快速鉴别东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的分子生物学方法

摘要

本发明公开了一种快速鉴别东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的分子生物学方法，属于分子生物学领域。从待测对象中分离提取基因组DNA作为模板；分别以P1引物对和P2引物对进行PCR，得到片段A和B；片段A和B拼接剪切后得到COI基因全序列；依据本发明首次公开的东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的核苷酸序列特征变异位点进行物种鉴别。本发明首次实现了对东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的快速准确分子鉴定，弥补了传统形态鉴定方法的诸多不足。鉴定对象包括动物的静脉血、粪便、毛发或尿液样品，具有准确、迅速、便捷的特点，对于维护生态系统和保护生物多样性具有重要的作用和意义。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体是涉及一种可以快速鉴别东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的分子生物学方法。

背景技术

长臂猿科(Hylobatidae)现有4属17种，中国分布有3属6种，分别是白眉长臂猿属里的东白眉长臂猿(Hoolock leuconedys,Eastern hoolock gibbon)、白颊长臂猿属的北白颊长臂猿(Nomascus leucogenys)、西黑冠长臂猿(N.concolor)、东黑冠长臂猿(N.nasutus)、海南长臂猿(N.hainanus)和长臂猿属里的白掌长臂猿(Hylobates lar)。

东白眉长臂猿和北白颊长臂猿均分布于中国云南省，前者见于德宏州和保山市；后者见于西双版纳的勐腊和绿春黄连山。近年来，由于栖息生境的缩小和变化，偷猎狩猎等犯罪行为频发，两种长臂猿种群处于下降趋势，都已被列为国家一级重点保护野生动物和世界自然保护联盟(IUCN)濒危等级。

边贸动物走私消费中，野生动物主要用途是食用、药用、观赏娱乐，或者被制成工艺品和装饰品。但出入境动物检疫和森林公安等相关部门面临一个严重的问题是：如何开展这些珍稀濒危野生动破碎零散组织、器官和残缺个体以及加工产品的快速准确鉴别？现实情况是，很多案件由于材料鉴定困难而不能及时给予犯罪分子应有的惩罚。从云南省公安边防总队获悉，东白眉长臂猿和北白颊长臂猿由于都分布于云南，经常被与其他野生猿猴一起混同走私，同时，所查获的走私物证中，鲜有完整的活体，大部分为零散组织器官(如头骨)或经过加工如漂白染色的皮毛，形态特征的不完整常导致无法准确鉴定，严重影响了案件办理的时效性和打击效果。因此，如何快速准确鉴定两种珍稀濒危长臂猿，不仅为出入境动物检疫和森林公安等相关部门提供强有力的技术支撑，同时也为两种长臂猿的研究和保护提供了有效的辅助支持。

传统的长臂猿鉴定方法主要依赖于它们的形态特征。以东白眉长臂猿为 例，其雌雄异色，雄性褐黑色或暗褐色，成年雄性具有两条明显分开的白色眉毛；雌性大部灰白或灰黄色，眼眉更为浅淡。而北白颊长臂猿身体纤细，雄性黑色，唯两颊各具一大型白斑，顶部的簇状冠毛显得更尖长而明显。雌性暗褐色冠斑呈三角形。躯体大部污黄色，胸腹的黑褐色稀少。

传统的形态鉴定虽然鲜明直观，但存在较大的局限：(1)珍稀濒危物种的种群生存状况十分脆弱，数量极其有限；(2)难以实现针对破碎零散组织、器官和残缺个体以及加工产品的鉴别；(3)鉴定珍稀濒危动物只能依赖经验丰富的分类专家，可现实是分类专家越来越少。随着生物多样性保护工作的开展，珍稀濒危动物的保护力度逐渐加强，亟需寻求一种新的鉴定方法，以弥补传统方法的缺陷。

二十世纪九十年代，随着分子生物学的迅速发展，尤其是PCR技术的日趋完善，越来越多的分子生物学技术应用于物种鉴定和分类。

其中，最常用的分子标记是线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(Cytochrome Coxidase I，COI)的序列。它可以检测物种间及同种个体间的细微差别，为近缘种及种下阶元的分类鉴定提供了新的手段，不受材料不完整性和发育阶段等方面的局限，弥补了传统形态鉴定的诸多不足，成为物种鉴定的首选。

目前，Genbank中只有北白颊长臂猿的线粒体全基因组序列(NC_021957)和西白眉长臂猿(Hoolock hoolock，western hoolock gibbon)的cytb序列(Y13304，长1141bp)，Genbank中无东白眉长臂猿的任何基因序列，国内外也尚无利用COI基因片段作为分子标记区别鉴定东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种能够快捷、准确地对东白眉长臂猿和北白颊长臂猿进行区别鉴定的分子生物学方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

一种快速鉴别东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的分子生物学方法，包括下述顺序的步骤：

(1)从待测对象中分离提取基因组DNA；

(2)利用两组PCR引物对待测对象的COI基因全序列进行PCR扩增：

所述的两组PCR引物的引物序列分别为：

P1F：5'‐AACCGAACGCAAATCA‐3'，

P1R：5'‐TCTCGGGCTACACTTT‐3'；

P2F：5'‐TCCGCTGGCAGGAAACT‐3'，

P2R：5'‐CTTTCCACGACCACGCC‐3'；

以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，以所述的P1F和P1R为引物对进行PCR，得到片段A PCR产物；以所述的P2F和P2R为引物对进行PCR，得到片段B PCR产物；

(3)将扩增良好的片段A PCR产物和片段B PCR产物送生物公司测序后，将片段A和片段B拼接，截去COI基因全序列前后多余的碱基，即得到待测对象的COI基因全序列；

(4)依据下表所列的核苷酸序列特征变异位点进行物种鉴别：

东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的核苷酸序列特征变异位点

表中位点的序号以本片段核苷酸位置为基准；表中字母“M”为东白眉长臂猿的简写；字母“J”为北白颊长臂猿的简写；相关的简并碱基代码为R＝(A/G)，Y＝(C/T)。

步骤(2)中所述的PCR反应体系为50μl，其中模板DNA 25ng，1×PCR buffer，2.5mMMgcl₂，1mM>

所述的待测对象包括动物的静脉血、粪便、毛发或尿液样品。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明依据首次公开的东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的核苷酸序列特征变异位点实现了对两种长臂猿的快速准确鉴定，弥补了传统形态鉴定方法的诸多不足。

2.本发明可以鉴定经过加工的、无法从传统的形态学上加以识别、残缺或部分降解的东白眉长臂猿和北白颊长臂猿样品，具有准确、迅速、便捷的特点，通常2天即可完成。能减少和避免野生动物尤其是活体运送困难，经费需求大，保存管理难等问题，为及时有效地鉴定提供强有力的技术支撑。最终，极大地提高出入境动物检疫和森林公安相关部门的办事办案效率；有利于提升打击各类野生动物资源的违法犯罪活动的力度和效果；在维持生态系统和保护生物多样性方面起着重要的作用和贡献。

3.同时，由于东白眉长臂猿和北白颊长臂猿均为国家一级重点保护动物和世界自然保护联盟(IUCN)濒危等级动物，本发明公开的COI基因序列特征变异位点，可为非损伤性取样(non‐invasive sampling)获得的东白眉长臂猿和北白颊长臂猿样品提供标尺，在野生濒危物种的生境栖息研究和保护方面尤显重要。

附图说明

图1.本发明实验中所尝试的现有通用引物PCR扩增结果的电泳图谱(部分图谱)。

图2.基于白掌长臂猿(NC_002082)线粒体全基因组序列，本发明自行设计的两组PCR引物位置。

引物P1(下划线标注)全长为1503bp，这对引物包含CO1序列的1214bp。正向引物位于CO1基因序列起始密码子前289bp处；反向引物位于CO1基因序列的1198bp处。

引物P2(波浪线标注)全长为1375bp，这对引物包含CO1序列的1153bp。正向引物位于CO1基因序列的389bp处；反向引物位于CO1基因序列后205bp处。

图3.东白眉长臂猿“贝贝”、“瓜瓜”和北白颊长臂猿“乐乐”、“微微”基于本发明的两组引物PCR扩增结果的电泳图谱。

图中电泳孔道1～4为引物P1扩增结果；电泳孔道5～8为引物P2扩增结果。电泳孔道1和5样本来源为东白眉长臂猿“贝贝”(静脉血)；电泳孔道2和6样本来源为东白眉长臂猿“瓜瓜”(粪便)；电泳孔道3和7样本来源为北白颊长臂猿“乐乐”(静脉血)；电泳孔道4和8样本来源为北白颊长臂猿“微微”(粪便)。

图4.利用非损伤性取样法(粪便、毛发和尿液)获得的东白眉长臂猿“贝贝”样品，基于本发明的两组引物PCR扩增结果的电泳图谱。

图中电泳孔道1～3为引物P1扩增结果；电泳孔道4～6为引物P2扩增结果。电泳孔道1和4样本来源为东白眉长臂猿“贝贝”(粪便)；电泳孔道2和5样本来源为东白眉长臂猿“贝贝”(毛发)；电泳孔道3和6样本来源为东白眉长臂猿“贝贝”(尿液)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。但附图和实施例并不是对本发明的限定。

实施例1

1.样本的采集与保存

本发明实验中所用样本为四个，其中东白眉长臂猿两只，“贝贝”和“瓜瓜”；北白颊长臂猿两只，“乐乐”和“微微”。样本详细情况见表1。

表1.本发明实验中所用样本情况。

1.1血液样本

样本来源为东白眉长臂猿“贝贝”和北白颊长臂猿“乐乐”，采集新鲜的静脉血。东白眉长臂猿“贝贝”，雌性，9岁，2015年在云南省德宏州境内由云南省野生动物收容拯救中心救助。北白颊长臂猿“乐乐”，雌性，18岁，2006年在云南省西双版纳州境内由云南省野生动物收容拯救中心救助。两种长臂猿的形态鉴定由中科院昆明动物所专家完成，目前均饲养于云南野生动物园。

用新的抗凝采血管采集新鲜的东白眉长臂猿和北白颊长臂猿全血(静脉血)1ml(毫升)，取300ul(微升)放入事先高温高压蒸汽灭菌消毒处理过的1.5ml Eppendrof离心管内，保存于冰箱冷冻层(‐20℃)，用于DNA提取。其余血液样本保存于西南林业大学动物教研室超低温冰箱内(‐80℃)。需要注意的是，目前市面上已经有抗凝采血管，故不需要加入肝素等抗凝试剂。

1.2粪便样本

所谓非损伤性取样法，就是在不伤害、不捕获、不触及甚至是未亲眼见到动物本身的情况下，通过收集动物遗留下的粪便、尿液、脱落的毛发或羽毛、卵壳、食物残渣(含有口腔脱落细胞)，鳞片等不同形式的分析样品而进行遗传分析的一种取样方法。随着生物多样性保护工作的开展，珍稀濒危动物的保护力度逐渐加强，非损伤性取样法在动物保护遗传学研究领域中得到了极其广泛的应用。

粪便的非损伤性取样最具有潜在价值，它是所有非损伤性取样中最简单而且对野生动物影响最小的一种取样方法。

样本来源为东白眉长臂猿“瓜瓜”和北白颊长臂猿“微微”，采集新鲜的粪便。东白眉长臂猿“瓜瓜”，雄性，成年(年龄不详)，来自德宏州，2011年起饲养于云南野生动物园。北白颊长臂猿“微微”，雄性，成年(年龄不详)，来自西双版纳州，2010年起饲养于云南野生动物园。收集东 白眉长臂猿“瓜瓜”和北白颊长臂猿“微微”新鲜的粪便表面富含黏膜部分(带上手套和口罩，以避免人对样品的污染)，使用2倍体积的100％乙醇保存。

1.3毛发样本

样本来源为东白眉长臂猿“贝贝”。捡拾带毛囊的脱落毛发，带回实验室后于‐80℃保存，备用。

取毛发5根，剪下毛根部，分别用双蒸水和无水乙醇浸洗，加人0.5ml TEN，含2％SDS、40mmol/L DTT，15ul蛋白酶K，37℃水浴保温过夜，充分裂解。按常规酚仿抽提法提取DNA。

1.4尿液样本

样本来源为东白眉长臂猿“贝贝”。采样前一天在笼内地上铺好农用薄膜；第二天收集尿液，带回实验室后于‐80℃保存，备用。

2.样本DNA的提取

2.1血液样本DNA提取

参照标准酚‐氯仿法(the standard phenol/chloroform protocol)或直接利用DNA抽提试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)提取。整个DNA提取过程中，注意动作轻缓柔和，特别是在DNA的析出的步骤中，切勿剧烈震荡，以免DNA断裂成小片段，导致DNA分子不能形成絮状沉淀，最终影响提取DNA的质量和浓度。

2.2粪便DNA提取

参考王跃峰等(2006)方法，并稍做改进，具体步骤如下：

(1)充分混匀酒精浸泡的粪样，用移液器吸取1mL细小的粪便沉淀至2mLEppendrof离心管。

(2)加入1.5mL无水乙醇，混匀后离心，倾去上清；重复多次至上清无色。

(3)加入1.5mL高纯水，混匀后离心，去上清；重复多次至上清无色。

(4)加入400uL消化液(10mmol/L Tris‐HCI，pH8.0；0.1mol/L EDTA，pH8.O；5g/LSDS)55℃水浴5h。

(5)消化后10000r/min离心5min，取上清注入有0.6g淀粉的离心管，摇匀后离心。

(6)取上清入新Eppendrof离心管，加入200uL CTAB buffer(100mmol/L Tris‐HCl，pH 8，1.4mol/L NaCI，20mmol/L EDTA，2％CTAB)，70℃水浴20min。

(7)加入等体积的酚/氯仿‐异戊醇抽提10min，10000r/min离心，吸取上清入新离心管；重复2～3次。

(8)使用PCR产物纯化试剂盒E.Z.N.A.Cycle pure Kit(USA，Omega Bio‐Tek公司)纯化抽提产物，纯化产物用100uL超纯水洗脱，一20℃保存。

2.3毛发DNA提取

取东白眉长臂猿毛发5根，剪下毛根部，分别用双蒸水和无水乙醇浸洗，加人0.5mlTEN，含2％SDS、40mmol/L DTT，15ul蛋白酶K，37℃水浴保温过夜，充分裂解。按常规酚仿抽提法提取DNA。

2.4尿液DNA提取

尿液DNA提取参考陈荣华等(2005)chelex‐100方法。

3.引物的引用

实验初期，我们拟引用国内外相关文献中通用的DNA条形码引物扩增东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的DNA条形码基因序列。我们所尝试的引物序列如表2所示。

表2.本发明实验中所尝试的引物序列。

在使用陈翠萍(2012)的引物尝试时，我们除使用两对引物扩增外，对于两对引物无法成功扩增的样品，还采用混合引物序列进行扩增。除了按照文献中所提供的PCR扩增条件和PCR反应体系进行扩增外，我们还用了以下PCR扩增条件和PCR反应体系进行扩增。

①PCR反应体系为50μl，其中模板DNA约25ng，1×PCR buffer，2.5mM Mgcl₂，1mMdNTP，2μg/μl>

②PCR反应条件如下：95℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，50/52/55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。35个循环后，72℃再延伸10分钟。

取5ul PCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳(130V电压，电泳35min)。Gelview染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图1。图1中：Marker条带从上到下依次为5K、3K、2K、1K、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp条带浓度约20ng/ul,其它条带浓度约10ng/ul。

胶图中电泳孔号、PCR扩增所用引物及退火温度见表3。

表3.电泳图谱附图1中电泳孔号、PCR扩增所用引物及退火温度。

电泳孔号PCR扩增引物退火温度1LepF+LepR502LCO1490+HCO2198503LepF1_t1+LepR1_t1504VF1d_t1+VR1d_t1505LepF1_t1+LepR1_t1+VF1d_t1+VR1d_t1506LepF+LepR527LCO1490+HCO2198528LepF1_t1+LepR1_t1529VF1d_t1+VR1d_t15210LepF1_t1+LepR1_t1+VF1d_t1+VR1d_t15211LepF+LepR5512LCO1490+HCO219855

但遗憾的是，经过多次反复调整PCR反应体系和PCR扩增条件，均未能获得目的扩增条带。

4.引物的设计

从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开数据库下载长臂猿科长臂猿属白掌长臂猿(Hylobates lar，GenBank accession number.NC_002082)的线粒体全基因组序列，利用Primer5软件人工设计引物，引物用Primer5软件检查引物错配、二聚体和发夹结构后，自行设计出两组引物，引物序列为：

P1F正向引物为：5'‐AACCGAACGCAAATCA‐3'，

P1R反向引物为：5'‐TCTCGGGCTACACTTT‐3'；

P2F正向引物为：5'‐TCCGCTGGCAGGAAACT‐3',

P2R反向引物为：5'‐CTTTCCACGACCACGCC‐3'。

两组引物具体位置参见附图2。

引物P1(下划线标注)全长为1503bp，这对引物包含CO1序列的1214bp。正向引物位于CO1基因序列起始密码子前289bp处；反向引物位于CO1基因序列的1198bp处。

引物P2(波浪线标注)全长为1375bp，这对引物包含CO1序列的1153bp。正向引物位于CO1基因序列的389bp处；反向引物位于CO1基因序列后205bp处。

5.PCR扩增反应体系及反应条件

①PCR反应体系为50μl，其中模板DNA约25ng，1×PCR buffer，2.5mM Mgcl₂，1mMdNTP，2μg/μl>

②PCR反应条件如下：95℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。35个循环后，72℃再延伸10分钟。退火温度变化范围为50℃～55℃。

取5ul PCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳(130V电压，电泳35min)。Gelview染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图3和附图4。附图3 和附图4中：Marker条带从上到下依次为5K、3K、2K、1K、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp条带浓度约20ng/ul,其它条带浓度约10ng/ul。

6.基因序列测定

选取3‐5个扩增效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序(测序所用引物与PCR所用引物相同)。测序反应按厂家建议的条件，使用Applied公司的BigDyeTerminator kit(V2.0)在ABI 377自动测序仪(Applied Biosystems)上电泳测序。正、反链均测。

通过P1F和P1R为引物对进行PCR，得到片段A；通过P2F和P2R为引物对进行PCR，得到片段B。将片段A和片段B拼接后，与网上下载的白掌长臂猿(NC_002082)对应序列在MEGA软件包中Clustal W软件进行序列对比，找到起始密码子ATG和终止密码子，截去COI基因全序列前后多余的碱基，即得到待测样本的COI基因全序列。详见基因序列表。

7.序列的甄别

许多脊椎动物在扩增测序后获得的目的线粒体基因片段里都曾发现线粒体假基因(Numts或mitochondrial pseudogenes)的存在，尤其是灵长类里甚为普遍(Jayaprakash等，2015；Calvignac等，2011)。因此，在获得数据后，序列的甄别十分重要。我们获得的序列，碱基组成具有强烈的偏好性，碱基G只占较小的百分比(16.7～16.8％)。编码区密码子的第二位碱基组成中，T或C占了较高的百分比(40％和25.5～25.9％)，且氨基酸翻译过程中未出现终止密码子。基于以上特征，说明我们获得的序列是线粒体基因片段。

8.依据序列特征变异位点进行物种鉴别

经测序仪分析的电泳图谱用DNASTAR中的Seqman结合人工作正反链拼接。本发明实验共获得四条序列，两条东白眉长臂猿序列，“贝贝”和“瓜瓜”；两条北白颊长臂猿序列，“乐乐”和“微微”。

下载北白颊长臂猿的线粒体全基因组序列(NC_021957)对应的COI基因片段后，连同本发明实验获得的四条序列共五条序列进行分析。五条序列用Clustal W排序，序列变异分析用MEGA 2.1进行，得到表5。

表5.东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的核苷酸序列特征变异位点。位点的序号以本片 段核苷酸位置为基准。表中字母“M”为东白眉长臂猿的简写；字母“J”为北白颊长臂猿的简写。相关的简并碱基(degenerate bases)代码为R＝(A/G)，Y＝(C/T)。

表5显示了东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的核苷酸序列特征变异位点。变异位点的位置读法为表头数字从上而下读，如东白眉长臂猿和北白颊长臂猿COI基因全序列的第一个变异位点为核苷酸10号位置，第二个变异位点为核苷酸序列的42号位置，以此类推，最后一个变异位点为核苷酸序列的1541号位置。

具体鉴别时，将待测对象的COI基因序列直接与表5进行比对。我们选5个变异位点为例加以说明。在10、42、60、61、66号变异位点，我们发现核苷酸序列为ATGTC的为东白眉长臂猿；GCACY为北白颊长臂猿，其中，Y既可以是C也可以是T，均是北白颊长臂猿。其余简并碱基同理。如果既不 是ATGTC，也不是GCACY的待测对象，则表明既不是东白眉长臂猿也不是北白颊长臂猿。我们将根据这些变异位点来进行经过加工的、无法从传统的形态学上加以识别、残缺或部分降解的东白眉长臂猿和北白颊长臂猿样品。

实施例2

待测对象为肌肉组织一块，面积约为0.3×0.4cm，重约1.6g，由云南省森林公安局提供，怀疑是东白眉长臂猿和北白颊长臂猿中的一种。

取待测对象100mg左右于样品管中，用干净的剪刀将组织块剪碎。直接利用DNA抽提试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)提取。提取过程中，需要稍微多加点Rnase A，尽量减少RNA残留，以保证DNA质量。

PCR扩增反应体系、PCR反应条件及基因序列测定均与实施例1中的样本一致。

将待测对象的COI基因序列直接与表5进行比对。例如，首先看核苷酸10号位置，结果显示，待测对象碱基为“A”；其次看核苷酸42号位置，待测对象碱基为“T”。以此类推，最终我们可得出结论，该肌肉组织样本来源为东白眉长臂猿。

实施例3

待测对象为皮毛一张，面积约为1.3×1.6cm，由云南省森林公安局提供，怀疑是东白眉长臂猿和北白颊长臂猿中的一种。

毛发DNA提取、PCR扩增反应体系、PCR反应条件及基因序列测定均与实施例1中的样本一致。

将待测对象的COI基因序列直接与表5进行比对。例如，首先看核苷酸10号位置，结果显示，待测对象碱基为“G”；其次看核苷酸42号位置，待测对象碱基为“C”。以此类推，最终我们可得出结论，该皮毛组织样本来源为北白颊长臂猿。

实施例4

为比较共同分布于中国的3个属长臂猿，除本发明公开的东白眉长臂猿(白眉长臂猿属)和北白颊长臂猿(冠长臂猿属)的COI基因全序列外，从NCBI公开数据库下载长臂猿属的白掌长臂猿(Hylobates lar，GenBank accession number.NC_002082)对应的COI基因序列。

将白掌长臂猿对应的COI基因序列直接与表5进行比对。例如，白掌长臂猿核苷酸10、42、60、61、66号变异位点为GTACT，既不是ATGTC(东白眉长臂猿)，也不是GCACY(北白颊长臂猿)，则表明样本来源既不是东白眉长臂猿也不是北白颊长臂猿。