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一种利用石蒜小鳞茎快繁培养产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法

摘要

本发明提供了一种用中国石蒜小鳞茎组织培养产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法,以‘中国石蒜’鳞茎为外植体,经灭菌、接种,培养一段时间后,在鳞片伤口处产生小鳞茎,继续对小鳞茎进行增殖培养。取中国石蒜小鳞茎组织烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次,得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。本发明应用组织培养技术克服石蒜属植物资源紧张,加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏化学合成复杂的问题。所用基本培养基以SH培养基为基础,辅以6‑苄氨基腺嘌呤、α‑萘乙酸、酵母提取物等成分;为进行工厂化生产加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏提供基础,环境友好,原料丰富,可很好缓解市场对加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏供应缺口大的问题。

著录项

  • 公开/公告号CN106538383A

    专利类型发明专利

  • 公开/公告日2017-03-29

    原文格式PDF

  • 申请/专利权人 聊城大学;

    申请/专利号CN201610933962.1

  • 发明设计人 穆红梅;

    申请日2016-11-01

  • 分类号A01H4/00;

  • 代理机构青岛致嘉知识产权代理事务所(普通合伙);

  • 代理人李浩成

  • 地址 252000 山东省聊城市东昌府区湖南路1号

  • 入库时间 2023-06-19 01:51:07

法律信息

  • 法律状态公告日

    法律状态信息

    法律状态

  • 2022-10-14

    未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A01H 4/00 专利号:ZL2016109339621 申请日:20161101 授权公告日:20190510

    专利权的终止

  • 2019-05-10

    授权

    授权

  • 2017-04-26

    实质审查的生效 IPC(主分类):A01H4/00 申请日:20161101

    实质审查的生效

  • 2017-03-29

    公开

    公开

说明书

技术领域

本发明涉及加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的产生,特别是一种通过中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法。

背景技术

加兰他敏( Galanthamine),又名加兰沙明,化学式为C17H21NO3,分子量是287.36。白色或微黄色结晶性粉末。无臭,味苦。熔点127~129℃。溶于乙醇、丙酮、氯仿,难溶于苯、乙醚、水。通常以石蒜科(Amaryllidaceae>

石蒜碱(Lycoris),化学式为C16H17NO4,分子量是287.30,棱住状晶体。熔点275-280℃(分解)。有右旋光性。不溶于水,难溶于乙醇和乙醚。是从石蒜科(Amaryllidaceae>

力可拉敏(Lycoris),又名石蒜胺碱、二氢加兰他敏。化学式为C17H23NO3,分子量是289.38,熔点122-124>

目前,生产加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏有以下几种途径:①直接从石蒜科植株中提取; ②半合成法,即先从中国石蒜中提取中间体,再经合成为石蒜碱成品; ③全合成法,但由于步骤多,成本高尚未投入生产;④利用生物技术、培养能产生石蒜碱的石蒜小鳞茎。其中“培养能产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的中国石蒜小鳞茎”属于“环境友好型”工艺,利用石蒜植物小鳞茎培养,可以克服植株原材料不足的问题,保护濒危石蒜植物资源,而且对环境无污染、可周年生产,不受季节气候限制,科学家普遍认为,利用石蒜植株小鳞茎生产加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏代表着石蒜碱生产未来方向。

发明内容

针对加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏提取原料石蒜植株市场缺口较大的问题,本发明目的是提供一种通过中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法。

本发明的技术方案是:利用中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法,中国石蒜鳞茎为外植体材料,经75%酒精杀毒,0.1%氯化汞灭菌处理,置于含有6-BA 5.0 mg/L和0.5 -1.5mg/L NAA的SH培养基中。琼脂0.75%,蔗糖3-9%,pH5.8-5.95,培养温度19~23℃,光照800~1200 lx,每天光照12 h,黑暗12 h。取中国石蒜小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次,得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤,定容至10mL备用。经HPLC检测,石蒜小鳞茎中含有加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏,平均含量为26.51、15.91和63.67 μg/g 干重。

具体包括下列步骤:

A、外植体的选择和灭菌处理:以石蒜鳞茎为外植体,2%~3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗,摇床,再用清水冲洗,经75%酒精杀毒,0.1 %氯化汞灭菌处理,无菌水冲洗,备用;

B、外植体接种:将经过步骤A中准备的外植体,接种在含有6-BA 5.0 mg/L和0.5 mg/L NAA,2,4-D2.0 mg/L的SH培养基中,其中蔗糖30g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.8-5.95;每天光照8 h,黑暗16 h;

C、小鳞茎的诱导:将经过步骤B中得到的外植体,培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA BA的SH培养基中,其中蔗糖40-60g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.80-5.95,每天光照12 h,黑暗12 h。至出现中国石蒜小鳞茎;

D、小鳞茎培养:将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中,其中蔗糖60-90g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.80-5.95,每天光照12 h,黑暗12 h。培养10-15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量;

E、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提取:将步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次,超声处理时间为25-35min,得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤,0.45μm滤膜过滤。定容至10mL备用;

F、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测:经HPLC检测,石蒜小鳞茎中含有石蒜碱和力可拉敏,平均含量为26.51、15.91和63.67 μg/g 干重。

前面所述的方法,优选的是,步骤A所述石蒜为石蒜科石蒜属植物‘中国石蒜’(Lycoris chinensis)。

前面所述的方法,优选的是,步骤A所述摇床100-150转摇15-20分钟,用清水冲洗时间为15-20分钟。

前面所述的方法,优选的是,步骤A浸泡灭菌时间为10-13分钟,无菌去离子水冲洗次数为6-8次。

前面所述的方法,优选的是,步骤D所述酵母提取物制备:精确称量25 g的酵母提取物(yeast extract),加入125 ml 蒸馏水,然后加入100 ml 乙醇,放入4 ℃冰箱提取4 d,弃去上清夜,把剩余的粘稠沉淀物再次溶解于125 ml蒸馏水中再次进行乙醇提取。用100 ml的蒸馏水溶解最终的沉淀物,在高压灭菌锅中121 ℃灭菌2 h贮存于4 ℃冰箱中备用。诱导物的浓度用总的碳水化合物含量来表示,以蔗糖为标准品采用苯酚-硫酸比色法确定其浓度。

前面所述的方法,优选的是,步骤F:色谱条件为:Kromasil C18柱 :5 µm,150mm×46mm ;以乙腈—水相(20:80,每800 ml水相中含有2.67 ml二丁胺,用磷酸调节pH为9.0±0.05)为流动相;流速1.0 m1/min;检测波长:289 nm;柱温:室温;进样量:10µl。

本发明利用中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏在以下四个方面具有重要意义:本发明应用组织培养技术克服加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏化学合成复杂的问题:

(1)小鳞茎生长迅速,能够在生物反应器中工业化生产,本发明为进行工厂化植物生产加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提供技术基础,占用空间小、培养简单、成本相对较低;不受地区、季节、气候限制,一年四季均可生产;(2)克服石蒜属植株生长缓慢,可缓解石蒜植物资源濒危及严重不足的问题;(3)环境友好、原料丰富,可很好缓解市场对加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏供应缺口大的问题;(4)小鳞茎育种和选育速度很高,可以通过基因工程等方法筛选高产株系,提高小鳞茎的生产能力,提高加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的产量。

本发明所用培养基配制简单,诱发时间短,小鳞茎生长快,加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量高,易于操作、大规模生产。

本发明以‘中国石蒜’鳞茎为材料,开展以中国石蒜鳞茎培养小鳞茎的工作,这为保护石蒜种质资源,促进利用生物反应器方法获取加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提供了一条新途径,为解决加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏生产中石蒜原料的短缺、提高加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏产量,提供植物生物反应器生产的方法。

具体实施方式

下面结合实施例详细说明本发明的技术方案,但保护范围不被此限制。

本发明提供的是一种利用石蒜属植物小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的方法,以‘中国石蒜’鳞茎为材料,经75%酒精杀毒,0.1 %氯化汞灭菌处理,置于含有SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5 mg/L NAA +2,4-D2.0 mg/L培养基中,然后置于小鳞茎诱导培养基中:SH+6-BA 5.0 mg/L+1.0mg/L NAA的SH培养基,最后转接于6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中。培养15天后,进行加兰他敏、石蒜碱,力克拉敏提取。将小鳞茎用烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次,超声处理时间为25-35min,收集上清液, 0.45μm滤膜过滤,定容至10mL备用。经HPLC检测,石蒜小鳞茎中含有石蒜碱和力可拉敏,平均含量为26.51、15.91和63.67 μg/g 干重。

具体包括下列步骤:

A、外植体的选择和灭菌处理:以‘中国石蒜’鳞茎为外植体,2%~3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗,摇床100-150转摇15-20分钟,再用清水冲洗,经75%酒精杀毒30秒,0.1 %氯化汞灭菌处理,浸泡灭菌10-13分钟,无菌水冲洗6-8次,备用;

B、外植体接种:将经过步骤A中准备的外植体,接种在含有6-BA 5.0 mg/L和0.5 mg/L NAA ,2,4-D2.0 mg/L的SH培养基中,其中蔗糖30g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.80-5.95;每天光照8 h,黑暗16 h。

C、小鳞茎的诱导:将经过步骤B中得到的外植体,培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA BA的SH培养基中,其中蔗糖40-60g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.80-5.95,每天光照12 h,黑暗12 h。至出现中国石蒜小鳞茎;

D、小鳞茎培养: 将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中,其中蔗糖60-90g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.8-5.95,每天光照12 h,黑暗12 h。培养10-15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量;

其中酵母提取物制备:精确称量25 g的酵母提取物(yeast extract),加入125 ml 蒸馏水,然后加入100 ml 乙醇,放入4 ℃冰箱提取4 d,弃去上清夜.把剩余的粘稠沉淀物再次溶解于125 ml蒸馏水中再次进行乙醇提取。用100 ml的蒸馏水溶解最终的沉淀物,在高压灭菌锅中121 ℃灭菌2 h贮存于4 ℃冰箱中备用。诱导物的浓度用总的碳水化合物含量来表示,以蔗糖为标准品采用苯酚-硫酸比色法确定其浓度。该处理措施得到的酵母提取物,对中国石蒜小鳞茎的培养有促进作用,对小鳞茎内的加兰他敏等生物碱的含量提高有促进作用。

E、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提取:将步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次,超声处理时间为25-35min,得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤,定容至10mL备用;

F、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测:经HPLC检测,石蒜小鳞茎中含有石蒜碱和力可拉敏,平均含量为26.51、15.91和63.67 μg/g 干重 。

步骤A)所述的中国石蒜基源植物为‘中国石蒜’(Lycoris chinensis),取石蒜鳞茎为外植体,2%~3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗,外植体经75%酒精杀毒30秒,再经0.1 %氯化汞灭菌处理10-13分钟。该处理措施可以有效对石蒜鳞茎表皮和内部进行灭菌,为植物组织无菌培养做好外植体的准备工作。

步骤B)置于含有6-BA 5.0 mg/L和0.5 mg/L NAA ,2,4-D2.0 mg/L的SH培养基中,其中蔗糖30g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.8-5.95;每天光照8 h,黑暗16 h。通过多个实验配方对比,在SH基本培养基中添加6-BA 5.0 mg/L和0.5 mg/L NAA,2,4-D2.0 mg/L激素,能有效的促进中国石蒜小鳞茎的形成。

SH培养基为Schenk and Hildebrandt基本培养基,所述的SH培养基的成分按常规为:硝酸钾(KNO3)2500.00 mg/L,硫酸镁(MgSO4)195.05 mg/L,磷酸二氢铵 [(NH4)>2>4]300.00>2)151.00>

步骤C)培养5-7天后,将经过步骤B中得到的外植体,培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA的SH培养基中,其中蔗糖40-60g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.80-5.95,每天光照12 h,黑暗12 h,至出现中国石蒜小鳞茎;通过多个实验配方对比,在SH基本培养基中添加6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA,蔗糖40-60g/L更有利于小鳞茎的快繁和干重增加。

步骤D)将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中,其中蔗糖60-90g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.80-5.95,每天光照12 h,黑暗12 h。培养10-15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量;通过多个实验配方对比,在SH基本培养基中添加6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L,蔗糖60-90g/L更有利于小鳞茎的快繁和干重增加,同时有助于提高小鳞茎内加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的含量。

步骤E) 步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次,超声处理时间为25-35min,得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤,定容至10mL备用;甲醇为提取液,超声波萃取可以有效提高石蒜体内生物碱的提取率。

步骤F)加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测:色谱条件为:Kromasil C18柱 :5 µm,150mm×46mm ;以乙腈—水相(20:80,每800 ml水相中含有2.67 ml二丁胺,用磷酸调节pH为9.0±0.05)为流动相;流速1.0 m1/min;检测波长:289 nm;柱温:室温;进样量:10µl。加兰他敏,石蒜碱,力克拉敏的标准品由福建利科生物技术有限公司提供,批号061210-2,纯度 ≥ 98.0%。经HPLC检测,石蒜小鳞茎中含有加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏,平均含量为26.51、15.91和63.67 μg/g 干重。使用该检测条件,可以非常有效的检测出甲醇提取液中石蒜碱和力可拉敏。

实施例1

一种利用中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的方法,包括下列步骤:

A)外植体的选择和灭菌处理:以‘中国石蒜’鳞茎为外植体,2%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗,摇床100转摇15分钟,再用清水冲洗,经75%酒精杀毒30秒,0.1 %氯化汞灭菌处理,浸泡灭菌10分钟,无菌水冲洗6次,备用;

B、外植体接种:将经过步骤A中准备的外植体,接种在含有6-BA 5.0 mg/L和0.5 mg/L NAA ,2,4-D2.0 mg/L的SH培养基中,其中蔗糖30g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.8;每天光照8 h,黑暗16 h。

C、小鳞茎的诱导:将经过步骤B中得到的外植体,培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA BA的SH培养基中,其中蔗糖40g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.80,每天光照12 h,黑暗12 h。至出现中国石蒜小鳞茎;

D、小鳞茎培养: 将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中,其中蔗糖60g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.80,每天光照12 h,黑暗12 h。培养15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量;

E、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提取:将步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次,超声处理时间为25min,得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤,定容至10mL备用;

F、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测:经HPLC检测,石蒜小鳞茎中含有加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏,平均含量为31.51、20.91和75.33μg/g 干重。

实施例2

一种利用中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的方法,包括下列步骤:

A)外植体的选择和灭菌处理:以‘中国石蒜’鳞茎为外植体,3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗,摇床120转摇25分钟,再用清水冲洗,经75%酒精杀毒30秒,0.1 %氯化汞灭菌处理,浸泡灭菌11分钟,无菌水冲洗8次,备用;

B、外植体接种:将经过步骤A中准备的外植体,接种在含有6-BA 5.0 mg/L和0.5 mg/L NAA ,2,4-D1.0 mg/L的SH培养基中,其中蔗糖30g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.8;每天光照8 h,黑暗16 h。

C、小鳞茎的诱导:将经过步骤B中得到的外植体,培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA BA的SH培养基中,其中蔗糖50g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.85,每天光照12 h,黑暗12 h。至出现中国石蒜小鳞茎;

D、小鳞茎培养: 将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.2g/L的培养基中,其中蔗糖70g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.85,每天光照12 h,黑暗12 h。培养15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量;

E、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提取:将步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次,超声处理时间为25min,得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤,定容至10mL备用;

F、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测:经HPLC检测,石蒜小鳞茎中含有加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏,平均含量为28.22、17.15和66.78μg/g 干重。

实施例3

一种利用中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的方法,包括下列步骤:

A)外植体的选择和灭菌处理:以‘中国石蒜’鳞茎为外植体,3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗,摇床120转摇30分钟,再用清水冲洗,经75%酒精杀毒30秒,0.1 %氯化汞灭菌处理,浸泡灭菌12分钟,无菌水冲洗8次,备用;

B、外植体接种:将经过步骤A中准备的外植体,接种在含有6-BA 5.0 mg/L和1.0 mg/L NAA ,2,4-D1.0 mg/L的SH培养基中,其中蔗糖30g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.90;每天光照8 h,黑暗16 h。

C、小鳞茎的诱导:将经过步骤B中得到的外植体,培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA BA的SH培养基中,其中蔗糖40g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.90,每天光照12 h,黑暗12 h。至出现中国石蒜小鳞茎;

D、小鳞茎培养: 将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中,其中蔗糖60g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.90,每天光照12 h,黑暗12 h。培养15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量;

E、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提取:将步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次,超声处理时间为25min,得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤,定容至10mL备用;

F、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测:经HPLC检测,石蒜小鳞茎中含有加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏,平均含量为23.21、13.15和59.71μg/g 干重。

实施例4

一种利用中国石蒜小鳞茎产生加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏的方法,包括下列步骤:

A)外植体的选择和灭菌处理:以‘中国石蒜’鳞茎为外植体,3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗,摇床150转摇20分钟,再用清水冲洗,经75%酒精杀毒30秒,0.1 %氯化汞灭菌处理,浸泡灭菌12分钟,无菌水冲洗8次,备用;

B、外植体接种:将经过步骤A中准备的外植体,接种在含有6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA ,2,4-D1.0 mg/L的SH培养基中,其中蔗糖30g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.85;每天光照8 h,黑暗16 h;

C、小鳞茎的诱导:将经过步骤B中得到的外植体,培养于6-BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA BA的SH培养基中,其中蔗糖30g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.85,每天光照8 h,黑暗16 h。至出现中国石蒜小鳞茎;

D、小鳞茎培养: 将步骤C中得到的中国石蒜小鳞茎接种于SH+6-BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母提取物0.1g/L的培养基中,其中蔗糖80g/L,琼脂粉7.5g/L,pH5.85,每天光照12 h,黑暗12 h。培养15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量;

E、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提取:将步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次,超声处理时间为30min,得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。用0.45μm滤膜过滤,定容至10mL备用;

F、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测:经HPLC检测,石蒜小鳞茎中含有加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏,平均含量为23.10、12.43和52.86μg/g 干重。

本发明提供了一种用中国石蒜小鳞茎组织培养产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法,以‘中国石蒜’鳞茎为外植体,经灭菌、接种,培养一段时间后,在鳞片伤口处产生小鳞茎,继续对小鳞茎进行增殖培养。取中国石蒜小鳞茎组织烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次,得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。本发明应用组织培养技术克服石蒜属植物资源紧张,加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏化学合成复杂的问题。所用基本培养基以SH培养基为基础,辅以6-苄氨基腺嘌呤、α-萘乙酸、酵母提取物等成分;为进行工厂化生产加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏提供基础,环境友好,原料丰富,可很好缓解市场对加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏供应缺口大的问题。

本发明的完成得益于国家自然科学基金(项目批号31301802)的资助。

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