一种实时检测烟气暴露条件下动物脑内单胺类神经递质变化的方法

摘要

一种实时检测烟气暴露条件下动物脑内单胺类神经递质变化的方法，其特征在于：采用动物口鼻式吸入烟气暴露系统将动物实时暴露于烟气中，通过在线微透析技术收集动物脑组织样品，再利用高效液相色谱‑库仑阵列电化学检测器对脑透析液样品中的单胺类神经递质及其代谢物进行快速分析，从而实时监测烟气暴露前后动物脑内单胺类神经递质的变化特征。本方法对动物的烟气暴露更加接近于人类吸食烟草制品的方式，克服了无法实时模拟、评价烟气吸入（烟碱摄入）引起的单胺神经递质变化的技术难题，具有操作简便、结果准确可靠等优点，与现有技术相比取得了明显进步，开创了一种新的用于烟气暴露后动物脑内单胺类神经递质代谢变化的监测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及实时检测烟气暴露条件下动物脑内单胺类神经递质变化分析的方法，本方法通过在线微透析技术收集实时暴露于烟气中的实验动物脑组织样品，再利用高效液相色谱-库仑阵列电化学检测器对脑透析液样品中的单胺类神经递质及其代谢物进行快速的在线分析，从而实时评价烟气吸入暴露前后单胺类神经递质的变化特征。

背景技术

卷烟烟气和电子烟气溶胶都含有烟草的重要特征成分——烟碱（Nicotine）。烟碱依赖的发生是吸烟成瘾的主要原因，也是持续吸食烟草制品进而危害健康的根本原因。摄入体内的烟碱能迅速透过血脑屏障并广泛分布于脑组织各区域，其主要作用于中脑边缘多巴胺（Dopamine, DA）系统而产生奖赏效应。事实上，包括DA、5-羟色胺（5-HT）等单胺类神经递质都参与了烟碱神经药理学效应的发生过程。因此，开发一种新的检测方法能够对烟气暴露引起的动物脑内单胺类神经递质的释放及代谢变化进行准确测定和实时评价，将为揭示吸烟成瘾的发生机理提供重要的手段支撑。

生物样品中单胺类神经递质的测定多采用高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD），其中高效液相色谱-库仑阵列电化学检测器因其多通道响应而呈现出的高选择性和高灵敏度，应用较为广泛。采用在线微透析技术(Online microdialysis)与HPLC-ECD联用可以实现对DA、5-HT等单胺类神经递质的活体、动态测定，但是该方法仅能评价药物暴露（如烟碱注射）之后引起的单胺类神经递质含量变化；采用动物整体暴露吸入烟气（将动物置于密闭的烟气舱内）的暴露方式亦无法同步完成烟气实时暴露和动物脑内单胺类神经递质的在线测定。

发明内容

本发明正是针对目前无法同步实现烟气吸入暴露和单胺类神经递质在线测定的不足，而专门开发的一种实时监测烟气暴露条件下动物脑内单胺类神经递质变化的分析方法。本方法通过利用改造后的实验动物鼻部吸入暴露夹持器实现了动物口鼻式烟气暴露系统与微透析系统的联用，进而通过采用在线微透析与高效液相色谱-库仑阵列电化学检测器联用技术实现了对烟气吸入暴露实验动物脑组织样品的实时采集与在线测定，达到了烟气吸入暴露与脑内单胺类神经递质变化测定同步进行的技术要求。在本方法中，实验动物采用了仅口鼻吸入（nose-only）的方式暴露于烟气中，更加接近于人类吸食烟草制品的方式，克服了无法实时评价烟气吸入（烟碱摄入）引起的单胺神经递质变化的技术难题，具有操作简便、结果准确可靠等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种实时检测烟气暴露条件下动物脑内单胺类神经递质变化的方法，采用动物口鼻式吸入烟气暴露系统将动物实时暴露于烟气中，通过在线微透析技术收集动物脑组织样品，再利用高效液相色谱-库仑阵列电化学检测器对脑透析液样品中的单胺类神经递质及其代谢物进行快速分析，从而实时监测烟气暴露前后动物脑内单胺类神经递质的变化特征,进而根据样品中DA、5-HT及其代谢物的分析检测结果实时评价烟气暴露引起的脑内单胺类神经递质变化规律。

该方法具体步骤如下：

a. 烟气暴露：利用吸烟机抽吸卷烟或采用气溶胶发生器使电子烟液产生气溶胶，将头部装有微透析探针导管的动物放入一个专用的实验动物固定夹持器，以使该夹持器挟持动物仅以口鼻吸入方式暴露于一定浓度的烟气中；

b. 脑微透析样品收集：运行微透析系统后将微透析探针插入动物头部的导管中连续收集动物脑透析液于在线进样器的定量环中，每隔一定时间通过在线进样器自动注入运行的高效液相色谱中。

c. 高效液相色谱-库仑阵列电化学检测器分析：设定梯度洗脱程序和进样序列并运行高效液相色谱-库仑阵列电化学检测器检测微透析样品，使得每个样品的检测时间略小于该样品的收集时间。

d. 标准溶液配制及标准曲线绘制：分别称取DA、3,4‒二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-HT和5‒羟吲哚乙酸(5-HIAA) 5种标准品各10mg，分别置于100mL容量瓶中，用甲醇/水溶液（20:80，体积比，下同）溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度各为100μg/mL的标准储备溶液；分别移取1.0mL的标准储备溶液，置于同一支100mL容量瓶中，用甲醇/水稀释至刻度，摇匀，得浓度各为1.0 μg/mL的一级混合标准溶液；准确移取0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.0和50.0mL一级混合标准溶液，分别置于不同的100mL容量瓶中，用复方氯化钠注射液稀释至刻度，摇匀，得到浓度均0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0和500.0ng/mL的系列混合标准溶液。将系列混合标准溶液按由低到高的浓度顺序进行高效液相色谱-库仑阵列电化学检测器分析，以各目标分析物的色谱峰面积（Y）对其相应的浓度（X）进行线性回归，得到标准曲线回归方程。

e. 数据分析及处理：根据标准曲线法计算透析液样品中各目标物的含量，依据结果分别绘制烟气暴露前、后各时间点脑内单胺类神经递质及其代谢物的浓度-时间变化曲线，揭示烟气暴露引起脑内单胺类神经递质变化的规律。

本发明一方面利用动物口鼻式烟气暴露系统，能够以更加接近于人类吸食烟草制品的方式使动物通过仅鼻吸入的方式暴露于烟气中，另一方面还利用在线微透析与高效液相色谱-库仑阵列电化学检测器联用技术，不仅能实时获得暴露于烟气中的动物脑部样品并实现在线检测单胺类神经递质，同时还具有灵敏度高、取样间隔时间短和分析速度快等特点。利用本发明的技术方案不仅能同时检测出动物脑内5种单胺类神经递质化合物，还实现了烟气暴露时引起动物脑内单胺类神经递质变化的在线、动态测定，与现有技术相比取得了明显进步，开创了一种新的用于烟气暴露后动物脑内单胺类神经递质代谢变化的监测方法。

附图说明

图1为本发明测试方式示意图。

图1中序号：1为微透析灌流泵，2为位于夹持器中仅通过口鼻式吸入烟气的动物，3为微透析探针，4为在线自动进样器，5为高效液相色谱-库仑阵列电化学检测器系统）。

图2为大鼠脑微透析样品中5种目标物的HPLC-ECD检测图谱；

图中：a. DA；b. 5-HT；c. DOPAC；d. 5-HIAA；e. HVA。

图3为卷烟烟气暴露前后大鼠脑内DA的浓度-时间变化趋势图。

图4为卷烟烟气暴露前后大鼠脑内DOPAC的浓度-时间变化趋势图。

图5为卷烟烟气暴露前后大鼠脑内HVA的浓度-时间变化趋势图。

图6为卷烟烟气暴露前后大鼠脑内5-HT的浓度-时间变化趋势图。

图7为卷烟烟气暴露前后大鼠脑内5-HIAA的浓度-时间变化趋势图。

图8为电子烟烟气暴露前后大鼠脑内DA的浓度-时间变化趋势图。

图9为电子烟烟气暴露前后大鼠脑内DOPAC的浓度-时间变化趋势图。

图10为电子烟烟气暴露前后大鼠脑内HVA的浓度-时间变化趋势图。

图11为电子烟烟气暴露前后大鼠脑内5-HT的浓度-时间变化趋势图。

图12为电子烟烟气暴露前后大鼠脑内5-HIAA的浓度-时间变化趋势图。

图13为本发明专用的实验动物固定夹持器结构示意图。

图中：2-1为前端口，2-2为脑微透析取样天窗，2-3为头部固定腔，2-4为身部固定腔，2-5为推杆，2-6为端盖，2-7为固定螺帽，2-8为弧形推送头。

具体实施方式

本发明结合以下实施例做进一步描述，但并不限制本发明。

1.实验材料：雄性成年SD正常大鼠，10周龄，体重（200 ± 20）g，采用独立隔离饲养笼具饲养，自由进水，标准颗粒进食。

2. 主要实验器材：动物口鼻吸入烟气暴露设备，包含转盘式吸烟机、气溶胶发生器和动物口鼻吸入暴露装置（HRH-MNE63150，北京慧荣和公司）； 微透析系统(包括CMA/402微透析泵、CMA on-line injector在线自动进样器、CMA 12微透析探针及导管，瑞典CMA公司)；SN-1N型脑立体定位仪(日本Narishige公司)；高效液相色谱-库仑阵列电化学检测器（ 5600A CoulArray，美国Thermo公司）；改造后的实验动物鼻部吸入暴露夹持器结构参见图13（并另行申请专利）。

3. 实验方法：本发明的方法包括以下步骤：

（1）微透析探针导管脑部植入：大鼠称重后，以20%氨基甲酸乙酯溶液按1.25 g/kg剂量腹腔注射麻醉，固定在立体定位仪上，开颅去除部分硬脑膜，依定位坐标(AP：+2.5 mm；ML：‒1.2 mm；DV：‒6.6 mm)于大鼠脑伏隔核内植入探微透析针套管并用牙科水泥固定。手术后，大鼠单笼喂养恢复24小时。

（2）烟气口鼻吸入暴露：利用转盘式吸烟机在ISO 3308抽吸条件下(每次抽吸容积为35ml，抽吸2s，间隔60s)抽吸卷烟产生卷烟烟气或将电子烟烟液加入到气溶胶发生器中产生电子烟烟气（气溶胶），将脑部植有微透析探针导管的实验大鼠置于改造后的实验动物鼻部吸入暴露夹持器中，随后接入动物口鼻吸入暴露装置中；精确控制动物口鼻吸入暴露装置的温度、稀释空气流速等参数，使实验大鼠暴露于恒定总粒相物（TPM）浓度的烟气中。

（3）微透析取样：将微透析探针（CMA 12）插入实验大鼠头部的探针导管中并连通微透析管路，采用滤过的林格氏液（复方氯化钠注射液）以2.0 μL/min的速度灌流取样。

（4）样品检测：将微透析取样管路通过在线自动进样器与高效液相色谱-库仑阵列电化学检测器连接以实现微透析样品的在线自动进样分析，根据5种目标化合物的色谱行为（图2）及分析时间（在下述色谱条件下14 min内可完成一次样品的检测）设定在线自动进样器的进样间隔为15 min。

色谱条件

色谱柱：Discovery HS F5柱(4.6 mm ×150 mm，3 μm)；柱温：30 ℃；流动相：A：甲醇，B：缓冲盐液，含有40 mmol/L柠檬酸、20 mmol/L磷酸氢二钠和0.3 mmol/L EDTA；流速：0.25 mL/min；梯度洗脱条件见表1；进样量：20 µL；根据各目标物的伏安曲线设置库仑阵列电化学检测器的8道工作电势为：‒50、0、50、175、200、350、400、500 mV。

表1 梯度洗脱条件

时间（min）流动相A（%）流动相B（%）0109042575132575141090

（5）标准曲线的建立及样品数据分析

在未连通微透析系统下将系列混合标准溶液按由低到高的浓度顺序进行HPLC-ECD分析，以各目标物的色谱峰面积（Y）对其相应的浓度（X）进行线性回归，得到标准曲线回归方程。

利用标准曲线法对检测的大鼠脑微透样品中5种目标物进行定量分析，依据结果分别绘制烟气暴露前、后各时间点脑内单胺类神经递质及其代谢物的浓度-时间变化曲线，揭示烟气暴露对单胺类神经递质的影响规律。

实施例1

某参比卷烟烟气暴露后的大鼠脑内单胺类神经递质变化检测试验

按照上述步骤（1）进行大鼠脑部微透析探针导管植入试验，随后按照步骤（2）进行参比卷烟抽吸和大鼠烟气口鼻式吸入暴露，使实验大鼠暴露于TPM浓度为200 mg/m³的卷烟烟气中，然后按照步骤（3）进行微透析试验，按照步骤（4）进行样品检测，最后按照步骤（5）进行样品的数据分析。

图3、图4、图5、图6和图7分别为卷烟烟气暴露前后大鼠脑内DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA的浓度-时间变化曲线示意图。

结果表明，卷烟烟气暴露期间，大鼠伏隔核内DA和5-HT的释放持续增加，DA的初级代谢产物DOPAC的含量无显著变化，而DA和5-HT各自的终级代谢产物HVA和5-HIAA的含量明显升高，说明本发明方法可用于连续监测卷烟烟气暴露前后大鼠脑内单胺类神经递质的变化规律。

实施例2

某电子烟烟气暴露后的大鼠脑内单胺类神经递质变化检测试验

按照上述步骤（1）进行大鼠脑部微透析探针导管植入试验，随后按照步骤（2）利用气溶胶发生器进行电子烟气溶胶的产生和大鼠烟气口鼻式吸入暴露，使实验大鼠暴露于TPM浓度为1000 mg/m³的电子烟烟气中，然后按照步骤（3）进行微透析试验，按照步骤（4）进行样品检测，最后按照步骤（5）进行样品的数据分析。

图8、图9、图10、图11和图12分别为电子烟烟气暴露前后大鼠脑内DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA的浓度-时间变化曲线示意图。结果表明，电子烟烟气暴露期间大鼠伏隔核内DA和5-HT的变化呈现出与卷烟烟气暴露时相似的规律，说明本发明方法也可用于实时监测电子烟烟气暴露前后大鼠脑内单胺类神经递质的变化信息。