用于中枢神经系统的急性、亚急性和慢性创伤性损伤的蛋白质标志物

摘要

本发明公开了在中枢神经系统损伤后，在组织和生物流体中差异表达的或者升高的蛋白质。单独的或者不同组合或比例的蛋白质升高或降低的程度可被用于评估中枢神经系统损伤（CNS损伤）的严重性，包括创伤性脑损伤（TBI）、创伤性脊髓损伤（SCI）和慢性创伤性脑病（CTE）。这些蛋白质的CNS损伤后的时间进程测量可被用于监测长达数月时间周期的进展或恢复。急性、亚急性和慢性损伤的不同可以通过比较CNS损伤病人和标准对照组的第1‑3天、第4‑10天和第30‑180天的蛋白质水平来诊断。

说明书

本申请要求于2014年4月8日提交的申请号为61/976,733的美国临时申请的优先权，通过引证的方式将其全部内容并入本文，包括所有附图、表格和氨基酸或者核酸序列。

本发明是在国防部资助的X81XWH-12-1-0277由政府支持而做出的。政府享有本发明一定的权利。

发明背景

技术领域

本发明通常涉及生物诊断领域，特别是用于诊断、预测和控制中枢神经系统损伤或慢性机能障碍的方法。

背景技术

创伤性脊髓损伤(SCI)为由对脊髓造成损害所导致的损伤。在损伤后，其可以致使感官和运动的丧失，并且其为创伤后神经失能的一个重要原因，例如SCI病人终生瘫痪。据估计，在北美大约300,000人患有脊髓损伤(SCI)，并且每年新出现12,000至20,000例病例。

已经假设导致急性创伤性脊髓损伤的病理学过程由两个步骤构成：由对脊髓的直接冲击造成的物理和机械损害而导致的原发性创伤。继发性创伤为一连串的生物化学作用，例如由于激活半胱氨酸蛋白酶(例如钙蛋白酶)的细胞内Ca²⁺的升高而导致的细胞骨架、细胞膜和髓磷脂蛋白的蛋白质水解。蛋白质水解通过进展性的组织退化而损害脊髓，包括脊髓内的神经细胞死亡、轴突退化和脱髓鞘。尽管诊断急性创伤性SCI是相当容易的，但是创伤程度的评估经常是具有挑战性的。神经学检查目前用于脑创伤的诊断、严重程度的确定以及神经结果的预测(TBI，冲击)。然而，这些检测经常无法评估SCI的严重程度；此外，SCI病人的神经恢复差异性很高。因此，希望发现和使用SCI标志物来研发新的可被用于防止或降低SCI失能的治疗干预。

在美国，2010年约250万的急诊患者、住院病人或者死亡病例是与创伤性脑损伤(TBI)相关的，无论是单独的还是与其它损伤相结合的。TBI导致多于50,000人死亡，并且在多于280,000住院病人和220万急诊患者中诊断出。急症由单独TBI或者与其它损伤结合的TBI构成。

在过去的十年间(2001-2010)，与TBI相关的急诊患者比例增加70％，而住院病人比例仅增加11％，并且死亡率下降7％。在2009年，美国估计有248,418个年龄在20岁或更年轻的小伙子接受治疗。急诊病人为与运动和娱乐相关的损伤，其包括脑震荡或TBI.3的诊断。从2001至2009，无论是单独的还是与其它损伤相结合的，诊断为脑震荡或TBI的与运动和娱乐相关的损伤的急诊病人比例在儿童和青年人群体中提高了57％。

慢性创伤性脑病(CTE)为一种由反复性创伤性脑损伤导致的逐步恶化的形式的脑病。这种类型的损伤在以前被称为拳击手脑病综合症(punch-drunk syndrome)或者拳击手痴呆(dementia pugilistica)。CTE通常发现于参与身体接触项目的职业运动员中，例如拳击、Ruby、美式足球、冰球和职业摔跤。在暴露于爆炸或震荡性损伤的士兵中也发现CTE。

与CTE相关的症状可能包括痴呆例如记忆丧失、攻击行为、混乱和抑郁，其通常出现在创伤后的数年或数十年。尸检时发现Tau蛋白(MAPT)、TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)和其它蛋白会沉积于脑部。

根据国家科学院将标志物定义为生物学试样或系统中信号事件的指示剂。标志物被认为是对SCI的严重程度进行定义的具有极高价值的公正的工具，因为它们反映脊髓损害的程度，并预期神经恢复。对于使用质子磁共振光谱法(1H-MRS)来监测原发性和继发性SCI损害的病理学变化来说，存在数种候选代谢物可作为标志物，例如N-乙酰天冬氨酸盐(NAA，神经/轴突标记物)、肌氨酸(神经胶质过多症标记物)和胆碱(与膜合成和退化均相关的细胞转换的标记物)。通过定量分析脑组织中代谢物的变化，体内1H-MRS为用于非侵害性监测脑生物化学的有价值工具。然而，由于脊髓相对小的尺寸和周围骨结构的磁化效应，获得具有足够的信噪比(SNR)的MR光谱的能力受到限制，这妨碍了代谢物水平微小变化的检测。

发明简述

本发明确定并分析了与脑和脊髓的急性和慢性损伤相关的数种蛋白质标志物的变化。所选定的蛋白的差值例如可以区分慢性和极性创伤性脑损伤和中枢神经系统损伤。通常地，本发明证明了数种不同蛋白水平以及某些蛋白比例的变化可以提供用于对中枢神经系统损伤进行诊断、预测和控制的基于生物标志物的工具。

表1列出了在本文中描述的用于急性、亚急性和/或慢性创伤性脑损伤和脊髓损伤的新的蛋白质标志物，由蛋白质组、系统生物学和免疫分析方法来确定。标志物包括蛋白简称、蛋白全称和蛋白收录号。它们包括：Tau蛋白(MAPT)和P-Tau(微管相关的Tau蛋白(磷酸化Tau蛋白))，TDP-43和BDP类(TAR DNA结合蛋白43(及其分解产物)，SBDP类(SBDP150、SBDP145、SBDP120、SNTF)(150、145和120kDa的αII血影蛋白分解产物以及N-末端的血影蛋白片段(～140kDa)，GFAP(神经胶质原纤维酸性蛋白(及其分解产物)(Gfap-α(异构体1)、Gfap-δ/GFAP-ε(异构体2)、Gfap-κ(异构体3)、S100b(神经胶质S100b蛋白)，MBP(髓磷脂碱性蛋白(21K，18.5K，17K，14K)，IL-6(白介素-6)，Iba-1(小神经胶质细胞、巨噬细胞中的离子钙-结合衔接分子-1(其它名称:AIF1同种异体移植物炎症因子1))，VSNL1/VISL1(类视锥蛋白状蛋白1，类海马钙结合蛋白状蛋白3(其它名称VILIP，VLP-1，HLP3)，VSNL2/HPCAL4(类海马钙结合蛋白状蛋白4，(其它名称VILIP-2))，VSNL3/VILIP-3/HACAL1(类海马钙结合蛋白状蛋白1，(其它名称VILIP-3，BDP1)，Pro-BDNF(衍生自大脑的神经营养因子的原蛋白形式(蛋白前体))，BDNF(衍生自脑的神经营养因子(成熟形式))，铁传递蛋白(TF)(铁传递蛋白前体)，CathD(CTSD)(组织蛋白酶D/组织蛋白酶D前蛋白原)，TPI-1(磷酸丙糖异构酶1，TIM)，PEA-15(在星形细胞15中富含的磷蛋白质)。

在一个重要的方面中，本发明为用于诊断受试者创伤性脊髓损伤(SCI)严重性的方法。所述方法包括步骤：获得急性创伤性脊髓损伤的初步诊断；与未受伤受试者相比，选择脊髓损伤受试者的差异表达蛋白面板；在受伤后的初始时间至1-3天，测量受试者第一组织或血液试样中所述蛋白的水平；在初始测量之后的选定时间，重复测量受伤受试者的组织或血液试样中的所述蛋白；并且比较受伤受试者在受伤后不同时间蛋白和未受伤受试者的蛋白的差异表达水平。受伤1-7天内任意两种或更多种蛋白的水平升高，所述蛋白包括醛脱氢酶-4，Aldh4a1片段，LOC367586蛋白，氨基酰化酶1A，γ-烯醇酶，延伸因子2，蛋白Tln1过氧化物氧化还原酶-2，醛-酮还原酶族1，成员B10(醛醣还原酶)，丙酮酸激酶PKM，酰基-辅酶A合成酶家族成员2，线粒体，和蛋白-L-异天冬氨酸(D-天冬氨酸O-甲基转移酶)，或者与健康受试者中相同蛋白的水平对比，水平降低的异柠檬酸脱氢酶(NADP)，甘露糖-6-磷酸异构酶，吡哆醛激酶，微管不稳定蛋白和外周髓磷脂蛋白2(Pmp2)，醇脱氢酶[NADP(+)]，L-乳酸脱氢酶B链，核糖基二氢烟碱脱氢酶[醌]，和ATP柠檬酸裂合酶-CRA异构体指示严重的SCI。

与健康受试者相比，当一个或多个如下的蛋白水平在CNS损伤的1-10天内升高时，就表示急性或亚急性CNS损伤：脂肪酸合酶，NME/NM23核苷二磷酸激酶1，真核翻译延伸因子2，膜联蛋白A1，膜联蛋白A2，组织蛋白酶D，葡萄糖磷酸变位酶1，谷氨酸-草酰乙酸转氨酶2，线粒体(天冬氨酸氨基转移酶2)，醛脱氢酶-4，Aldh4a1片段，LOC367586蛋白，酰基转移酶1A，γ-烯醇酶，延伸因子2，蛋白Tln1过氧化物氧化还原酶-2，醛-酮还原酶族1，成员B10(醛醣还原酶)，丙酮酸激酶PKM，酰基-辅酶A合成酶家族成员2，线粒体，和蛋白-L-异天冬氨酸(D-天冬氨酸O-甲基转移酶)。当与健康受试者中相同蛋白的水平对比时，这样的损伤还通过降低水平的异柠檬酸脱氢酶(NADP)，甘露糖-6-磷酸异构酶，吡哆醛激酶，微管不稳定蛋白和外周髓磷脂蛋白2(Pmp2)，醇脱氢酶[NADP(+)]，L-乳酸脱氢酶B链，核糖基二氢烟碱脱氢酶[醌]，和ATP柠檬酸裂合酶-CRA异构体来表示。

所要求保护的方法还允许通过在创伤后1-3天的时间内测量生物流体试样如CSF、血液、血清或血浆中总Tau(T-Tau)、磷酸化的Tau(P-Tau)和P-Tau/T-Tau比的水平至少一次；在中枢神经系统(CNS)损伤后约30天至约180天由第二试样测量T-Tau、P-Tau和P-Tau/T-Tau比的水平；并比较第1-3天创伤试样的T-Tau、P-Tau和P-Tau/T-Tau比的水平以及未受伤或健康受试者的试样，从而区分未受伤对照受试者和受试者急性和慢性中枢神经系统(CNS)损伤。与对照试样的水平相比，第1-3天更高水平的T-Tau、P-Tau和P-Tau/T-Tau比表示急性CNS损伤。

CNS损伤可以是创伤性脑损伤(TBI)、急性脊髓损伤或者慢性创伤性脑病(CTE)。

对于诊断受试者的中枢神经系统损伤来说，所述方法是特别有用的。测量一个或多个差异表达蛋白组的生物流体(例如CSF、血液、血清、血浆)水平。蛋白选自TAR DNA-结合蛋白43(TDP-43)及其分解产物，类视锥蛋白状蛋白(VILIP-1，VILIP-2，VILIP-3)，脑源性神经营养因子(BDNF)和BDNF的前体(Pro-BDNF)，离子钙结合衔接分子-1(Iba-1)，总Tau(T-Tau)，磷酸化Tau(P-Tau)和P-Tau/T-Tau比，以及铁传递蛋白，组织蛋白酶D，TIP-1，和PEA-15。相对于健康受试者中相同蛋白的一种或多种蛋白水平提高表示急性或慢性脊髓损伤或者创伤性脑损伤(TBI)。

优选地，具有更高水平的一种或多种蛋白选自如下的组：TDP-43，类视锥蛋白状蛋白，BDNF，Pro-BDNF，iba-1，Tau，P-Tau，P-Tau/T-Tau比，铁传递蛋白，组织蛋白酶D，TIP-1和PEA-15，并与一种或多种选自如下蛋白组成的组的蛋白组合测量：GFAP，GFAP-BDP和αII-血影蛋白分解产物(SBDPs)，MBP(21K，18.5K，17K，14K异构体)，IL-6，UCH-L1和S100b。更高水平的蛋白为与健康受试者中的水平相比较的，并且表示CNS损伤(脊髓损伤或TBI)。

对于早期确定创伤性脑损伤(TBI)或者脊髓损伤(SCI)来说，所要求保护的方法是有效的。当损伤后3天进行测量时，如果检测到CSF、血液、血清或血浆中TDP-43和TDP-43-BDP的水平为对照组的至少两倍时，则表示TBI。所述损伤可以是从皮层冲击(严重TBI)、振荡性闭合性脑损伤或者超压爆炸波引起的脑损伤或脊髓损伤。

蛋白水平还可以由不仅包括脑脊髓液(CSF)、血液、血清和血浆，而且包括唾液、尿鼻液和汗液的一种或多种生物流体，或者由选自活组织或尸检脑或脊髓组织试样的固体生物试样来测量。

一种优选的实施方式为诊断试剂盒，包括一系列工作台，显示中枢神经系统损伤受试者中差异表达蛋白的CNS生物试样或生物流体水平。工作台相对于损伤的严重性和与损伤后时间相关的模式而被组织起来。所述试剂盒还包括指令，相应于中枢神经系统损伤类型和用于进行测量的损伤后大致时间使用每个工作台。CNS严重性水平的诊断通过比较所述蛋白在受伤病人中的水平和工作台中的蛋白水平来确定。

中枢神经系统损伤为创伤性脑损伤(TBI)，创伤性脊髓损伤(SCI)或者慢性创伤性脑病(CTE)。

用于分析的生物流体可以选自一种或多种脑脊髓液(CSF)、血液、血清、血浆、唾液、尿液鼻液和汗液。固体生物试样可以选自活组织切片或尸检脑和/或脊髓组织试样。

用于诊断的一种或多种差异表达蛋白可以是TAR DNA-结合蛋白43(TDP-43)及其分解产物，类视锥蛋白状蛋白(VILIP-1，VILIP-2，VILIP-3)，脑源性神经营养因子(BDNF)和BDNF的前体(Pro-BDNF)，离子钙结合衔接分子-1(iba-1)，总Tau(T-Tau)，磷酸化Tau(P-Tau)和P-Tau/T-Tau比，铁传递蛋白，组织蛋白酶D，在星形胶质细胞15中富含的磷蛋白质(PEA-15)，磷酸丙糖异构酶1(TPI-1)。

另外，所分析的一种或多种蛋白可以选自TDP-43，类视锥蛋白状蛋白，BDNF，Pro-BDNF，iba-1，Tau，P-Tau，P-Tau/T-Tau比，铁传递蛋白，组织蛋白酶D，TIP-1和PEA-15，与一种或多种选自GFAP，GFAP-BDP和αII-血影蛋白分解产物(SBDP)，MBP(21K，18.5K，17K，14K异构体)，IL-6，UCH-L1和S100b的蛋白的组合。

附图说明

图1示出在反复性闭合性头部创伤脑损伤后，Tau蛋白和TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)蛋白质病，导致后TGI CTE发病的机理。

图2描述了Tau(MAPT)蛋白作为与蛋白相关的微管，及其示意性结构。所示的为人4R形式(441个氨基酸；aa)，示出主要病理学磷酸化部位(包括T-181，S-2-2，S205，T-231和S396/S404)-在P残基为辨识这些含磷的特定肽的特定单克隆抗体(MAb)之前。还例如，由已知的MAb辨识的a.a.102-150序列(由DA9辨识)或者aa 210-241序列(由Tau-5辨识)。

图3示出通过钙蛋白酶和半胱天冬酶-3途径的反应激活应答DNA-结合蛋白43(TDP-43)蛋白质水解示意图。在这种模型中，半胱天冬酶在N终端剪切(Asp89*Ala90,Asp219*Val220,基于Zhang YJ等，Journal of Neuroscience 2007；27:10530–10534)，产生由半胱天冬酶决定的33kDa和25kDa的CTF和未知的C终端剪切位点，形成39kDa和12kDa的片段。然而，钙蛋白酶在至少六个位点剪切(Phe229*Ala230；Leu243*Cys244；Gln286*Gly287；Gly295*Gly296；Ala297*Gly298；Met323*Ala324,基于Yamashita T等，NatureCommunications2012；3:1307)，产生多个片段。但是形成39kDa和35kDa的主要钙蛋白酶特异性的C终端片段(CTF)剪切位点仍然是未知的。

图4A-4D示出在创伤性脑损伤(TBI)后，鼠皮层TDP-43蛋白质水解。脑试样收集自受伤后第1、3天的控制大脑皮层影响(CCI)的鼠的原始、伪造、身体同侧的皮层(1.5mm影响深度)(A)和超压爆炸波诱导的脑损伤(OBI)鼠的额皮质层(30psi峰值压力)(B)。对脑溶解产物实施免疫印迹法，并使用C末端或内部TDP-43、αII-血影蛋白或碳酸酐酶II(CA-II)抗体进行探查。CCI小鼠皮层(C)和OBI小鼠质层(D)中分解产物与TDP-43比值的定量分析通过密度测量分析来完成。数值表示平均值±平均标准误差，n 4-5，与原始值比较*P<0.05(单因素方差分析)。

图5A-5B。在严重的创伤性脑损伤(TBI)后，释放至人脑脊髓液(CSF)中的转录激活响应DNA结合蛋白43(TDP-43)和分解产物(BDPs)。(A)用于确定TDP-43水平，使用在TBI后第一个24小时内，源自对照组或TBI病人的10mL五倍浓度的CSF试样。所释放的TDP-43使用C末端TDP-43抗体进行检测。αII-血影蛋白还作为对照生物流体标志物进行探查。每个分道表示单个受试者。对于Western杂交，高水平的清蛋白(66K)(使用‘}’表示)下压并扭曲未受损伤的TDP-43的条带。(B)人CSF中SBDP150/145K，TDP-43和BDP-35K C末端片段水平的散点图。

图6A-6B。在小鼠的单次(OBI)或反复性(rOBI)超压爆炸波诱导脑损伤后不同时间点的血清Tau和P-Tau以及P-Tau/T-Tau升高。OBI和rOBI组的方差分析p<0.001，对比空白组(A)T-Tau，P-Tau和(B)P-Tau/T-Tau比。

图7A-7B。在小鼠的单次(CHI)或反复性(rCHI)闭合性头部震荡性脑损伤后不同时间点的血清Tau和P-Tau以及P-Tau/T-Tau升高。OBI和rOBI组方差分析p<0.001，对比空白组(A)T-Tau，P-Tau和(B)P-Tau/T-Tau比。

图8A-8C。急性TBI的人脑脊髓液中T-Tau，P-Tau和P-Tau/T-Tau比的检测。健康对照组与急性严重TBI对比(第一个24-72h)。绘制(A)总tau，(B)P-tau和(C)P-Tau/总Tau比。*p<0.05不同于对照组，***，p<0.001不同于对照组。

图9A-9C示出急性和慢性TBI的血清T-Tau，P-Tau和P-Tau/T-Tau比的检测。健康对照组对比急性严重TBI(第一个24-72h)和慢性(平均30天)血清试样，绘制(A)Total tau，(B)P-tau和(C)P-Tau/总Tau比。N＝10-16。*p<0.05不同于对照组，**，p<0.01不同于对照组。

图10A示出血浆P-Tau，并且图10B示出慢性人TBI患者中P-Tau/T-Tau比。血浆试样(平均6.3mo.；范围1-12mo.)，对比正常对照组。n＝21-29。*p<0.05慢性TBI不同于对照组。

图11A-11B示出光谱TBI，T-Tau，P-Tau和P-Tau/T-Tau比检测对照组与不同的TBI严重程度组对比，分组为GCS 13-15(轻微)，GCS 9-12(中等)和GCS 3-8(严重)。A)T-Tau(左侧条)，P-Tau，(右侧条)。(B)P-Tau/T-Tau比。*p<0.05不同于对照组，#，p<0.05不同于CSG13-15组。

图12A-12B示出光谱TBI，T-Tau，P-Tau和P-Tau/T-Tau比检测对照组对比CT正常和CT不正常的TBI患者。(A，左侧图板)T-Tau(左侧条)，P-Tau，(右侧条)。(B,右侧图板)P-Tau/T-Tau比。*p<0.05不同于对照组，#，p<0.05不同于CSG 13-15组。

图13A-13D示出大鼠脊髓组织试样的实施例，其示出神经创伤标志物MBP(B)SBDP150，SBDP145，SBDP120(C)，GFAP，GFAP-BDP44K，GFAP-BDP40K(D)在脊髓损伤之后的4h、24h和/或7天时的升高。(A)典型的免疫印迹试样。组织试样为损伤集中点。*p<0.05中等或严重TBI分别不同于伪造和空白，(C)αII-血影蛋白，SBDP150，SBDP145和SBDP120(从左侧到右侧的条)，(D)GFAP-50K(未受损伤的)，GFAP-BDP-44K，GFAP-BDP-40K(从左侧到右侧的条形图)。

图14示出大鼠脊髓组织试样的实施例，其示出新的生物标志物铁传递蛋白，组织蛋白酶D(CathD)和在星形胶质细胞15中富含的磷蛋白质(PEA-15)在脊髓损伤后的4h、24h和/或7天时升高。组织试样为受伤集中点的尾部片段。这些模式是与差示质谱蛋白质结果相一致的。铁传递蛋白，组织蛋白酶D，TPI-1和PEA-15(在每组中均为从左侧至右侧的条形图)。*p<0.05中等或严重TBI分别不同于伪造和空白。

图15A-15D示出大鼠脊髓损伤CSF试样，示出新的生物标志物铁传递蛋白和TPI-1的升高，具有可与已知的神经创伤生物标志物(SBD和GFAP以及GFAP-BDP)相当的模式。(A)免疫印迹图像，(B)铁传递蛋白(左侧条)，TPI-1(右侧条)，(C)αII-血影蛋白，SBDP150，SBDP145和SBDP120(从左侧至右侧的条形图)，(D)GFAP-50K(未受损伤的，GFAP-BDP-44K，GFAP-BDP-38K(从左侧至右侧的条形图)。*p<0.05中等或严重SBI分别不同于伪造和空白。

图16为人脊髓损伤CSF试样的实施例，其示出新的生物标志物铁传递蛋白，CathD，TPI-1和PEA-15以及其它在先确定的TBI生物标志物(SBDP，GFAP和GFAP-BDP)的升高。所示的为两个对照组CSF试样和两个SCI病人的一系列CSF试样(从第1天时间点1、时间点2至第5天时间点2)。

图17A-17B示出人脊髓损伤CSF试样，示出新的生物标志物铁传递蛋白和TPI-1，PEA-15(A)的升高，其具有与已知的神经创伤生物标志物(SBDP和GFAP以及GFAP-BDP)(B)相当的模式。(B)SCI病人CSF试样收集自创伤后的第一天(第0天)至第六天。在这里所示的为病人的第一试样信号以及所有试样(SCI n＝12-15，对照组10-12。(A&B)对照组CSF，SCICSF(第一试样)，SCI CSF(所有试样)(在每一组中均为从左侧至右侧的条形图)。*p<0.05SCI不同于对照组CSF。

图18示出相同受试者在相同时间点显示出关联的人脊髓损伤CSF和血清GFAP水平。患有SCI的受试者n＝12，第0-6天每6小时收集系列CSF和血清。CSF中GFAP水平为约10-100倍高于在血清中发现的。由此，我们推断如果在人CSF试样中示出升高的生物标志物，那么它们被期望在血液中(例如血清、血浆试样)以可以计量的方式升高。

图19为不同TBI生物标志物类型相互作用组的系统生物学测绘图。

图20为候选SCI生物标志物相互作用组的系统生物学测绘图。

图21A-21B示出人脊髓损伤CSF试样，示出新的SCI生物标志物S100b和IL-6的升高。SCI病人的(A)CSF和(B)血清试样收集自受伤后的第一天(第0天)至第六天。在这里所示的为病人的所有试样，SCI n＝12-15，对照组n＝10-12。*p<0.05，SCI不同于各个对照组。(A)对照组CSF(左侧条)，hSCI CSF(右侧条)；(B)对照组血清(左侧条)，hSCI血清(右侧条)。

图22示出与正常对照组(N＝10-14)相比，检测到患有急性TBI患者的CSF试样中铁传递蛋白，CathD，TPI和PEA-15以及CNS损伤生物标志物GFAP和GFAP-BDP升高的实施例。基于我们新的生物标志物的SCI数据，并且因为SCI和TBI为类似的和相关的神经创伤，我们推断铁传递蛋白，CathD，TPI和PEA-15将还在TBI病人的生物流体(例如CSF)中升高。在这里，这种TBI CSF生物标志物升高事实上支持我们的主张。对照组CSF(左侧条)，hSCI CSF(右侧条)；*P<0.05TBI对比对照组。

图23示出人创伤性脑损伤和脊髓血清试样，当与对照组血清试样对比时，示出新的生物标志物BDNF的升高。所使用的TBI和SCI病人试样在受伤后24小时内收集。所示出的为SCI和TBI n＝10，对照组n＝16。***p<0.001SCI或TBI不同于对照组血清。

图24示出人创伤性脑损伤血清对比对照组血清中的生物标志物pro-BDNF。所使用的TBI病人试样在受伤后24小时、240小时(10天)收集。TBI n＝20，对照组n＝16。pro-BDNF水平检测为对照组(pg/mL；平均值±SEM)583.1±230.4，并且在TBI后24h升高至698.9±224.0，并在TBI后240h升高至780.2±232.0。

图25A-25B示出人和小鼠创伤性脑损伤血清对比对照组血清中的生物标志物Iba-1。(A)分析源自空白鼠以及受伤后(每个n＝6)1天和7天时控制性皮质撞击损伤(TBI，CCI)小鼠的血清试样的Iba-1水平。Iba-1水平在小鼠血清中是可检测的，并且在创伤后1天和7天的TBI血清中被发现是升高的(***p<0.001)，与空白对照组血清水平相比。(B)所使用的严重TBI病人试样在受伤后的24h、168h(7天)收集。TBI n＝12，对照组n＝10。Iba-1水平在人血清中是可检测的，并且在TBI-24h(**p<0.005)和TBI-168h(***p<0.001)被发现是升高的，与对照组相比。

图26A-26B示出在人TBI CSF和人脊髓损伤和TBI血清中类视锥蛋白状蛋白-1(VILIP-1，VSNL1)的升高，与各个对照组相比。(A)对来自对照组或TBI(第1天)的CSF试样进行VILIP-1水平分析。(***p<0.001)与对照组CSF水平相比。(B)所使用的严重SCI和TBI病人血清试样在受伤后24h收集(n＝6-8)。VILIP-1水平在人血清中是可以检测的，并且在SCI、24h(6.07±1.03pg/mL；平均值+标准偏差)和TBI、24h(7.06±0.63)中被发现是升高的，与对照血清组(5.33±0.50)相比。

发明详述

钙结合蛋白S100β(S100β)，神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)，髓磷脂碱性蛋白(MBP)，神经元特异性烯醇酶(NSE)，神经纤毛蛋白(NFL)，SBDP150/SBDP145/SBDP120，泛素C末端水解酶-L1(UCH-L1)，微管相关蛋白2(MAP-2)以及白介素6和8(IL-6和IL-8)已被确认为TBI生物标志物，并且某些还被建议为类似的SCI的生物标志物。合乎逻辑的是，TBI生物标志物还能够是脊髓损伤的潜在标志物。这些生物标志物在确定SCI严重程度的临床环境中的潜在应用已被证实。然而，由于脊髓损伤的复杂性，目标在于不同损伤并发症的多种干预可能是需要的。所以，单独的生物标志物被成功地用于诊断和确定SCI病人的严重性是不可能的。

潜在的新SCI标志物已经通过使用CAX-PAGE-LC-MS/MS蛋白质组平台来确定，其可以提供更佳的分解和分离能量并表征与SCI损伤相关的蛋白质组变化。已经对SCI损伤试样进行了分析，所述试样收集自SCI动物模型(落重法)以及SCI病人的临床研究。比较受伤和未受伤区域的分子差异获得可被用于与疾病发展相关的SCI候选生物标志物组。在SCI中所涉及的新的生物标志物的确定对于描述损伤的严重程度并为治疗干预提供新的途径是重要的。此外，因为SCI和TBI具有类似的病理生理学并且是相互关联的神经创伤，所以经确定的新的SCI生物标志物还将在TBI病人的生物流体(例如CSF，血液)中升高，并可用作为TBI生物标志物。

此外，定量免疫印迹法(Western印迹)和夹层酶连免疫吸附测定(sw-ELISA)还被用于确定目标TBI生物标志物候选物，其基于系统生物学和相互作用组分析(图24-25)以及源自具有不同等级和损伤类型(小鼠控制性皮质撞击损伤，小鼠的单次或者反复性超压爆炸波脑损伤，小鼠的单次或反复性闭合性头部震荡性脑损伤)的TBI动物模型和大鼠脊髓损伤的一系列CNS组织、生物流体(CSF和/或血清，血浆)试样，以及严重TBI和光谱TBI(包括严重-中度至轻微)的一系列生物流体(CSF和/或血清、血浆)试样，格拉斯哥昏迷评分(Glasgow coma scale)((GCS)3-15)和人脊髓损伤病人。在TBI或SCI之后的急性(1-3天)、亚急性(7-10天)至慢性(1月至大于1年)期收集试样。

总的来说，生物标志物蛋白的水平和类型取决于创伤的类型和严重性，无论创伤是否为反复性的，并且取决于距受到创伤的时间多久。

特别地，大量的蛋白被发现存在显著的变化，并且可被用作中枢神经系统损伤的生物标志物，例如创伤性脊髓损伤(SCI)、创伤性脑损伤(TBI)和慢性创伤性脑病，在其它因素中，这依赖于损伤的阶段。具有更佳可检测变化的蛋白包括TDP-43及其分解产物BDP(39kDa，35kDa，25kDa)。

总Tau(T-Tau)和磷酸化Tau(P-Tau)；例如在位点Thr181，Ser202，Ser202/Thr205，Thr231，Ser396/Thr401并且特别是P-Tau/T-Tau比被用作中枢神经系统损伤和CTE形成检测的急性和亚急性/慢性生物标志物。Tau和P-Tau使用可提供的sw-ELISA方法来分析。CNS损伤依赖性T-Tau、P-Tau或P-Tau/T-Tau比升高由TBI病人或动物的生物流体(CSF、血清或血浆)来确认。

磷酸丙糖异构酶(TPI-1)、铁传递蛋白(TF)、在星形胶质细胞15中富含的磷蛋白质(PEA-15)和组织蛋白酶D(CathD)也有希望用作中枢神经系统损伤(TBI或SCI)的生物标志物。它们的CNS损伤依赖性生物流体升高可以使用TBI和SCI病人或动物的生物试样(CNS组织、CSF、血清或血浆)通过免疫印迹或ELISA来确定。

IL-6(白介素-6)，Iba-1(离子钙结合衔接分子)，包括VSNL1/VISL1(类视锥蛋白状蛋白1，类海马钙结合蛋白状蛋白3，VSNL2/HPCAL4(类海马钙结合蛋白状蛋白4)和VSNL3/VILIP-3/HACAL1(类海马钙结合蛋白状蛋白1，Pro-BDNF(前蛋白形式)和脑源性神经营养因子的成熟形式(BDNF)的类视锥蛋白状蛋白被确认，基于CNS损伤神经系统生物学/相互作用组研究，并且它们的CNS损伤依赖性水平升高使用TBI和SCI病人或动物的生物流体(CSF、血清或血浆)通过免疫印迹和/或sw-ELISA来确定。

生物标志物组合为特别值得注意的；例如，TPI-1、铁传递蛋白、PEA-15和组织蛋白酶D与GFAP、GFAP分解产物(GFAP-BDP)和αII血影蛋白分解产物以及UCH-L1和MBP(髓磷脂碱性蛋白(21K，18.5K，17K，14K)的组合。其它生物标志物的组合为脂肪酸合酶，NME/NM23核苷二磷酸激酶1，微管不稳定蛋白1，真核翻译延伸因子2，膜联蛋白A1，膜联蛋白A2，组织蛋白酶D，葡萄糖磷酸变位酶1，谷氨酸-草酰乙酸转氨酶2，线粒体(天冬氨酸氨基转移酶2)。

其它CNS损伤生物标志物的组合也被注意到；例如，类视锥蛋白状蛋白(例如VISL1，VSNL2，VSNL3)，BDNF，Pro-BDNF，S100b，IL-6和Iba-1与TPI-1，铁传递蛋白，PEA-15和组织蛋白酶D或者与GFAP，GFAP分解产物(GFAP-BDP)和αII血影蛋白分解产物以及UCH-L1和MBP的组合。

蛋白质组分析对于同时确定生物系统中的多个蛋白是有用的技术；其为研究血液、细胞器、细胞、组织、器官或有机体内的蛋白丰度、表达模式、相互作用和亚细胞定位提供稳健的方法，其可以经研究以为系统提供精确的和全面的数据。蛋白质组学为最有力的技术，其可以帮助发现新的生物标志候选物；其利用大量的试样步骤和数据依赖性收集以跟随疾病特异性蛋白(一致性和浓度)。其帮助在任意给定的时间确定蛋白质组中所有的差异表达蛋白，并在疾病发展过程中使这些模式与健康的蛋白相关联。其已被用于在分子水平使用动态角度来研究蛋白表达，这有助理解疾病的机理。神经蛋白质组的复杂性、巨大的尺寸和可变性，广泛的蛋白-蛋白和蛋白-脂质相互作用，均限制质谱仪检测在试样中包含的所有肽/蛋白的能力；此外，某些肽/蛋白是非常难于分离的。因此，分离和确定肽/蛋白的分析方法必须通过使用分离技术与有力的新的质谱技术的结合来控制所有的这些问题，从而扩展蛋白定性、定量和表征的范围。

生物学试样的复杂性可以通过蛋白或肽水平的进一步分离或分级来降低。多维LC可用于两种或更多种不同类型的序列组合，以显著地改善分辨能力并获得大量所要确定的蛋白。在第一维度中的离子交换色谱(IEC)非常适用于分离蛋白和肽，基于它们总体电荷的差异来分离蛋白。IEC的固定相为阴离子或阳离子交换剂，分别通过使带正电或带负电的功能基团固定在色谱介质的表面上来制备。蛋白或肽的分离通过流动相组合物(盐浓度或pH)的线性变化来进行，其降低蛋白与固定相的相互作用，导致最终对蛋白的洗脱。而且，SDS-PAGE可被用于进一步分离蛋白，通过对于目标蛋白质组最优化的分解距离显而易见的分子量。此外，肽可以通过它们的疏水性使用反相C18柱而分离，其可被直接连接至电喷雾质谱仪(ESI-LC-MS/MS)。反相液相色谱(RPLC)为在第二维度中最常用的，因为其具有与下游质谱分析(试样浓度、脱盐特性和挥发溶剂)的相容性。

蛋白质组学具有两个方法：“倒置法”，其涉及使用蛋白水解酶(例如胰岛素)直接分解生物试样，其在明确的位点剪切以产生复杂肽混合物，随后在包括液相色谱的平台上分析分解试样，随后进行串联的质谱分析(LC-MS/MS)；和“自上而下法”，其涉及使用例如液相色谱或者2维凝胶电泳的技术从复杂的生物试样分离完整蛋白，随后使用光谱分析或者凝胶成像平台进行差异表达分析。尽管倒置法分析维持了蛋白-蛋白相互作用，并且不会损失蛋白信息，但是由于完整蛋白处理的困难而受到限制，这是由于缺乏分离方法(仅基于凝胶的)以及对完整的高分子量蛋白进行质谱分析的挑战。

在蛋白质组学中，因为分析的高选择性和灵敏度，质谱(MS)是蛋白确定和表征最为重要的工具。电喷雾离子化(ESI)被认为是蛋白分析理想的离子化来源，因为下述两个特征：第一，由大分子形成多价电荷离子的能力(产生更低m/z的离子，其通过质量分析仪而容易地分离，例如四极和离子捕获)，并且第二，容易与色谱液相分离技术相结合。电喷雾离子化之后串联质谱(ESI-MS/MS)为用于蛋白鉴定和序列分析的一种最为常用的方法。

蛋白质组分析已在先由其它人实施以利用创伤性动物确定生物标志物并评价SCI的严重程度，但是这些方法尚未被用于确定创伤性SCI病人的CSF中的生物标志物，因为CSF采样是具有挑战性的；例如，在这里，脊髓损伤的差示神经蛋白质组分析已被执行以显示其不仅仅可以证明损伤，还可以评估严重程度。

系统生物学(SB)辅助的生物标志物整合

基因组和蛋白质组研究中快速发展的高通量技术帮助产生巨大量的数据。源自使用数据集成和入库技术的相关科学文献的全面的数据库可被开发。可以形成脑损伤相关信息的数据库，包括高通量“组(omic)”数据集(基因组、蛋白质组、代谢组、脂类组等)、“定向”通路和分子成像研究。系统建模和模拟对于未来有效的治疗研发是至关重要的。不同的模型表达已被建立，从而服务于这些目的。生物程序例如Pathway Studio,Gene Spring和Gene GO的图表通过结合基因组、蛋白质组和代谢组数据给出网络模型的视觉表达。然而，与由定向生物学研究所产生的或者已证实的量化数据相结合的不同模式已经出现并被发现进一步用于系统模拟和分析。这些生物信息软件(网络分析(Pathway Studio)，GeneSpring，信号网络(Ingenuity Pathway)和Gene GO)已被用于构造所生成的高通量数据的功能交互映射图。功能交互映射图描述了基因和/或蛋白变化的子集，其描述与所讨论的特异性扭曲相关的扰动细胞功能。交互映射图的主要作用在于它们预测和确定实验分析错过的特定基因和/或蛋白的能力，以及提供具有未知生理学的特定蛋白的潜在功能。

因为中枢神经系统(CNS)损伤是具有多种并发症的非常复杂的病症，所以大量的系统生物标记候选物可被用于匹配不同的病症。系统生物学工具为无偏向性的方法，用以确定非冗余的神经调制/神经毒性路径并进一步准确地找出候选的诊断生物标志物和/或用于治疗的分子标记。这些工具根据系统生物学所需要的高水平的、全面的观点来帮助组织可用的数据和知识。分析方法(例如支持矢量机(Support Vector Machines)、贝叶斯网络(Bayesian Networks)、认知地图(Cognitive Maps)和动态特征选择(Dynamic FeatureSelection))已被用于集成。系统生物学还支持科学发现的重复、无假设的方法，其在生物学研究中被逐渐地采用。通过全面的内部服务，所获得的高等级视角(通路、映射图、生物标志物)可以与数据源一起提供。据此，预测系统响应还可以通过采用基于最优化的预测模型来生成，因素为多组多阶段分析。

SCI和TBI均为毁灭性疾病，具有许多结果并且不具有已知的有效的治疗。尽管诊断急性创伤性SCI或TBI相当容易，但是损伤严重程度的评估以及疾病发展或恢复的推断经常是具有挑战性的。蛋白质组为用于生物标志物发现的具有希望的方法；其已被用于在具有动态视角的分子水平研究蛋白表达。系统生物学为用于确定CNS损伤例如SCI和TBI的其他不明显生物标志物的另一种方法。

为了证实候选TBI或SCI生物标志物蛋白在病态生物流体中的存在或升高程度，可分析脑脊髓液(CSF)，由于它们的可接近性，其最接近受伤部位和血液试样(例如血清，血浆)，来自人TBI或SCI病人或TBI和SCI的动物模型。其可以与正常对照生物流体试样相比。候选生物标志物随后在这样的生物流体中定量，使用免疫学方法例如免疫印迹和夹层酶联免疫吸附测定(sw-ELISA)方法以及数据分析。

具体实施方式

下文的实施例作为本发明的说明而被提供，并且不以任何方式被认为是限制。

实施例1

小鼠控制性皮质撞击损伤(CCI)为严重TBI：CCI设备被用于模拟TBI。使用4％异氟烷麻醉CB57BL/6小鼠(雄性，3-4月大，Charles River实验室)，氧气作为载气，持续4分钟，随后使用2-3％的异氟烷维持麻醉。在达到深度麻醉后，将小鼠以俯卧位置置于立体定向框架内，并通过耳部和门齿杆紧固。通过直肠热敏电阻探针连续监控身体核心温度，并通过将可调节温度的控制加热板放置在大鼠的下方来维持在37±1℃。使用用于CCI的一体式冲击设备(Impactor One Stereotaxic)(莱卡有限公司(Leica inc.))。冲击器为电磁控制的。动物以俯卧位置被安装在立体定向框架中，并通过耳部和门齿杆紧固。形成中线颅切口，并在中央缝合伤口附近、前囱和人字缝之间的中部执行单面(身体同侧)开颅术(3mm直径)。硬脑膜在皮层上保持为完整的。脑创伤使用所安装的冲击器尖部(具有2mm直径)通过以3.5m/s的速度、1.5mm的受压深度(对于严重损伤)和200ms的停留时间(受压时间)冲击右侧皮层(身体同侧皮层)诱导。伪造损伤的对照组动物(如果实施的话)经历相同的手术步骤，但是不接受冲击损伤。

小鼠单次和重复性轻微闭合性头部损伤以模拟震荡性TBI：在前述研究之后形成小鼠单次的反复性闭合性头部损伤(Shitaka等，J Neuropathol Exp Neurol2011.7；70(7):551–67)。随机选择小鼠，暴露至单次mCHI或rmCHI(四次冲击，冲击间隔为72h)，并且无损伤。在第1天，使用4％异氟烷麻醉小鼠，氧气作为载气，持续4分钟，随后使用2％至3％的异氟烷维持麻醉。在达到深度麻醉之后，将小鼠刮毛并以俯卧位置安置在立体定向框架中。脑创伤使用一体式冲击设备(Impactor One Stereotaxic)(莱卡有限公司(Leica inc.))来产生，通过使用市售橡胶冲击尖端(1cm厚，9mm直径)以4.0m/s的速度、3.8mm的受压深度和200ms的停留时间(受压时间)冲击矢状缝中部。冲击的中部相应于头颅和人字缝之间的中心矢状缝中部。橡胶尖端的变形将冲击力扩展至颅骨上。对于rmCHI小鼠，在原始损伤之后的第4、7和10天实施额外的损伤。伪造对照组动物经历相同的步骤，但是不接受冲击损伤。

小鼠超压爆炸波诱导脑损伤模型：超压攻击波诱导脑损伤(OBI)通过暴露至临时爆炸装置(IED)来执行，在研究和临床管理以及修复观点中，路边炸弹或者开道车运动或操作在TBI领域正在变为新出现的挑战，因为关于其病理学表现和结果所知甚少。冲击管具有4’内径和7英尺长，具有切实可行的超压和减压爆炸波。简要地，使用3-5％异氟烷麻醉小鼠，氧气作为载气，持续约3-5分钟。暴露至爆炸下的动物将从装置接受单次冲击，同时暴露至伪装爆炸下的动物将暴露至冲击管外部的单次爆炸的声音下，并未直接暴露至爆炸波。该设计特征在于4英寸内径冲击管(总共7英尺长)，包括高压驱动器部分，其末端聚集于氮气容器并且相对侧部分为用于Mylar膜(隔膜)插入的隔离物，之后为具有开口端的模块驱动部分(降低压力)(参见图1)。使用厚度0.05-0.07英寸的Mylar膜，从而提供100至300kPa(从轻微至高过压冲击)峰值压力的平均峰值超压，持续小于1.0ms，具有快速的指数衰减。小鼠及其头部使用尼龙搭扣(Velcro)紧固至金属丝网平台上，插入至少1英寸至驱动部分的开口端内。所使用的取向是这样的，即以俯卧位置的小鼠安置在水平金属丝网平台上，其鼻尖朝向即将到来的爆炸波。

实施例2

图4示出TBI(控制性皮质撞击损伤)和冲击过压脑损伤后小鼠脑(皮层)组织溶解产物中的TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)，转移活性响应DNA结合蛋白43kDa及其分解产物(BDP-39kDa和35kDa，25kDa)(图3))的检测。所示的检测方法为定量免疫印迹(western印迹)。也可使用其它方法例如夹层ELISA方法或者放大夹层ELISA。数据表示TDP-43BDP由受伤的脑细胞和组织释放至生物流体例如脑脊髓液流体(CSF)(图5)和/或血液包括血清和血浆中。

实施例3

图5示出在严重TBI(n＝21)之后释放至人CSF中与正常对照组(n＝12)的完整TDP-43和BDP(35K、25K)的检测。这种TDP-43和BDP释放模式可与人TBI之后释放至CSF中的αII-血影蛋白BDP(SBDP150，145)相当。所使用的检测方法为定量免疫印迹(western印迹)。也可使用其它方法例如夹层ELISA方法或者放大夹层ELISA，如通过SBDP所证明的。TDP-43及其BDP可能是由受伤脑细胞和组织释放至生物流体例如脑脊髓液(CSF)和血液包括血清和血浆内的，致使TDP-43及其BDP的生物流体水平在CNS损伤之后上升。该实施例还证明TDP-43和BDP定量测试可以使用第一个24h以及可能更长时间的生物流体来区分TBI和对照组受试者。

实施例4

图6和7示出血清总微管相关蛋白Tau(T-Tau)和Tau的磷酸化形式即P-Tau(位于Serine-202)以及P-Tau/T-Tau比升高的检测(图2)，在小鼠单次和反复性闭合性头部损伤(CHI，rCHI)以及单次和反复性爆炸超压脑损伤(OBI，rOBI)之后，在损伤后不同的时间点(第1、3、7、10、14和/或30天)进行。所使用的检测方法为定量放大夹层ELISA。可使用其它灵敏的免疫印迹模式。

实施例5

图8示出人类急性严重TBI CSF试样的总Tau和P-Tau标志物的检测。在这种人类严重TBI研究中，总Tau在急性TBI CSF组中有所升高，与对照组CSF相比，P-Tau和P-Tau/T-Tau比的升高在TBI SCI组中是更加突出的。该实施例证明Tau、P-Tau测试可以区分TBI和对照组受试者，使用第一个五天的生物流体。CSF Tau和P-Tau分析如上所述的进行。

实施例6

图9示出第1-3天和第30天(范围19-50天)严重TBI血清试样的总Tau、P-Tau和P-Tau/T-Tau比的检测，其高于正常对照组血清的水平。其进一步示出除了不同的P-Tau、Tau水平，P-Tau/T-Tau比的使用对于区分严重人TBI血清试样和正常对照组的急性(第1-3天)和慢性(平均30天)阶段来说是一种有效的诊断方法。血清/血浆Tau和P-Tau分析如上所述地进行。

实施例7

图10进一步示出慢性TBI病人(处于康复期)(TBI后平均6.3个月；范围1-12月)对比正常对照组的血浆试样中所检测到的P-Tau和P-Tau/T-Tau比的升高。n＝21-29。其示出除了不同的P-Tau、Tau水平，P-Tau/T-Tau比的使用对于区分严重人TBI血清试样对比正常对照组的急性(第1-3天)和慢性(第30天)阶段来说是一种有效的诊断方法。

实施例8

图11示出来自覆盖全部范围TBI(严重、中度、轻微)的人类TBI研究的血浆试样的Tau、P-Tau和P-Tau/T-Tau比。使用n＝65处于TBI急性阶段(24h内)的TBI受试者的血浆。T-Tau、P-Tau和P-Tau/T-Tau比可以区分对照组和不同TBI严重程度分组-GCS 13-15(轻微)，GCS 9-12(中度)和GCS 3-8(严重)。

图12示出Tau、P-Tau和P-Tau/T-Tau比可以区分对照组血浆试样以及CT正常和CT不正常TBI病人的血浆试样。换句话说，(CT-；或者头颅计算机断层摄影术扫描正常)均高于正常对照组，而TBI(CT+；或者示出病理学的头颅CT扫描)数值也是高的。这表示P-Tau/T-Tau比，当使用时，将对TBI的急性时间点具有强的区分诊断能力。

实施例9

大鼠脊髓损伤模型

成年雌性Fischer大鼠(220-250g)根据国立卫生研究院和美国农业部指南饲养。迈阿密大学的动物饲养和使用委员会机构批准了所有的动物试验。在手术之前，使用腹膜内注射麻醉大鼠(45mg氯胺酮/kg，5mg甲苯噻嗪/kg)。通过监控角膜反射和后肢对于疼痛刺激的缩回来确定麻醉是否充分。所有的动物均经历T9-T10椎板切除术。在手术过程中，大鼠被放置在暖垫上以维持体温在37±0.5℃。简单地说，大鼠腹侧被放置在消毒纱布的小钻头上方以评价手术部位，呈现背部解剖的充分暴露。2cm纵向皮肤切口沿着中线在T9旋转处理(spinus process)中居中。如上所述的，脊椎周围神经和韧带被横向切割和缩回，随后去除后刺的骨元素，包括薄层中使用微Rongiers的旋转处理。第九胸椎片段随后被暴露，而不通过去除椎骨的背侧部分而去除硬脑膜。暴露的脊髓随后通过10gm的重量通过使用纽约大学(NYU)-MASCIS冲击仪由12.5mm(中度)或25mm(严重)高度的下落而撞伤(图16)。这种模型和受伤严重程度已经在迈阿密大学的Dalton Dietric博士的实验室中以及其它实验室示出，用以产生完整描述模式的电生理、行为和组织病理学结果。

大鼠SCI-CSF收集

在SCI之后，于创伤后的4、24或48小时提取CSF试样。CSF如上所述地收集。在恰当的时间点，受伤的、伪造受伤的和空白组动物被如上所述地麻醉，并使头部可以沿着纵轴自由移动地在立体定向框架中固定。头部为曲折的，从而使得颈部中的外部枕外隆突突出并且在颈椎和枕骨部上形成背中线切口。寰枕膜通过钝器解剖法而被暴露，并且连接至聚乙烯管的25号针被插入至小脑延髓池内。每只大鼠收集约0.1至0.15ml的CSF，随后它们被移除并通过断头而被立即安乐死。CSF试样在4℃下以4,000xg离心4分钟，从而清除所有污染红细胞。

试样制备

SCI和对照组试样在液氮中被快速地冷冻并在干冰上使用小的研钵和研杵均匀化成微细粉末。粉末被刮至冷冻的微量离心管中，随后使用1％曲拉通X-100裂解缓冲液裂解，所述曲拉通X-100裂解缓冲液包含20mM Tris HCl pH 7.4,150mM氯化钠(NaCl)，5mM乙二胺四乙酸(EDTA)，5mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)，10μL 1M二硫苏糖醇(DTT)，100μL的磷酸酶抑制剂(均来自西格玛-奥瑞奇(Sigma-Aldrich))，以及足量的迷你蛋白酶抑制剂混合物片(罗氏生化公司(Roche Biochemicals))。在4℃下裂解3小时，每小时进行涡旋。裂解物随后在4℃、15,000g下10分钟离心以去除DNA、脂质和微粒。收集上层清液，并随后使用DCProtein Assay(BioRad)确定蛋白含量，蛋白浓度被标准化为1μg/μl，用于免疫印迹分析。制备合并的1mg SCI和对照组试样，使用CAX-PAGE进行差示分析。

实施例10人CSF试样(对照组，TBI，SCI)

使用创伤性脑损伤(TBI)和脊髓损伤(SCI)的存档去识别CSF试样。严重TBI研究的CSF从出现在急诊室的成年受试者收集。对于在格拉斯哥昏迷量表(GCS)<8的头部持续钝挫伤之后的受试者，收集长达10天或者直至内侧脑室切除术(IVC)不再有临床表现的CSF试样。CSF取自CSF引流系统的滴定管(buretrol)，由合格的和受过训练的医院员工根据医院标准步骤采样。可替换地，不超过1小时的全部收集时间的定时的CSF试样(10mL)被收集至10mL锥形聚丙烯离心管(BD Falcon)中。CSF试样(5-10mL)随后在台式离心机中于室温下以4,000RPM离心5-7分钟，从而去除松散的细胞和碎片。用移液管将1mL等分的清澈CSF(上层清液)移至2mL低温管中，并在-80℃下快速冷冻和存储于超低温冷冻柜中，直至使用。对于该研究，使用在受伤后第一个24h内收集的定时CSF试样(n＝14)。对照组试样CSF(n＝10)购自Bioreclaimation有限公司。

此外，在迈阿密大学医院招募分为中度-严重(AIS等级A、B和C)的脊髓损伤受试者(SCI)。病人根据美国脊髓损伤协会损伤分级(AIS)的损伤(损伤程度)和AIS恢复等级(改善)、尿动态测试(膀胱控制)、躯体感觉诱发电位测试和磁共振(MRI)扫描来分类。病人被进一步分为创伤性截瘫或创伤性四肢麻痹。对于CSF收集，当在L2-3或者L3-4执行腰椎穿刺，并且鞘内插入导管用于CSF的鞘内引流时，执行严格的无菌技术。定时的CSF试样被转移至玻璃管(无防腐剂、肝素或EDTA)，具有特定体积(3cc)，在室温下以4,000RPM旋转(用以去除松散细胞和碎片)。500μL等分的清澈CSF(上层清液)被置于1.2mL冷冻管中，并在-80℃下存储于超低温冷冻柜中，直至使用。在该研究中，CSF试样在48h内收集。

定量免疫印迹分析和抗体(组织，CSF)

凝胶电泳和电转移。使用在蒸馏水中包含65.8m M Tris(pH 6.8),0.1mM DTT，2％SDS，0.01％溴酚蓝和10％甘油的2x利姆里(Laemmli)试样缓冲液处理对照组和SCI损伤试样。来自每个试样的20微克的蛋白以10,000g离心1分钟，并随后通过SDS-PAGE在4-20％或者10-20％Tris/甘氨酸凝胶(英杰生命技术公司(Invitrogen Life Technologies))上在200V下于室温分辨60分钟。分馏的蛋白通过电印迹使用iBlot凝胶转移设备(iBlot GelTransfer Device)(英杰公司)转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)(英杰公司)，持续7分钟。在转移之后，所述膜用5％脱脂奶粉中，于TBST(20mM Tris-HCl,150mM NaCl和0.003％吐温-20，pH 7.5)中封闭1小时。

温育包含组织蛋白的免疫印迹膜和第一抗体，在4℃下振荡过夜。使用在1:1000的稀释度下，于5％牛奶中的单克隆抗鼠α血影蛋白(恩佐生命科学(Enzo Life Sciences)纽约，USA)，多克隆抗兔GFAP(艾碧康生物(Abcam)，MA，USA)和单克隆抗鼠UCHL-1(密理博(EMDMilipore)，马萨诸塞，USA)。使用多克隆抗兔铁转移蛋白(艾碧康生物(Abcam)，马萨诸塞，USA)，多克隆抗羊组织蛋白酶D(圣克鲁斯生物技术(Santa Cruz Biotechnology)，TX,USA)，多克隆抗兔磷酸丙糖异构酶(TIM)(圣克鲁斯生物技术(Santa CruzBiotechnology)，TX,USA)，和多克隆抗兔星形磷蛋白(PEA-15)(细胞信号(CellSignaling)，马萨诸塞，USA)，稀释度分别为5％牛奶中1:500、1:200和1:1000。在第二天，所述膜使用TBST冲洗三次，并使用碱性磷酸酶结合羊第二抗体(密理博(EMD Milipore)，马萨诸塞，USA)探针标记，其以1:5000稀释于5％牛奶中，持续1小时，随后进行TBST洗脱。免疫反应性使用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)/氮蓝四唑磷酸酶底物(科克加德&佩里实验室(Kirkegaard&Perry Laboratories)，盖瑟斯堡市，马里兰州，USA)检测。免疫反应带通过数字扫描仪成像，并且蛋白带密度随后通过NIH ImageJ软件来量化。

夹层ELISA分析(CSF，血清，血浆)

血清/血浆(30-100μL)，CSF(0.5-10μL)和/或脑组织裂解物(2-20μg总蛋白当量)试样将被处理，用于96孔板夹层ELISA生物标志物分析模式和不同量(0.020ng至200ng)的标准生物标志物蛋白(用于生成标准曲线)。这种方法用于测量TDP-43和BDP，Tau，P-Tau，GFAP和BDP，UCH-L1，组织蛋白酶D，铁传递蛋白，PEA-15，和TPI-1(TIM)。典型地，夹层ELISA包含一种捕捉抗体和一种检测抗体，用于目标蛋白。这些抗体可以是多克隆(兔)或单克隆(鼠)的。检测抗体使用荧光染料标记或者连接至辣根过氧化物酶(HRP)或者生物素，用于链霉亲和素-HRP基放大。使用Spectamax190-Pro酶标仪进行分析。可替换地，包括P-Tau和总Tau(市售总Tau ELISA试剂盒购自名称为Innotest hTau Ag(#80226)和PHOSPHO-TAU(181P)(#80323)(Innogenetics)。Biovendor的NF-H，GFAP ELISA，USCN公司的UCH-L1(www.uscnk.us)。可替换地，对于高灵敏度，P-Tau和Tau，使用围绕声音光纤免疫测定(SOFIA)，滚环扩增ELISA方法或者数字ELISA(Quanterix SIOMA系统)。

蛋白质组方法(T-PAGE RPLC-串联质谱)

CAX-PAGE RPLC串联质谱基于已确定的方法。其包括全面的多维度分离机制，具有阳离子/阴离子交换(CAX)色谱分析法，随后为一维聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以降低蛋白复杂度。随后使用反相液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)蛋白质组平台检查和表征与SCI相关的蛋白质组变化。

阳离子/阴离子交换色谱法步骤

使用BioRad Biologic DuoFlow系统执行CAX色谱，其具有磺酸丙基SCX(S1)和季铵SAX(Q1)改性的琼脂糖预封装离子交换柱(BioRad)，其被串联设置，并与QuadTec UV检测仪和BioFrac馏分收集器串联连接。缓冲液由在重蒸馏水中的20mM Tris-HCl(pH 7.5，分子生物学等级，飞世尔科技(Fisher Scientific))(流动相A)和在重蒸馏水中的20mM Tris-HCl与1M NaCl(飞世尔科技(Fisher Scientific)(流动相B)，已证实结晶度为99.8％)构成。来自混合裂解物的1mg蛋白试样使用最优化方法注射，用于差示分析。第一和第二线性梯度步骤为由0至5％B，和5至10％，每个5mL，流速为1mL/min，并且随后为六步梯度，每个步骤增加5％，由10％增至40％，于1mL中，最后的梯度步骤为由40至50％，于1mL中。之后，对于1mL，组合物被保持在50％B，并再次平衡至0％B，在3mL中。每次运行时，在280和214nm的波长下监测UV色谱。44个1mL馏分通过BioFrac馏分收集器而被自主地收集至保持在冰上的1.5mL螺旋帽微量离心管中。

1D-SDS-PAGE步骤

通过CAX色谱法收集的馏分使用微孔离心超滤单元(密理博公司(MilliporeCorporation))浓缩，其具有保留＞3kDa蛋白的能力。每个超滤单元都使用500μl的1％SDS(钝化，用于改善回收率)来处理，并在室温下浸泡三小时，并随后使用自来水冲洗所有的设备单元，之后使用蒸馏水冲洗，并在15,000rpm下旋转20分钟两次。所收集的馏分(0.5ml)被添加至超滤单元，并于4℃下在15,000rpm旋转50分钟。为每个单元添加(20μl)2X利姆里缓冲液(在蒸馏水中包含65.8mM Tris(pH 6.8)，0.1mM DTT，2％SDS，0.01％溴酚蓝和20％甘油)，并煮沸数秒，随后通过1000g离心3分钟收集。蛋白馏分被并行地上样(即紧随SCI 6h和SCI 24h)，装载20μl于Tris-甘氨酸缓冲液中的每个馏分至1mm宽的标准TGX kD凝胶(BioRad)中，在300V下持续20分钟。

凝胶带可视化和定量步骤

凝胶使用考马斯亮蓝(Coomassie blue)染色(BioRad)而可视化，用于差异带分析。凝胶和膜带的扫描使用爱普生表达8836XL(Epson Expression8836XL)高分辨率平板扫描仪(爱普生)来执行。UN-SCAN-IT软件(版本6.1，西尔克科学公司(Silk ScientificCorporation))被用做基于相对强度所选择的凝胶或膜带的定量密度分析。不同带之间的成倍增加或降低通过更大的数值除以更小的数值来计算，正号和负号表示SCI损伤后的上升或下降。差异带根据它们的二维位置框起来并标记。凝胶带强度通过NIH ImageJ软件来量化。

凝胶内蛋白酶解步骤

凝胶使用最适条件的LC-MS级别的水完全冲洗两次。切除差异带，切成数片，置于1.5mL低滞留微量离心管中，并使用100μL最适条件的LC-MS水冲洗。凝胶带再次用50％100mM碳酸氢铵(飞世尔科技)/50％乙腈(伯迪克-杰克森(Burdick-Jackson)，最适条件的LC-MS等级)冲洗。凝胶带使用100％乙腈脱水，并通过真空离心蒸发浓缩器(Speedvac)(Labcoco)干燥，它们随后使用50μL于50mM碳酸氢铵中的10mM二硫苏糖醇DTT(Thermo)复水，并在56℃温育30分钟。DTT由50μL于50mM碳酸氢铵中的55mM碘乙酰胺(安玛西亚公司(Amersham Biosciences))替代，并在室温下于黑暗中反应30分钟，以实现烷基化。凝胶块使用50mM碳酸氢铵冲洗，随后使用100％乙腈脱水，并通过真空离心蒸发浓缩器干燥。对于蛋白酶解，凝胶块使用15μL的12.5ng/μL胰蛋白酶溶液(Promega Gold)于4℃下再次复水30分钟，并随后添加20μL的50mM碳酸氢铵，并在37℃下温育过夜。使用50％乙腈/50％水和0.1％甲酸提取疏水肽。肽提取物通过真空离心蒸发浓缩器干燥，并使用0.1％甲酸重悬于20μL最适条件的LC-MS等级水中，在超声处理15分钟并在1500rpm下离心之后。胰蛋白酶处理的带提取物通过纳米喷雾反相液相色谱和串联质谱来分析。

反相液相色谱和串联质谱(RPLC-MS/MS)步骤

纳米反相液相色谱串联质谱被用于蛋白分离和确定。在纳升级超高效液相色谱(NanoAcquity UPLC)(沃特斯(Waters)，米尔福德，马萨诸塞州，USA)上运行纳米流；自动采样器被用于将2微升的每种试样上样至5μm颗粒尺寸的对称180μm x 20mm C18捕集柱，4μL/min，持续10分钟。随后，试样塞被上样至1.7μM颗粒尺寸BEH130C18 100μm x 100mm分析柱上，300nL/min。流动相由溶剂A(0.1％甲酸的水)和溶剂B(0.1％甲酸的乙腈)构成。分离在115分钟的运行时间内完成，流速为300nL/min。第一线性梯度为1％至40％B，超过90分钟，第二线性梯度为40％至100％B，超过5分钟，并在返回至原始流动相组合物(1％B)之前保持5分钟。于质谱仪Xcalibur 2.0.7(美国热电(Thermo))中，在LTQ-XL(Thermo，San Jose，CA，USA)上使用数据依赖采集方法收集串联质谱，其中数据依赖扫描被规定为标准，用以选择10种最丰富的离子，使用11个给定的色析法时间点(115分钟)的分离扫描事件，用于后续的分析。在动态排除的全扫描光谱MS(扫描事件1)中，质谱仪被设定，用以对10种最强的离子执行全扫描和后续的MS/MS扫描。在其MS/MS光谱被确认之后，动态排除暂时性地将物质放置在排除列表中，提供由全扫描光谱MS(扫描事件1)收集第二最强离子的MS/MS信息的机会。所有的MS/MS光谱均使用Proteome Discoverer 1.3(美国热电)进行分析。SEQUEST(版本:1.3.0.339)和X！Tandem(版本:CYCLONE(2010.12.01.1))。建立数据库搜索引擎以搜索胰蛋白酶-编入索引的蛋白质仓库-褐鼠序列(Rattus+norvegicus.fasta)(未知版本，35125条目)。所述搜索使用用于匹配具有0.8Da片段离子质量公差和2.00Da的母离子公差的前体的平均质量来实现。胰蛋白酶的脲基甲基化被选择为静态改性，而蛋氨酸的氧化被选择为动态改性。使用SEQUEST和X！Tandem，Scaffold(版本:Scaffold_3.3.3，蛋白质组学软件)的输出用于验证、组织和解析质谱数据。如果它们能够以高于95.0％的可能性确立，如通过肽预测算法所指出的，肽识别是可接受的。如果它们能够以高于99.9％的可能性建立并包含至少两个确定的肽，则蛋白识别是可接受的。

通过使用大鼠SCI组织(中枢的尾部片段，创伤后4小时、1天和7天)，和CAX-PAGERPLC-串联质谱蛋白质组方法，蛋白标志候选物就能够被确定。其它的脊髓组织(尾部，以及嘴部片段和中枢片段，脑脊髓液流体(CSF)和血液试样)形成大鼠研究，并且受伤病人的CSF和血清/血浆也被用于SCI病人的临床研究。确定SCI候选标志物组，其可用于与疾病发展相关联，或者用于确认潜在的SCI治疗目标(在表2、3中示出)。随后在人TBI受试者的生物流体中交叉检验这些生物标志候选物。确认的生物标志物对于所有的神经创伤类型(包括TBI和SCI)具有诊断、预测和控制作用。

实施例11 CAX-PAGE差异神经蛋白质组分析

CAX色谱被用于根据表面电荷分离SCI试样和对照蛋白，之后基于它们的分子量，通过一维凝胶电泳来分离蛋白。收集SCI大鼠挫伤模型SCI在4h、24h和7天时间点(n＝5，每个)的嘴部区域的混合脊髓组织裂解物试样首先进行CAX色谱法离子交换(CAX分离具有保持正电和负电蛋白的能力)。对于伪造和SCI大鼠裂解物的差异表达分析(波长280nm的UV色谱)，高蛋白回收率存在色谱差异，其归因于受伤的脊髓蛋白质组。伪造的和SCI蛋白被分为28个馏分(1ml)，并在使用串联CAX柱之后收集。蛋白馏分在一维凝胶上并列分析，用于进行差异比较，24h伪造组对比24h SCI以及7天伪造组对比7天SCI。根据它们的二维位置，差异带被框起来并用数字和字母标记(例如由馏分X的通道切割的上部带被标记为XA)。ImageJ密度测定软件被用于定量分析所选择的差异凝胶带强度，从而获得相对倍数的提高或降低。

差异显示的带选自一维凝胶并切成多个部分，用于蛋白质组分析，随后用胰蛋白酶处理。胰蛋白酶处理的肽通过在线反相液相色谱和串联质谱(RPLC-MS/MS)来分离，用于蛋白确认。所有的MS/MS谱图均使用Proteome Discoverer 1.3(Thermo)进行分析，SEQUEST和X！Tandem数据库搜索引擎已被用于搜索试验光谱，相对于大鼠索引数据库，并通过Scaffold 3验证。基于所确认的独特肽、序列覆盖率和分子量凝胶带，分离每个带中的蛋白标志候选物。

分别记录于表2和3中的24h和7天的41和38蛋白通过伪造组和SCI之间的差异表达分析来确认。经确认的蛋白被分组为具有提高的(22和22蛋白)或者降低的(19和16蛋白)丰度，分别对应于24h和7天。SCI(24h)后具有升高水平的蛋白包括醛脱氢酶4族，成员A1(Aldh4a1)蛋白(片段)，LOC367586蛋白，氨基酰化酶-1A，转酮醇酶，γ-烯醇酶，延伸因子2，蛋白Tln 1，和过氧化物氧化还原酶-2。在7天后，列表包括醛-酮还原酶族1，成员B10(醛醣还原酶)，丙酮酸激酶PKM，酰基-辅酶A合成酶家族成员2，线粒体，和蛋白-L-异天冬氨酸(D-天冬氨酸O-甲基转移酶)。在SCI(24h)后具有降低含量的蛋白中，其为异柠檬酸脱氢酶(NADP)，甘露糖-6-磷酸异构酶，吡哆醛激酶，微管不稳定蛋白，和外周髓磷脂蛋白2(Pmp2)。在7天后，醇脱氢酶[NADP(+)]，L-乳酸脱氢酶B链，核糖基二氢烟碱脱氢酶[醌]，和ATP柠檬酸裂合酶-CRA异构体。某些差异表达的蛋白在24h和7天时间点是共同的，其为膜联蛋白A1和A2，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，Pgm1蛋白(片段)，谷胱甘肽S-转移酶Mu5，磷酸丙糖异构酶和铁转移蛋白(血清铁传递蛋白)。而且，确认在上调整带和下调整带中存在相同的蛋白。这可被解释为蛋白质族(例如：膜联蛋白1&2)，在CAX或PAGE中的移动性会随着蛋白改性而变化，或者通过蛋白酶(BDP)而改变，所以这些蛋白由于表面电荷的差异可以在不同的馏分中洗提。在第1天和第7天之间SCI蛋白水平提高的组之间；我们发现他们中的7个重叠(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，醇脱氢酶[NADP(+)]，膜联蛋白A2，Pgm1蛋白，磷酸丙糖异构酶(TIM)，谷胱甘肽S-转移酶Mu5，血清铁传递蛋白(铁传递蛋白))。在第1天和第7天之间，SCI后蛋白水平降低的组，仅两种蛋白位于两个列表上(膜联蛋白A2和Pgm1蛋白)。

因为坏死、细胞凋亡和细胞死亡路径在SCI损害后的早期被激活，已知的生物标志物，αII-血影蛋白分解产物(SBDP)SBDP-150和SBDP-145被标记为钙蛋白酶介导的坏死损伤的报道因子；SBDP-120作为半胱天冬酶介导的细胞凋亡的标志物，并且GFAP分解产物GBDP-44、BDP-40作为钙蛋白酶介导的神经胶质损伤的报道因子，用以验证新确认候选物的潜在价值。候选蛋白的选择是基于脊髓特异性、抗体可用性以及肽丰度水平。五种生物标志候选物被选择，血脑屏障(BBB)定位铁转移蛋白、溶酶体蛋白酶组织蛋白酶D、磷酸丙糖异构酶(TPI-1)、星形磷蛋白-15kDa(PEA-15)，和潜在的冲击生物标志物二磷酸核苷激酶A，用以确认它们与SCI相关的蛋白改变。脊髓结构和细胞组分的蛋白水解损坏标志物通过定量免疫印迹来验证，对于每种蛋白使用特定的抗体。如上所述蛋白的不同改变通过使用(组织裂解液和CSF)伪造和SCI(4h、24h和7天)组来确认，其在两个严重程度点(中度和严重)，在大鼠脊髓组织(喙、中枢)和CSF中。

实施例12

图13示出代表性蛋白生物标志物的SCI组织免疫印迹验证。在左上部分的图形中，SCI后生物标志物验证的时间进程通过在三个时间点(4h、24h和7天)收集的嘴部分(伪造组，以及两种SCI严重程度)的大鼠脊髓组织(中枢)裂解物的Western印迹来说明，已知的标志物探针为αII-血影蛋白和GFAP以及MBP。在其余图板中，用于αII-血影蛋白分解产物SBDP150，145，120，GFAP和GFAP-BDP(44和40KDa)和MBP生物标志物的脊髓组织裂解物试样(伪造组以及两种SCI严重程度，在3个时间点)的免疫印迹定量分析。所有的生物标志物均在受伤后升高，除了组织中的MBP标志物在SCI后的7天有所降低。

图14示出代表性蛋白生物标志物的SCI组织免疫印迹验证。在上部图板中，SCI后新生物标志候选物验证的时间进程由在三个时间点(4h、24h和7天)收集的嘴部分(伪造组、以及两种SCI严重程度)的大鼠脊髓组织(喙)裂解物的Western印迹来描述，新的候选标志物探针包括铁传递蛋白、组织蛋白酶D、TPI-1和PEA-15。碳酸酐酶II的Western印迹用作上样对照(未示出)。在底部图板中，用于TBI后的脊髓组织裂解物试样的免疫印迹定量分析组织蛋白酶D、TPI-1和PEA-15生物标志物的提高。所有的标志物均在SCI后的4h和24h升高，除了Cath D在受伤后具有延迟的升高(在第7天)。

图15进一步描述了通过免疫印迹方法在SCI后大鼠CSF中代表性SCI生物标志物升高的可检测性。在图板(A)中，SCI后生物标志物释放和新的候选标志物验证的时间进程通过在三个时间点(4h、24h和7天)收集的大鼠脊髓CSF试样(伪造组、以及两种SCI严重程度)的Western印迹定量分析来描述，标志物探针为αII-血影蛋白(SBDP)，铁传递蛋白，GFAP，GFAP-BDP和TPI-1。所示的检测方法为定量免疫印迹法(western印迹)。也可使用其它方法例如夹层ELISA方法或者放大夹层ELISA。

图16示出αII-血影蛋白-BDP(SBDP)、铁传递蛋白、GFAP、GFAP-BDP和TPI-1的时间进程，CathD和PEA-15生物标志物在SCI后释放至人的CSF(2个病人)中，由免疫印迹检测。

图17示出类似的SCI生物标志物(αII-血影蛋白-BDP(SBDP)、铁传递蛋白、GFAP、GFAP-BDP和TPI-1、CathD和PEA-15)在SCI之后释放至人CSF中的平行时间进程，由免疫印迹检测，并经处理以用于定量分析(n＝12-15个病人)。在该实施例中，所示的检测方法为定量免疫印迹(Western印迹)。可使用其它方法例如夹层ELISA方法或者放大夹层ELISA。

图18示出相同受试者相同时间点的人脊髓损伤CSF和血清GFAP水平的关联(n＝12受试者)，尽管CSF中的GFAP水平为约10-100，高于在血清中发现的。如果CNS损伤生物标志物被示出为在人CSF试样中是升高的，那么预期它们在血液中(例如血清、血浆试样)也以可定量的方式升高。

实施例13神经系统生物学(SB)途径和相互作用组分析

脑损伤的不同类型和所确认的SCI生物标志物(表4、5、6)被用于系统生物学(SB)，以获得相互作用组映射图(图19和20)，其能够帮助确认其他不明显的途径或热点。系统生物学(SB)为新的科学领域，其分析生物系统(基因、蛋白质、代谢物等)中所有单独部分之间的关系，通过定量描述他们之间的相互作用。这种方法的目标在于开发这些系统的计算模型，因此，系统对于任意种类扰动例如环境扰乱、基因突变等的响应就可被预测。多种不同生物标志物类型的途径分析已被或者可被用于揭示CNS疾病的关联；包括神经退化疾病、中风、创伤性脑损伤(TBI)和脊髓损伤(SCI)。

试验系统生物学方法

SB方法被用于确定在脑损伤和SCI的发病机理中的临界生物化学途径。PathwayStudio软件9.0(Ariadne Genomics Inc.MD，USA)被用于对单个试样鉴别显著途径和相互作用组，作为预测临床结果的信号。脑损伤系统和SCI确定候选生物标志物的途径被生成。包括急性损伤，神经炎，神经再生和神经退化标志物(表2)的不同的脑系统生物标志物从文献采集，并随后用于生成脑损伤系统生物标志物列表(表3)。SCI候选生物标志物可被确定(表4)，并被单独输入至Pathway Studio中，用于SB分析。

神经系统生物学分析

Pathway Studio 9.0已被用于搜索可能的蛋白-蛋白相互作用、共同的调节剂、细胞突起和用于在不同的损伤系统生物标志物蛋白之间关联的相关途径(表4，表5)。网络使用“最短路径”算法生成，以绘制变化蛋白之间的相互作用。被认为是聚焦于TBI疾病的发病机理的数种过程使用这种搜索来确认。这些过程的一些实例包括细胞死亡，发炎，氧化和凋亡(图19)。

类似地，SCI候选生物标志物使用SCI的大鼠模型(表6)来确认，并且这些候选生物标志物蛋白被输入至Pathway Studio中，用于SB分析。使用“最短路径”算法，这些蛋白组分之间潜在的相互作用被绘制(图20)。数种非冗余会聚途径被确认，它们凸显神经死亡机制、细胞浸润、氧化应激和细胞分化路径的潜在作用，是SCI的主要作用者。其它数据以及文献挖掘和新的试验可以实施，从而进一步理解脊髓结构和功能变化、SCI恢复、并发症和其它SCI相关并发症所涉及的病理路径。这样的映射图还可以应用于SCI、TBI或类似CNS损伤的诊断、预测和控制。这些SB方法允许CNS损伤的确认或其它不明显的生物标志物。由这种SB方法所支持有效的生物标志物为S100b、IL-6、iba-1、视锥蛋白状蛋白和BDNF以及Pro-BDNF蛋白(表1)。

实施例14其它TBI和SCI生物标志物和验证

图21示出人脊髓损伤CSF试样，示出显著升高的新的SCI生物标志物S100b和IL-6。SCI病人CSF试样在受伤后的1天至6天收集。在这里所示的为源自病人n＝12-15和对照组n＝10-12的所有试样。

图22示出在急性人TBI CSF试样中检测升高的铁传递蛋白，CathD，TPI和PEA-15以及CNS损伤生物标志物GFAP和GFAP-BDP与正常对照组(N＝10-14)对比的实施例。基于SCICSF的数据(图14、16)，铁传递蛋白，CathD，TPI-1和PEA-15被确认为新的神经损伤生物标志物。因为SCI和TBI为类似的和相关的神经创伤，所以可能的是，铁传递蛋白，CathD，TPI-1和PEA-15还将在TBI病人的生物流体中(例如CSF)升高。在这里，在TBI CSF中，相同的标志物铁传递蛋白，CathD，TPI-1和PEA-15升高事实上支持这种观点(GFAP和GFAP-BDP还作为基准进行分析)。

图23示出人创伤性脑损伤和脊髓血清试样，示出当与对照组血清试样比较的时候，升高的新的生物标志物BDNF(成熟形式)。所使用的TBI和SCI病人试样在受伤后24小时内收集。所示的为SCI和TBI n＝10，对照组n＝16。TBI和SCI BDNF水平高于对照组血清。BDNF为神经营养蛋白的成员，并且是与神经生长因子相关的。BDNF被发现于脑和外周，BDNF作用于CNS的神经元和外周神经系统(PNS)，支持现有神经元的存活，并有助于新的神经元和突触的生长和分化。在脑中，海马体、皮质和基底前脑是活跃的。其还表达于视网膜、运动神经元中，并且还存在于肾脏、前列腺和唾液中。

图24示出人创伤性脑损伤血清与对照组血清对比的生物标志物pro-BDNF概况。BDNF还存在为pro-BDNF形式(前体)。所使用的TBI病人试样在受伤后的24h和240h(10天)收集。TBI n＝20，对照组n＝16。pro-BDNF水平在TBI后的24h和240h检测为更高。由此，分析pro-BDNF和BNDF的组合使用能够被用作TBI或SCI的串联生物标志物。

图25示出人和小鼠创伤性脑损伤血清新的微神经胶质生物标志物Iba-1与对照组血清对比的概况。左侧图板示出空白鼠对比控制性皮质撞击损伤鼠(TBI、CCI)的在受伤后第1天和第7天的血清试样(n＝6)，每个均分析Iba-1水平。Iba-1水平在小鼠血清中是可检测到的，并被发现与空白对照组血清水平相比，在受伤后的1天和7天，在TBI血清中是升高的(***p<0.001)。右侧图板示出严重TBI病人试样，在受伤后的24h和168h(7天)收集。TBI n＝12，对照组n＝10。Iba-1水平在人血清中是可检测到的，并且发现与对照组对比，在TBI-24h(**p<0.005)和TBI-168h(***p<0.001)中是升高的。

图26示出在人TBI CSF和人脊髓损伤和TBI血清中，与各个对照组相比，类视锥蛋白状蛋白-1(VSNL1)升高。左侧图板示出对照组或TBI(第1天)的CSF试样VILIP-1水平的分析。右侧图板示出所使用的严重SCI和TBI病人血清试样在受伤后24小时收集(n＝6-8)，其中VILIP-1水平在人血清中是可检测到的，并被发现与对照血清组(5.33±0.50)相比，在SCI-24h(6.07±1.03pg/mL；平均值+标准偏差)和TBI-24h(7.06±0.63)中是升高的。这是新的发现，尽管VILIP-1被支持为对于阿尔茨海默病是可能的标志物(Lee等，ClinChem.2008.8 14；54(10):1617–23)，但是现有的数据仍未支持其可能是TBI或SCI的生物标志物。VSNL1为神经钙传感器蛋白的视锥蛋白/恢复蛋白子族的成员。编码蛋白为在小脑的颗粒细胞中强烈表达的，并且还在脑的其余部分中的其它神经元中强烈地表达。

数据还推断出不仅VILIP-1为TBI/SCI生物标志物，而且在CNS(VSNL2，VSNL3)中丰富的其它视锥蛋白状蛋白(表1)也能够作为CNS损伤的生物标志物。

表4.不同类型的创伤性脑损伤生物标志物类别

表5.不同类型的创伤性脑损伤生物标志物目录

表6.脊髓损伤候选生物标志物目录