一种节杆菌及其在生物防治番茄青枯病方面的应用

摘要

本发明公开了一种节杆菌及其在生物防治番茄青枯病方面的应用。其中节杆菌的16SrRNA具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明还公开了节杆菌的筛选方法，以及拮抗番茄青枯病菌剂和拮抗番茄青枯病育苗基质的制备方法。本发明通过对番茄青枯病拮抗菌分离筛选及其防效试验，分离筛选出对番茄青枯病有拮抗作用的菌株，先通过培养繁殖后，制成该菌剂产品，利用食用菌栽培后的菇渣通过发酵腐熟后与其他基材按一定比例配制成育苗基质，将生防菌剂直接与育苗基质有机的结合起来，它具有可利用资源丰富、成本低廉，使用其防治青枯菌能够避免环境二次污染等诸多优点，是解决土传病害番茄青枯病一条有效的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及番茄青枯病生防技术领域，尤其涉及一种节杆菌(Arthrobactersp.)、拮抗番茄青枯病菌剂、拮抗番茄青枯病育苗基质以及在防治番茄青枯病方面的应用。

背景技术

番茄青枯病(Bacterial wilt of tomato)是一种由青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的细菌性土传病害，多在热带、亚热带的国家和地区，如：南美洲、日本、印度、菲律宾，我国广东、浙江、福建、江苏、湖北、四川、重庆等地发生。该病可造成植株大面积萎蔫死亡，一般田块发病率为10％～15％，重病田发病率高达80％～98.5％，导致番茄产量严重下降，造成重大的经济损失。R.solanacearum是一种土壤习居菌，能够在无寄主情况下的土壤中存活很长时间。R.solanacearum主要从根系侵入植株，也可从茎部伤口侵入并直接进入导管系统，在其中大量繁殖并产生代谢物质，阻碍植物体内水分运输，造成植株萎蔫。

目前，针对番茄青枯病缺少有效的化学药剂，加之青枯菌对化学农药易产生抗药性，而且大量使用化学农药会造成环境污染和生产成本上升。生物防治作物病害具有可利用资源丰富、成本低廉、能够避免环境二次污染，被认为是解决土传病害一条有希望的途径。利用病原菌拮抗微生物进行生物防治是生物防治的一个重要组成部分。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种节杆菌(Arthrobacter sp.)。

本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种节杆菌的筛选方法。

本发明要解决的还有一个技术问题是提供一种拮抗番茄青枯病菌剂的制备方法。

本发明还要解决的一个技术问题是提供一种拮抗番茄青枯病育苗基质的制备方法。

对于节杆菌，本发明采用的技术方案是，该节杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No.M2016421，它的16SrRNA具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

对于节杆菌的筛选方法，本发明采用的技术方案是，包括以下步骤：

(1)按以下配方配制酪蛋白胨琼脂培养基，并采用高压湿热115.0℃灭菌25分钟，得到细菌斜面培养基；

所述酪蛋白胨琼脂培养基由葡萄糖5.0g、酪蛋白水解物1.0g、细菌级蛋白胨10.0g、琼脂15.0～20.0g和蒸馏水1000ml组成，且灭菌前酪蛋白胨琼脂培养基的pH值为7.0～7.2；

(2)土壤稀释液的制备

a)称取10g土壤，加入90ml无菌生理盐水，振荡15分钟，得到10^-1的稀释土壤溶液A；

b)吸取稀释土壤溶液A 1ml，加入9ml无菌生理盐水，得到10^-2的稀释土壤溶液B；

c)吸取稀释土壤溶液B 1ml，加入9ml无菌生理盐水，得到10^-3的稀释土壤溶液C；

d)吸取稀释土壤溶液C 1ml，加入9ml无菌生理盐水，得到10^-4的稀释土壤溶液D；

e)吸取稀释土壤溶液D 1ml，加入9ml无菌生理盐水，得到10^-5的稀释土壤>

f)吸取稀释土壤溶液E 1ml，加入9ml无菌生理盐水，得到10^-6的稀释土壤溶液F；

(3)分别吸取稀释土壤溶液C、稀释土壤溶液D、稀释土壤溶液E 0.2ml，加入到酪蛋白胨琼脂培养基平板中进行涂布培养，并在25～28℃培养2～3天；

(4)选择20～200菌落数的培养皿进行挑取菌落进行斜面培养，培养条件为25～28℃下培养2～3天；

(5)分离得到所述的节杆菌。

对于拮抗番茄青枯病菌剂的制备方法，本发明采用的技术方案是，包括以下步骤：

(1)将如权利要求2所筛选得到的节杆菌以酪蛋白胨培养基加入无机盐钙、镁、磷进行液体摇瓶发酵，25～35℃培养，转速120～220rpm；最后得到菌种；

(2)以步骤(1)所得到的菌种接种液体发酵罐制作液体母种，所述液体发酵罐的原料为麸皮、菜饼和豆饼粉分别按重量百分比1％～5％∶0～3％∶0～3％及无机盐钙、镁、磷搅拌混合，加水量为99～89％，高压灭菌后，待发酵罐液体温度冷却至35℃以下时，再按1.0～10％的接种量以无菌操作方式接种于液体发酵罐的培养基中，液体发酵罐始终保持0.01MPa以上的正压，25～35℃通气培养24～48小时，发酵菌数达10⁸cfu/ml以上即可，无菌包装成菌剂。

作为优选，步骤(1)中酪蛋白胨培养基加入的无机盐用量为：钙0.9～1.5g/l，镁0.5～1.3g/l，磷0.8～2.5g/l；

步骤(2)中所述发酵罐中加入的无机盐用量为：钙0.9～1.5g/l，镁0.5～1.3g/l，磷0.8～2.5g/l。

对于拮抗番茄青枯病育苗基质的制备方法，本发明采用的技术方案是，包括以下步骤：

(1)按质量百分比取木屑20％、棉籽壳70％和辅料10％配制成蘑菇培养基并在上面种植蘑菇，再将经过种植蘑菇后的蘑菇培养基粉碎至2～3cm的颗粒即为菇渣；所述辅料由麸皮、石灰、石膏按质量百分比8:1:1配制而成；

(2)菇渣的无害化处理：运用堆肥原理将所述菇渣加入氮源，调整碳氮比，加水调整菇渣含水率为55～65％，按2kg/m³加入堆肥用发酵菌剂，做堆，经过55～65℃的高温过程30～35天，在其间经过3～5次的翻堆混匀，得到菇渣腐熟料；并保持菇渣腐熟料含水量55～60％；

(3)拮抗番茄青枯病育苗基质的配制：将菇渣腐熟料、草炭、蛭石和珍珠岩分别按体积百分比45％、35％、13％、7％的比例均匀混合，按3kg/m³加入权利要求3所制得的拮抗番茄青枯病菌剂并混合均匀，再用自来水调节基质的含水率至30％～40％，使基质中含拮抗菌数达10⁷cfu/g以上即得到拮抗番茄青枯病育苗基质。

作为优选，菇渣为种植香菇或金针菇后的蘑菇培养基。

另外，上述节杆菌在防治番茄青枯病方面的应用。

本发明的有益效果是：

从自然界定向分离选育出本发明节杆菌(Arthrobacter sp.)，通过平皿拮抗实验显示，该菌株具有良好抑制青枯菌生长的能力，同时该菌株能够在耐受重金属镉离子(200ug/ml)，说明该菌株能够在镉离子污染的土壤中存活。

本发明针对番茄青枯病缺少有效的化学药剂，且反复用药易造成青枯菌产生抗药性的问题。通过对番茄青枯病拮抗菌分离筛选及其防效试验，分离筛选出对番茄青枯病有拮抗作用的菌株，先通过培养繁殖后，制成该菌剂产品，利用食用菌栽培后的菇渣通过发酵腐熟后与其他基材按一定比例配制成育苗基质，将生防菌剂直接与育苗基质有机的结合起来，它具有可利用资源丰富、成本低廉，使用

生物材料保藏

节杆菌(Arthrobacter sp.)SJN-5(以下简称为SJN-5菌株)，该菌于2014年4月至10月，用上述方法从安徽省各地土壤样品分离得到。经测序鉴定，最后分析确定，该细菌为节杆菌(Arthrobacter sp.)。该新菌株于2016年8 月10日在湖北省武汉市武汉大学内武汉大学保藏中心中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO.M2016421。

具体实施方式

实施例1：节杆菌(Arthrobacter sp.)SJN-5菌株的获得

本实施例提供了一种利用病原菌拮抗微生物防治番茄青枯病的菌株，具体是节杆菌(Arthrobacter sp.)SJN-5。2014～2015年实验者从安徽贵池、黄山、舒城、歙县、绩溪等不同地区采集连作番茄地的土壤样品，利用细菌培养基采用稀释分离法从中定向分离出各类细菌等共100多株，并进行菌株纯化，进而对菌株通过斜面和摇瓶在28～30℃培养条件下培养和在多种育苗基质接种效果测定，从中筛选出拮抗番茄青枯病菌的节杆菌SJN-5。

1 培养基

酪蛋白胨琼脂培养基：葡萄糖5.0g，酪蛋白水解物1.0g，细菌级蛋白胨10.0g，琼脂15.0～20.0g，蒸馏水1000ml，pH值为7.0～7.2。采用高压湿热115.0℃灭菌25分钟。

2 试验步骤

2.1 培养基的制备

配制如1所述的酪蛋白胨琼脂培养基，制备细菌斜面培养基。

2.2 土壤稀释液的制备

(1)称取10g土壤样品，加入90ml无菌水250ml三角瓶中，振荡15分钟，得到10^-1的稀释土壤溶液A；

(2)吸取稀释土壤溶液A 1ml，加入9ml无菌水50ml三角瓶中，得到10^-2的稀释土壤溶液B；

(3)吸取稀释土壤溶液B 1ml，加入9ml无菌水50ml三角瓶中，得到10^-3的稀释土壤溶液C；

(4)吸取稀释土壤溶液C 1ml，加入9ml无菌水50ml三角瓶中，得到10^-4的稀释土壤溶液D；

(5)吸取稀释土壤溶液D 1ml，加入9ml无菌水50ml三角瓶中，得到10^-5的稀释土壤溶液E；

(6)吸取稀释土壤溶液E 1ml，加入9ml无菌水50ml三角瓶中，得到10^-6的稀释土壤溶液F。

2.3 细菌分离

(7)分别吸取稀释土壤溶液C、稀释土壤溶液D、稀释土壤溶液E各0.2ml，加入到酪蛋白胨琼脂培养基平板中进行涂布培养，并在28-30℃培养2～3天。

将上述细菌分离的步骤重复3次，综合结果，筛选菌株。该做法是为了获得较多的菌株，同时验证每次实验筛选获得菌株的数量是否相同或者差距大小，最终选择筛选效果好且菌株活性较高的作为目标菌株。

(8)选择20～200菌落数的培养皿进行挑取菌落进行斜面培养，培养条件为28～30℃下培养2～3天；

2.4 多个土壤样品

(9)共取10个土壤样品，每个土壤样品重复上述2.1～2.3步骤。

2.5 结果

按上述方法分离得到细菌100多株。

实施例2：分离得到的细菌对番茄青枯病茄青枯拉尔氏菌的平板拮抗试验

1.培养基

1.1 固体培养基

青枯病菌培养基的配制：磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钾0.8g，酵母浸提物5.0g，酪蛋白水解物1.0g，葡萄糖5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0～7.2。采用高压湿热115.0℃灭菌25分钟。

酪蛋白胨琼脂培养基的配制：同实施例1中的酪蛋白胨琼脂培养基。

1.2 液体培养基

采用酪蛋白胨琼脂培养基但不加琼脂即可，且节杆菌和青枯病原菌都可以在该液体培养基上生长。

2、试验步骤

2.1 培养基制备

按上述配方分别配制青枯病菌培养基和液体培养基，制备病原菌茄青枯拉尔氏菌斜面；

按上述配方分别配制酪蛋白胨琼脂培养基和液体培养基，制备细菌斜面。

2.2 平板拮抗试验

2.2.1 菌种活化

番茄青枯病菌和细菌进行菌种活化：番茄青枯病菌和分离细菌分别转接至酪蛋白胨琼脂培养基斜面，28～30℃，培养16～28小时，备用。

2.2.2 制备青枯病菌平板

将活化的青枯病菌接入液体培养基中进行摇瓶培养，25～28℃，180转/分。隔天以青枯病菌培养基倒平板，等培养基凝固后每个平板中加入0.2ml(稀释青枯病原菌浓度为10³～10⁴cells/ml)青枯病菌发酵液(培养约36小时)，均匀涂布，25～28℃培养过夜，备用。

2.2.3 准备细菌液体发酵液

青枯病菌在液体培养基摇瓶培养2天后，活化分离细菌再转接入液体培养基中进行摇瓶培养，25～28℃，180转/分，隔天备用(培养约36小时)。

2.2.4 平板拮抗试验

用灭菌滤纸片(直径为9mm)蘸取分离细菌发酵液放入青枯病菌平板，每个平板放3株不同拮抗细菌，3个重复。20小时左右观察实验结果，主要考察抑菌圈有无和大小。

3、结果

通过平板拮抗试验得到拮抗效果较好的细菌3株，菌株SJN-5就是其中一株。实验为先在平板上涂0.5ml青枯拉尔氏菌发酵液，然后用滤纸片蘸取菌株SJN-5发酵液放在平板上，同时培养而得。

通过观察节杆菌株SJN-5对青枯拉尔氏菌的拮抗效果，可以看出抑菌圈明显，说明菌株SJN-5生长速度快，扩散能力强，对茄青枯拉尔氏菌具明显地拮抗作用。

节杆菌(Arthrobacter sp.)SJN-5(以下简称为SJN-5菌株)，该菌于2014年4月至10月，用上述方法从安徽省各地分离而得。经果测序鉴定，最后分析确定，该细菌为节杆菌(Arthrobacter sp.)。该新菌株于2016年8月10日在湖北省武汉市武汉大学内武汉大学保藏中心中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO.M2016421。

实施例3：菌株SJN-5的拮抗菌剂的制备

本实施例的具有拮抗番茄青枯病的微生物菌剂是由节杆菌(Arthrobacter sp.)SJN-5菌株经培养、繁殖而成。

具体操作过程如下：节杆菌SJN-5以酪蛋白胨培养基为基础加入无机盐钙0.9～1.5g/l、镁0.5～1.3g/l、磷0.8～2.5g/l进行液体摇瓶发酵，25～35℃培养，转速120～220rpm。以此为菌种接种液体发酵罐制作液体母种，液体发酵罐原料为麸皮、菜饼、和豆饼粉按重量百分比1％～5％∶0～3％∶0～3％∶0～3％) 及少量的无机盐(钙0.9～1.5g/l、镁0.5～1.3g/l、磷0.8～2.5g/l)，加水量为99～89％，高压灭菌后，待发酵罐液体温度冷却至35℃以下时，再按1.0～10％的接种量以无菌操作方式接种于液体发酵罐的培养基中，液体发酵罐始终保持0.01MPa以上的正压，25～35℃通气培养24～48小时，发酵菌数达10⁸cfu/ml以上即可，无菌包装成菌剂，包装形式袋装或瓶装。

由节杆菌SJN-5制成的菌剂中的菌数达10⁸cfu/ml时，将菌剂应用于育苗基质中即可以达到有效的防治番茄青枯病的效果，此10⁸cfu/ml是作为发酵菌剂中菌数的最低临界值，此数值以上均可以达到防治番茄青枯病的效果，但是因为在具体试验过程中菌剂中的发酵菌数不可能无限制的增加，所以在具体应用过程中发酵菌数是存在上限的，下限即发酵菌数为10⁸cfu/ml。

实施例4：拮抗番茄青枯病育苗基质的配制

先按以下方法制作菇渣：按质量百分比取木屑20％、棉籽壳70％和辅料10％配制成蘑菇培养基，其中辅料由麸皮、石灰、石膏按质量百分比8:1:1配制而成。再在蘑菇培养基上面种植香菇或金针菇，将经过种植香菇或金针菇后的蘑菇培养基粉碎至2～3cm的颗粒即得到菇渣。

对菇渣进行无害化处理得到菇渣腐熟料：运用堆肥发酵原理将菇渣加入0.8～1.2kg/m³尿素作为氮源，加水调整菇渣含水量为55～65％之间，按2kg/m³加入堆肥专用发酵菌剂，做堆，堆高100～150cm、直径200～300cm，经过55～65℃的>

拮抗番茄青枯病育苗基质的配制：将菇渣腐熟料、草炭、蛭石和珍珠岩按体积45％、35％、13％、7％的比例配制基质并混合均匀，然后用权利要求3所得到的拮抗番茄青枯病菌剂，按3kg/m³混合均匀，并用自来水调节基质的含水率至30％～40％，使基质中含拮抗菌SJN-5数达10⁷cfu/g以上即可包装。基质中含拮抗菌数达10⁷cfu/g以上的数值范围下限为10⁷cfu/g，上限也是因具体试验过程而存在的，解释同上。

配制后的育苗基质的基本理化性质见表1：

表1：

总孔隙度60～82.6通气孔隙度14～18.5持水孔隙55～66容重(g/cm3)0.25电导率(ms/cm)0.19～0.22全氮(％)0.28～0.33速效氮(g/kg)2.1速效磷(g/kg)5.5速效钾(g/kg)13.4有机碳(％)22～36pH值6.3～7.0

按本实施例配置的拮抗番茄青枯病育苗基质进行番茄育苗试验观察显示，配制的育苗基质优于常规配方的育苗基质。

实施例5：含有SJN-5菌剂的拮抗番茄青枯病的菇渣育苗基质在盆栽上对番茄青枯病生防效果的试验

具体实验步骤如下：

1.育苗

拮抗菌育苗基质为：将菇渣腐熟料、草炭、蛭石和珍珠岩按体积45％、35％、13％、7％的比例配制基质并混合均匀，然后用权利要求3所得到的拮抗番茄青枯病菌剂，按3kg/m³混合均匀，并用自来水调节基质的含水率至30％～40％，使基质中含拮抗菌SJN-5数达10⁷cfu/g以上，备用。

常规对照基质为：将菇渣腐熟料、草炭、蛭石和珍珠岩按体积百分比45％、35％、13％、7％的比例配制基质并混合均匀，自来水调节基质的含水率至30％～40％，备用。

2.播种

在育苗穴盘(50孔)每穴中分别装入四分之三高左右的上述制备的两种基质，用手轻压，然后每穴中播入1～2颗番茄种子，再用基质覆盖，并用塑料薄膜盖住穴盘，防止水分蒸发，备用。

3.出苗

将准备好的播种穴盘放入温室大棚，温度25℃，维持日夜温差在10℃以上。 大约4～5天出苗，出苗后掀掉塑料薄膜，穴盘中培养至3～4片真叶(大约3～4周)，备用。

4.青枯病菌雷尔氏菌发酵液准备

青枯雷尔氏菌活化，然后每株接液体摇瓶培养，25～28℃，180转/分钟，培养约36小时，备用。

5.盆栽

采用番茄种植基地青枯病发病严重的地块土壤，每盆(规格320×260mm)称取3.0公斤的土壤，混合均匀2％有机肥，装入盆中。所有盆中移裁番茄苗均带根部基质移栽，每盆中移栽5株番茄苗，根据需要适当补水。本试验设两个对照和一个处理，每个处理5盆，每盆5株苗，均匀分布。对照1：移栽时用对照基质苗不加任何菌剂；对照2：移栽时每株只浇20ml青枯菌稀释发酵液(10⁵cfu/ml)；拮抗菌基质处理：移栽时用拮抗菌基质育苗移栽时每株根部先浇20ml青枯菌稀释发酵液(10⁵cfu/ml)，每天记录发病株数。

6.结果分析

通过盆栽实验结果显示，未接种病原菌的番茄植株未出现发病植株；接种青枯病原菌发病率达到60％以上；采用SJN-5菌株处理的带抗菌基质育苗的处理延缓了番茄青枯病害的发生，将病害的发生率降低至35％，说明该育苗基质培育处理对番茄青枯病具有防效。同时考虑菌株在基质育苗中的存活数量，建议使用带有菌株SJN-5的接抗菌基质育苗进行青枯病防治时，等到番茄幼苗长至20～25cm高 时，且在定殖前补用菌株SJN-5制剂，同时结合种植预防措施，增强效果。

以菇渣为主要原料配制的育苗基质接种拮抗青枯病菌的菌剂SJN-5，培育番茄育苗后进行移栽试验，与未接拮抗菌仅接种青枯病菌的对照相比，青枯病发病率降低至35％以下，且发病时期推迟10天以上。

综上，本实施例具有如下效果：

一是利用拮抗番茄青枯病的节杆菌菌剂应用于育苗基质的生产，采用固体堆肥发酵的形式，提高生产蘑菇废弃物的利用率，降低育苗的生产成本，然后复合配制成具有拮抗土传病害番茄青枯病的育苗基质。

二是通过菇渣等农业废弃物的无害化处理，减少环境的二次污染，具有较好的经济、防治环境污染及防治土传病害番茄青枯病的效果。

本实施例筛选获得具有拮抗青枯病原菌的节杆菌株，并能将蘑菇生产的废弃物变为再利用资源，复配形成具有拮抗土传病的商品育苗基质，该产品适用于规模化农业生产，可提高农业效益。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。