液充分乳化,室温静置5min。
2.4 12000rpm 4℃离心15min后,将上清液转移至新1.5ml离心管中(分为三层,切勿吸入中下两层)。
2.5加入等体积的异丙醇,充分混合后,室温静置10min。
2.6 12000rpm,4℃离心10min后,弃去上清液,留沉淀。
2.7加入1ml 75%乙醇溶液,洗涤沉淀。12000rpm,4℃离心5min。
2.8吸净上清后,室温干燥30min(在超净工作台中进行)。
2.9加入20μl DEPC水,55-60℃水浴10min溶解RNA。
2.10测定RNA浓度,疑似患者组:133ng/μl;正常对照组:165ng/μl,保存于-80℃冰箱。
3、反转录PCR
取患者组和正常对照组的总RNA1μg为模板进行逆转录。
反转录PCR反应体系如下:
反转录PCR反应条件如下:
37℃15min
85℃5s
cDNA产物-20℃保存备用。
4、cDNA扩增(本发明试剂盒cDNA外套引物、cDNA巢式引物序列见附表1)
4.1对疑似患者组和正常对照组的cDNA进行PCR扩增,扩增获得NF1基因cDNA1、2、3、4、5共5个大片段。
反应体系:30ul
PCR反应条件:
4.2对5个大片段PCR产物进行琼脂糖电泳(结果见图4)。
4.3巢式PCR:对5段cDNA大片段进行巢式PCR。(本发明cDNA巢式引物序列见附表1cDNA1-1、1-2、1-3、1-4;cDNA2-1、2-2、2-3、2-4、2-5;cDNA3-1、3-2、3-3、3-4、3-5;cDNA4-1、4-2、4-3、4-4;cDNA5-1、5-2、5-3、5-4共22对引物)
PCR反应循环条件:30ul
4.4PCR产物琼脂糖电泳结果(图5)和测序结果(图6)。
结果分析:如图所示,患者甲NF1基因58个外显子区域的测序检测未发现突变:c.7106G>A,p.W2369X。患者乙NF1基因58个外显子区域的测序检测发现突变:c.7106G>A,p.W2369X,预期该突变使蛋白截短而失去正常功能,该结果与临床诊断相符。3例正常人均未发现上述突变。患者乙可确诊为I型神经纤维瘤病患者。
实施例3
前述步骤与实施例2基本相同,所不同之处在于,对未检测到突变:c.7106G>A,p.W2369X的患者甲和3例正常人继续如下检测。
采用本发明NF1全基因大片段缺失分析试剂盒进行检测,所述试剂盒包括1)DNA提取体系试剂盒;2)基因内微卫星多态标志分析试剂盒。
具体操作如下:
5、使用基因组DNA抽提试剂盒抽提疑似患者甲和正常对照外周血DNA(确保抽提DNA储存浓度>50ng/μl):
5.1取300μl的抗凝全血,在样品中加入600μl细胞裂解液CL,颠倒混匀,10 000rpm离心1min,吸去上清,留下细胞核沉淀。
5.2重复上述步骤一次。
5.3向离心收集到的细胞核沉淀中加200μl缓冲液GS,振荡至彻底混匀。
5.4加入20μl Proteinase K溶液,混匀。
5.5加入200μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,56℃放置10min,其间颠倒混匀数次,直至溶液应清亮。
5.6加200μl无水乙醇,充分颠倒混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
5.7将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入2ml收集管中),12 000rpm离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入新的2ml收集管中。
5.8向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD,12 000rpm离心30sec,倒掉收集管中的废液,再将吸附柱CB3放入新的2ml收集管中。
5.9向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW,12 000rpm离心30sec,倒掉收集管中的废液,再将吸附柱CB3放入新的2ml收集管中。
5.10重复操作步骤9。
5.11 12 000rpm离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
5.12将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加100μl洗脱缓冲液TB,室温放置2-5min,12 000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中。
5.13测定DNA浓度,疑似患者组:117ng/μl;正常对照组:102ng/μl,保存于-80℃冰箱。
6、利用三个基因内微卫星多态标志分析(本发明NF1基因STR标志引物序列见附表1)
6.1对疑似患者组和正常对照组的30例正常对照样本(统计杂合率专用)DNA进行PCR(227AC28.4、38TG53.0、27CAGT的引物序列见附表1)。根据实验结果27CAGT位点杂合子人数占总人数47.2%,27AC28.4位点杂合子人数占51%,38TG53.0位点杂合子人数占40%。利用上述27AC28.4、38TG53.0和27CAGT三对引物扩增,当三对引物实验结果均是纯合子时,判断NFI基因存在整个基因杂合性缺失的可能性。
(1)Intron36-IVS27AC28.4:
反应条件
(2)Intron36-IVS27CAGT
反应条件
(3)Intron47-IVS38TG53.0
反应条件
6.2PCR产物进行PAGE电泳:聚丙烯酰胺凝胶(8%)130ml配制
6.3以1×TBE作为电泳缓冲液,将PCR产物小心加到相应的凝胶孔中,100V电泳约4-5h。
6.4银染
①电泳完的聚丙烯酰胺凝胶用10%的酒精浸泡5分钟。
②弃酒精,加入1%HNO3,3分钟。
③弃HNO3,用清水清洗两次。
④加入AgNO3,染色20分钟。
⑤用ddH2O清洗一次。
⑥加入显影液,至可见清淅的DNA电泳条带为止。
⑦弃显影液,加入10%的乙酸定影5分钟。
⑧弃乙酸,在清水中浸泡5分钟以上。
⑨保存结果(见图1-3)。
结果分析:患者甲三个多态标志均为纯合子,其NFI基因存在整个基因杂合性缺失的可能性。3例正常人的三个多态标志均为杂合子。判断三个正常人未患有I型神经纤维瘤病。
实施例4
前述步骤与实施例3基本相同,所不同之处在于,对未检测到基因突变:c.7106G>A,p.W2369X,而存在整个基因杂合性缺失可能性的患者甲继续如下检测。
采用本发明NF1基因外显子缺失分析试剂盒进行检测,具体操作如下:
8、Real time PCR:(本发明Real time PCR引物序列见附表1)
8.1对NF1的exons 3、11、25、34、58进行Real time PCR,将DNA样品浓度稀释至5ng/μl为模板,反应体系参照下述配制,每份样品每次实验做3个复孔。
反应体系及条件:
反应条件如下:
8.2数据分析:分析方法为2-ΔΔCt法,结果见附表2。
附表2:Real time PCR数据分析
*待测样本的相对基因含量,0.5左右为缺失携带者,1左右表示正常个体。
结果分析:综上所述,患者甲在exon3、11、25、34和58片段读数均是正常对照的半数,据此判断患者甲为全基因缺失携带者,这与微卫星多态标志分析其存在NF1基因杂合性缺失(Loss of Heterozygosity,LOH)可能性的结果相互佐证。至此,患者甲诊断为I型神经纤维瘤病患者。
附表1:NF1基因STR标志引物、cDNA外套引物、cDNA巢式引物序列、Real time PCR引物序列共计35对,所有序列从上海生物工程公司订购,PAGE纯化。
实施例5
300例临床正常对照筛查未发现c.7106G>A,p.W2369X突变的存在,显示该突变在正常人群中罕见。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制,尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明,所属领域的普通技术人员依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换,而这些未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换,其均在申请待批的本发明的权利要求保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州艾诺医学检验所有限公司
<120> 一种I型神经纤维瘤病致病基因突变及基于此基因突变的病因学诊断试剂
<130> 2016
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gttctcaact taaatgtaag t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaacattaac aacaagtacc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taacaattgt ggaactgcag caattatt 28
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cccataccta gttcttaaag tctgt 25
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gagaacagcc tgggcaactt gc 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccaaccccaa ttagatctcc atttt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atggccgcgc acaggccggt ggaat 25
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<400> 8
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<213> 人工序列
<400> 9
atggtgaaac taattcatgc agat 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tgtcaaattc tgtgccttg 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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atggaagcag tagtttcact t 21
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
taggactttt gttcgctctg ctga 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggagtacacc aagtatcatg ag 22
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tatacggaga ctatctaaag tatgcag 27
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<212> DNA
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<400> 15
atggaggcat gcatgagaga tattc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tctgcacttg gcttgcggat 20
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<213> 人工序列
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gcgcacaggc cggtggaat 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgctgtttcc ttcaggagtc gtttt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tcctccatgg ccagcaagag ct 22
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<211> 22
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<213> 人工序列
<400> 21
acgtaaagca gcagtttggc ca 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tgctgggtgt gctccacaac c 21
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<213> 人工序列
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tgacaggaac ttctatctgc ctgct 25
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tcatgcagat ccaaagctct tgct 24
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ccgctgcatc ctgctgcact 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
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gatggcactg ctgaggcgca 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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aagcgattgc taggcccggt 20
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aggacttttg ttcgctctgc tga 23
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<213> 人工序列
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ggagtggcac tgcaagcaaa tgg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tctggcaaca tggcaaaccg g 21
机译: 检测BRAF基因突变和甲状腺癌的诊断试剂盒及BRAF基因突变的检测方法
机译: 一种非侵入性检测胎儿聋致病基因突变的方法和工具包
机译: 一种非侵入性检测胎儿聋致病基因突变的方法和工具包