一种用于制备近红外比率发光上转换纳米材料的化合物、制备方法及应用

摘要

本发明提供一种用于制备近红外比率发光上转换纳米材料的化合物、制备方法及其应用，该上转换纳米材料在pH从6.8至8.8发光表现出比率变化，具有pH传感的可逆性、很好的光和热稳定性、抗干扰性，适用于pH近红外比率的生物发光成像。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种化合物、制备方法及其在制备近红外比率发光上转换纳米材料中的应用。

背景技术

作为生物生理过程重要指标，pH变化和分布与细胞的很多生命活动如酶活性、细胞的生长与凋亡、离子迁移及平衡、钙的调控、细胞内吞作用等等相关，而当细胞内肿瘤细胞生成后细胞内pH分布也随之发生变化，如酸性环境可能与肿瘤细胞或者一些炎症相关。

荧光成像技术由于其检测具有非破坏性、高灵敏性、响应速度快、高信噪比等特点已经成为研究生物细胞中生物分子、路径和过程的重要工具。已经报道的pH的荧光探针包括有机分子(Wan，Q.；Chen，S.；Shi，W.；Li，L.；Ma，H.，Angew.Chem.，Int.Ed.2014，53，10916-10920；Yin，J.；Hu，Y.；Yoon，J.，Chem.Soc.Rev.2015，44，4619-4644.)、纳米发光材料(Benjaminsen，R.V.；Sun，H.；Henriksen，J.R.；Christensen，N.M.；Almdal，K.；Andresen，T.L.，ACS Nano 2011，5，5864-5873；Dennis，A.M.；Rhee，W.J.；Sotto，D.；Dublin，S.N.；Bao，G.，ACS Nano 2012，6，2917-2924；Zhou，K.；Wang，Y.；Huang，X.；Luby-Phelps，K.；Sumer，B.D.；Gao，J.，Angew.Chem.，Int.Ed.2011，50，6109-6114；Hu，J.；Liu，G.；Wang，C.；Liu，T.；Zhang，G.；Liu，S.，Biomacromolecules2014，15，(11)，4293-4301；Peng，J.；Xu，W.；Teoh，C.L.；Han，S.；Kim，B.；Samanta，A.；Er，J.C.；Wang，L.；Yuan，L.；Liu，X.；Chang，Y.-T.，J.Am.Chem.Soc.2015，137，2336-2342；Snee，P.T.；Somers，R.C.；Nair，G.；Zimmer，J.P.；Bawendi，M.G.；Nocera，D.G.，J.Am.Chem.Soc.2006，128，13320-13321；Shi，W.；Li，X.；Ma，H.，Angew.Chem.，Int.Ed.2012，51，6432-6435；Sun，S.；Ning，X.；Zhang，G.；Wang，Y.-C.；Peng，C.；Zheng，J.，Angew.Chem.，Int.Ed.2016，55，2421-2424.)等等。有机分子化学稳定性差、光漂白和光降解现象比较严重，并且荧光寿命较短，组织穿透能力差，激发波长短，破坏生物组织及生物体自身背景荧光干扰等问题，限制了其应用。纳米发光材料相比有机分子具有化学稳定性好、Stokes位移大、荧光量子产率高等优点，并且其激发处于近红外区域，减少了紫外光激发对细胞组织的损伤；具有较强的组织穿透能力，避免了生物组织自体荧光的干扰。但目前由于上转换纳米材料制备尺寸均一且粒径小、水溶性和生物相容性好的材料报道较少使得其在生物成像方面的应用收到了限制。

比率型荧光探针可以同时检测两个不同波长处的荧光强度，建立内部标度，可以克服单一荧光探针由于如仪器效率、检测环境、探针浓度等因素影响检测信号的问题。

发明内容

本发明目的在于提供有机分子修饰的多层上转换纳米材料，具有发光共振能量转移机理的近红外比率发光上转换纳米探针的制备方法，以及在pH分布的荧光成像方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种化合物1，其结构式如下：

所述化合物1的合成路线如下：

所述化合物1的合成方法，具体步骤如下：

称取4-羧基苯肼盐酸盐和氢氧化钠于茄形瓶中，加入适量的乙醇超声，室温条件下搅拌，溶解30min，随后将乙醇旋出，将剩余的固体转移至三口瓶中，加入冰乙酸溶解，再加入醋酸钠，超声溶解，最后加入3-甲基-2-丁酮，加热至回流，待反应完全后，停止反应，冷却至室温，减压蒸馏，旋出冰乙酸，用冰水冷却至0℃，慢慢加入饱和的碳酸钠溶液，直至没气泡产生为止，用盐酸调节pH＝4，用二氯甲烷萃取三次，收集油相，用无水硫酸钠干燥，抽滤，再旋出二氯甲烷，得红色油状物2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸(化合物3)；将2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸和碘甲烷溶解于乙腈中，混合物加热回流反应，冷却至室温，过滤旋蒸除去溶剂的得到产物2；将化合物2和对羟基苯甲醛溶解在乙醇中加热回流冷却至室温，过滤并用乙醇冲洗三次即得化合物1。

所述的化合物1在制备近红外比率发光上转换纳米材料中的应用，包括以下步骤：

1)合成α-NaGdF₄纳米颗粒

将Gd(CF₃COO)₃和CF₃COONa加入油酸、油胺和十八烯的混合物中，在三颈瓶中混合搅拌得悬浊液，悬浊液加热至110℃，真空下激烈搅拌除去水和氧气，然后升温至310℃，氮气环境下保持15分钟后冷却至室温，加入过量的乙醇沉降后离心机离心，即得α-NaGdF₄纳米颗粒；

2)合成β-NaGdF₄纳米颗粒

将α-NaGdF₄纳米颗粒分散到油酸和十八烯混合物中，然后加入Gd(CF₃COO)₃和CF₃COONa，混合物加热至110℃，真空下激烈搅拌除去水和氧气，然后溶液升温至310℃，氮气环境下保持30分钟后冷却至室温，加入过量的乙醇沉降后离心机离心，即得β-NaGdF₄纳米颗粒；

3)合成β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm纳米颗粒

将β-NaGdF₄纳米颗粒分散到油酸和十八烯混合物中，然后加入Y(CF₃COO)₃、Yb(CF₃COO)₃、Tm(CF₃COO)₃和CF₃COONa，除气后将溶液加热至310℃，氮气环境下保持30分钟后冷却至室温，加入过量的乙醇沉降后离心机离心，即得β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm纳米颗粒；

4)合成β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄纳米颗粒

将β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm纳米颗粒分散到油酸和十八烯混合物中，然后加入Y(CF₃COO)₃和CF₃COONa，除气后将溶液加热至310℃，氮气环境下保持30分钟后冷却至室温，加入过量的乙醇沉降后离心机离心，即得β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄纳米颗粒；

5)制备丙烯酸修饰的上转换纳米颗粒

将环己烷β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄纳米颗粒的胶状液体分散到N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和环己烷混合溶剂中，然后加入NOBF₄，搅拌30分钟后，将DMF相加入过量的甲苯离心沉降，产物分散入包含PAA的DMF，搅拌过夜，最后在加入过量的丙酮沉降后离心机离心，即得丙烯酸修饰的上转换纳米颗粒(PAA-UCNPs)；

6)组装近红外比率发光上转换纳米材料(PAA-UCNPs-1)

化合物1的DMSO(二甲基亚砜)溶液逐滴加入PAA-UCNPs环己烷溶液中，然后混合物室温下搅拌过夜，离心分离出固体，洗涤。

本发明产生的有益效果是：本发明的近红外比率发光上转换纳米材料在pH从6.8至8.8发光表现出比率变化，将其作为传感器，具有pH传感的可逆性好、光和热稳定性好、抗干扰性好等优点，适用于pH近红外比率的生物发光成像。

附图说明

图1为实施例1所得近红外比率发光上转换纳米材料示意图(不是真正的比例)；

图2为β-NaGdF₄(a)纳米粒子、β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm(b)纳米粒子、β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄(c)纳米粒子的透射电镜照片；(d)所制备的β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄纳米颗粒的高分辨透射电镜照片；(e)β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄纳米颗粒的暗场扫描透射电子显微镜照片；(f)聚丙烯酸(PAA)修饰的β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄纳米颗粒的透射电子显微镜照片；(g)不同pH值HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液的化合物1(1.0×10^-5M)的吸收光谱及980nm光激发下pH值为7.4的HEPES溶液中聚丙烯酸修饰的上转换纳米颗粒(0.15mg/mL)的发光光谱；

图3 980nm光激发下不同pH值DMSO-HEPES缓冲溶液(1∶9，v/v)近红外比率发光上转换纳米材料(PAA-UCNPs-1)(0.15mg/mL)的吸收光谱(a)和上转换发光光谱(b)；插图：近红外比率发光上转换纳米材料的上转换发光光谱从500到550nm；近红外比率发光上转换纳米材料(PAA-UCNPs-1)(0.15mg/mL)的吸收光谱(c)和上转换发光光谱(d)比率响应与pH值之间的线性关系；

图4(a)近红外比率发光上转换纳米材料(PAA-UCNPs-1)(0.15mg/mL)UCL₆₅₀/UCL₅₁₃发光强度比率循环。980nm激发下近红外比率发光上转换纳米材料(PAA-UCNPs-1)(0.15mg/mL)DMSO-HEPES缓冲溶液(1∶9，v/v，pH_app＝7.4)UCL₆₅₀/UCL₅₁₃温度变化的发光强度比率图(b)，980nm激发下时间变化的发光强度比率图(c).980nm激发下近红外比率发光上转换纳米材料(PAA-UCNPs-1)(0.15mg/mL)DMSO-HEPES缓冲溶液(1∶9，v/v，pH_app＝7.4)加入不同的分子(相对于化合物1的100当量分子)，激发波长为980nm，UCL₆₅₀和UCL₅₁₃表示650和513nm的复合上转换纳米颗粒发光强度，有机分子为Cys，Phe，Ala，Met，Pro，Gly，Hcy，Glu，GSH，H₂O₂，Arg，Lys，Leu，Tyr，Glc，Trp，Ser，Thr，Asp，Val，and>3+，Ca²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺，K⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Na⁺，Ni²⁺，pb²⁺，和Zn²⁺(e).阴离子为F^-，Cl>-，Br^-，I^-，S^2-，N₃^-，HS^-，AcO^-，CO₃^2-，NO₃^-，SO₃^2-，SO₄^2-，SiO₃^2-，PO₄^3-，ClO₃^-，ClO₄^-，C₂O₄^2-，S₂O₃^2-，P₂O₇^4-，HCO₃^-，HSO₃^-，HPO₄^2-，和H₂PO₄^-(f)；

图5 pH分别为6(a-e)，7(f-j)，8(k-o)，和9(p-t)的近红外比率发光上转换纳米材料(PAA-UCNPs-1)(0.15mg/mL)的HeLa细胞的共聚焦显微镜照片，激发波长为980nm；525/50滤片绿色通道(第一列)，595/50滤片的红色通道(第二列)和第一列和第二列叠加(第三列)的照片，上述两个通道的比率照片(第四列)和相应的对比照片(第五列)，I_green/I_red的比率值由pH>

图6所制备的β-NaGdF₄(核)，β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm(核@壳)和β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄(核@壳@壳)纳米颗粒的XRD图样；

图7油酸修饰的上转换纳米颗粒(OA-UCNPs)和相同浓度下的聚丙烯酸修饰的上转换纳米颗粒(citric-UCNPs)的发射光谱；

图8化合物1，PAA-UCNPs-1和PAA-UCNPs红外光谱；

图9近红外比率发光上转换纳米材料(PAA-UCNPs-1)的化合物1浓度与紫外可见光谱强度关系；535nm处的吸收与强度关系图(插图)，近红外比率发光上转换纳米材料(PAA-UCNPs-1)中化合物1的浓度为7.07wt％；

图10激发波长为980nm化合物1(1.0×10^-5M)在不同pH值下0.01M>

图11激发波长为980nm聚丙烯酸修饰的上转换纳米颗粒PAA-UCNPs(0.15mg/mL)不同pH值下在0.01M HEPES溶液中的上转换发光光谱；

图12基于归一化发射比率I₅₆₅/I₅₂₅的pH滴定图；

图13基于I₆₅₀/I₅₁₃比率的相关pH滴定图；

图14不同pH的近红外比率发光上转换纳米材料(PAA-UCNPs-1)发光光谱比率关系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做详细说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

化合物1采用如下合成路线：

称取4-羧基苯肼盐酸盐(500mg，2.46mmol)和氢氧化钠(98.5mg，2.46mmol)于100mL的茄形瓶中，加入适量的乙醇超声，室温条件下搅拌，溶解30min，随后将乙醇旋出，将剩余的固体转移至100mL三口瓶中，加入16mL冰乙酸溶解，再加入醋酸钠(405mg，4.94mmol)，超声溶解，最后加入3-甲基-2-丁酮(397μL，3.7mmol)，加热至100℃，回流16h。待反应完全后，停止反应，冷却至室温，减压蒸馏，旋出冰乙酸，用冰水冷却至0℃，慢慢加入饱和的碳酸钠溶液，直至没气泡产生为止，用盐酸调节pH＝4，用二氯甲烷萃取三次，收集油相，用无水硫酸钠干燥，抽滤，再旋出二氯甲烷，得红色油状物2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸(化合物3，405mg，产率为81％)。

将2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸(1.0g，4.93mmol)和碘甲烷(700mg，4.93mmol)溶解于10毫升乙腈中，混合物加热回流反应12小时，冷却至室温，过滤旋蒸除去溶剂的得到化合物2(0.76g，44.7％)。

表征如下：¹H>6，TMS)：δ_H>13C>6)：δ_C>

将化合物2(690mg，2.0mmol)和对羟基苯甲醛(244mg，2.0mmol)溶解在10mL乙醇中加热回流3小时冷却至室温，过滤并用乙醇冲洗三次得到最终产物(化合物1，318.6mg，31.6％)。

表征如下：HRMS(EI)m/z：calcd for C₂₀H₂₀NO₃[M-I]，322.1443；found，322.1442.¹H>6，TMS)：δ_H>13C>6)：δ_C183.80，167.08，164.30，155.91，145.69，143.86，134.60，131.16，130.87，126.53，124.20，117.03，115.13，109.76，52.26，34.69，and>

近红外比率发光上转换纳米材料的制备

1)合成α-NaGdF₄纳米颗粒

将Gd(CF₃COO)₃(1mmol)和CF₃COONa(1mmol)加入油酸、油胺和十八烯的混合物(40mmol，摩尔比：1∶1∶2)中，在100mL三颈瓶中混合搅拌，悬浊液加热至110℃，真空下激烈搅拌除去水和氧气，然后溶液升温至310℃，氮气环境下保持15分钟后冷却至室温，加入过量的乙醇沉降后离心机离心(7800转/分钟，10分钟)，得到α-NaGdF₄纳米颗粒，α-NaGdF₄纳米颗粒分散至10mL环己烷中保存。

2)合成β-NaGdF₄纳米颗粒

将5mL步骤1)所制备的α-NaGdF₄纳米颗粒的环己烷分散液，分散到油酸和十八烯混合物中(40mmol，摩尔比：1∶1)，然后加入0.5mmol>3COO)₃和0.5mmol>3COONa，混合物加热至110℃，真空下激烈搅拌除去水和氧气，然后溶液升温至310℃，氮气环境下保持30分钟后冷却至室温，加入过量的乙醇沉降后离心机离心(7800转/分钟，10分钟)，得到β-NaGdF₄纳米颗粒，β-NaGdF₄纳米颗粒分散至10mL环己烷中保存。

3)合成β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm纳米颗粒

将5mL步骤2)所制备的β-NaGdF₄纳米颗粒的环己烷液，分散到油酸和十八烯混合物中(40mmol，摩尔比：1∶1)，然后加入指定量的0.09mmol>3COO)₃、0.9mmol>3COO)₃、0.01mmol>3COO)₃和1mmol>3COONa，除气后将溶液加热至310℃，氮气环境下保持30分钟后冷却至室温，加入过量的乙醇沉降后离心机离心(7800转/分钟，10分钟)，得到β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm纳米颗粒，β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm纳米颗粒分散至10mL环己烷中保存。

4)合成β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄纳米颗粒

将5mL步骤3)所制备的β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm纳米颗粒的环己烷分散液，分散到油酸和十八烯混合物中(40mmol，摩尔比：1∶1)，然后加入1mmol>3COO)₃和1mmol>3COONa，除气后将溶液加热至310℃，氮气环境下保持30分钟后冷却至室温，加入过量的乙醇沉降后离心机离心(7800转/分钟，10分钟)，得到β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄纳米颗粒，β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄纳米颗粒分散至5mL环己烷中保存。

5)制备聚丙烯酸修饰的上转换纳米颗粒

将1mLβ-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄纳米颗粒的环己烷分散液，分散到5mL>4，搅拌30分钟后，将DMF相加入过量的甲苯离心沉降(18000转/分钟，15分钟)，产物分散入包含30mg>

6)组装近红外比率发光上转换纳米材料(PAA-UCNPs-1)

化合物1(0.03mmol)的DMSO(0.5mL)溶液逐滴加入PAA-UCNPs的环己烷溶液(1mg/mL)中，然后混合物室温下搅拌过夜，混合物离心后，反复用水/乙醇(v/v＝1∶1)洗涤固相，即为所述的近红外比率发光上转换纳米材料(所得近红外比率发光上转换纳米材料需在去离子水中分散保持)。

本实施例中制备的近红外比率发光上转换纳米材料作为荧光探针的应用

如图1所示近红外比率发光上转换纳米材料(pH值比率和基于发光共振能量转移的纳米传感器)由半菁染料改性核/壳/壳纳米粒子所得到，经过的β-NaGdF₄、β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm、β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄三个过程得到多层纳米粒子。图2中a～f为β-NaGdF₄、β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm、β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄透射电镜照片及β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄纳米颗粒的高分辨透射电镜照片、β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄纳米颗粒的暗场扫描透射电子显微镜照片及聚丙烯酸修饰的β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄纳米颗粒的透射电子显微镜照片；图2(g)显示的不同pH值(5.0、7.4、9.0)HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液的化合物1(1.0×10^-5M)的吸收光谱及980nm光激发下pH值为7.4的HEPES溶液中聚丙烯酸修饰的上转换纳米颗粒(0.15mg/mL)的发光光谱，说明聚丙烯酸修饰的上转换纳米颗粒的450和475nm的光可以被有机分子吸收，而513nm的光没有被吸收，不会发生变化。图3表明980nm光激发下不同pH>650/UCL₅₁₃发光强度比率可以随pH值循环，并且强度比率变化可以抗多种物质的干扰如图4，包括有机分子Cys，Phe，Ala，Met，Pro，Gly，Hcy，Glu，GSH，H₂O₂，Arg，Lys，Leu，Tyr，Glc，Trp，Ser，Thr，Asp，Val，and>3+，Ca²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺，K⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Na⁺，Ni²⁺，pb²⁺，和Zn²⁺以及阴离子F^-，Cl^-，Br^-，I^-，S^2-，N₃^-，HS^-，AcO^-，CO₃^2-，NO₃^-，SO₃^2-，SO₄^2-，SiO₃^2-，PO₄^3-，ClO₃^-，ClO₄^-，C₂O₄^2-，S₂O₃^2-，P₂O₇^4-，HCO₃^-，HSO₃^-，HPO₄^2-和H₂PO₄^-。如图5所示近红外比率发光上转换纳米材料(PAA-UCNPs-1)的HeLa细胞的共聚焦显微镜照片表现为比率变化的特点，I_green/I_red的比率值由pH>4(核)、β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm(核@壳)和β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄(核@壳@壳)纳米颗粒的XRD图样，为JCPDS>-1的峰归属于化合物1，表明化合物1与上转换纳米颗粒组装成功。图9由紫外可见光谱吸收峰强度得出：近红外比率发光上转换纳米材料(PAA-UCNPs-1)中化合物1的浓度为7.07wt％。图10为激发波长为980nm化合物1(1.0×10^-5M)在不同pH值下0.01M>565/I₅₂₅的pH滴定图，基于I₆₅₀/I₅₁₃比率的相关pH滴定图和不同pH的有机分子修饰的多层上转换纳米颗粒(PAA-UCNPs-1)发光光谱比率关系图。

综上所述，一种新型的pH敏感类菁化合物和聚丙烯酸(PAA)改性的核/壳/壳β-NaGdF₄@NaYF₄：Yb，Tm@NaYF₄上转换纳米颗粒成为基于发光共振能量转移的近红外比率发光pH纳米传感器。该纳米颗粒在pH从6.8至8.8发光表现出比率变化。该传感器具有pH传感的可逆性、很好的光和热稳定性、抗干扰性，适用于pH近红外比率的生物发光成像。