白花泡桐无毒种苗的培育方法

摘要

本发明公开了一种白花泡桐无毒种苗的培育方法，包括以下步骤：1)以白花泡桐带腋芽的茎段为外植体，消毒后经初代培养形成初代幼苗；2)将所得幼苗进行脱毒培养，得到脱毒材料；3)将所得脱毒材料交替接入高浓度植物激素继代培养基和低浓度植物激素继代培养基中光照培养，得到丛生苗；4)将所得丛生苗分株后进行生根培养，得到生根苗。本发明所述方法操作简单，脱毒、增殖及生根效率高，所得的生根苗根系发达且细绒毛短(<1mm)，洗苗省工省时，移栽成活率高。

说明书

技术领域

本发明涉及植物的组织培养技术，具体涉及白花泡桐无毒种苗的培育方法。

背景技术

白花泡桐Paulownia fortunei(Seem.)Hemsl为玄参科、泡桐属高大乔木，主产于中国南方，高可达30米，主干直，胸径可达2米，是一种用途广、经济价值高、速生优质的用材落叶树种。白花泡桐优良无性系的特点是：(1)抗逆性好、适应性强、长江流域以南均可种植；(2)生长速度快、5-6年即可采伐、平均胸径42cm、平均亩产量33m³；(3)材质轻、韧性好、密度低、强度及抗弯强度大，经济价值较高。

为保证优树性状能稳定遗传，其种苗繁殖必须通过无性繁殖方式进行。现有泡桐的无性繁殖方式通常有嫁接、分根和组培等多种方式。其中，嫁接繁殖需要较多的人力、物力和财力，不适于泡桐种苗大规模生产。而泡桐分根育苗主要是选取1-2年生泡桐种根，一般于2月下旬至3月上旬埋根育苗，其方法虽然简单快捷，出苗率高，成本低，但需要比较多的植物材料，速度和产量有限；而且对土壤的要求较高，需要土质良好、无病虫害、干燥无积水、肥力充足等土壤条件；所选择的种根必须无病虫害、损伤较轻，若选择不当，很容易造成出苗率低和引发泡桐丛枝病。相比嫁接和分根繁殖，组培脱毒快繁更加快捷高效，且不受分根育苗的时间、材料和土质的限制，能够在短时间内获得大量无毒优质种苗，减轻移栽后泡桐丛枝病的发生和危害。

虽然白花泡桐的种苗脱毒快繁技术目前已有报道，但不同的白花泡桐优良单株，其最优的组培脱毒技术和方法不同(李芳东，中南林业科技大学学报，2010，30卷8期，22-28页)。本申请人在研究白花泡桐优良无性系种苗组培快繁产业化过程中，发现现有技术中仍存在三个影响产业效率的主要问题：一是组培材料脱毒时间长，效果不够理想，脱毒效率不高；二是在高激素浓度的单一培养基上经过多次继代培养后，材料容易玻璃化，通常第5代玻璃化率约为20％，并随着继代次数的增加玻璃化率有升高的趋势，大幅影响种苗质量、繁殖率、生根率和成活率；三是组培苗在琼脂为支撑物的培养基上生根时，根系表面长出大量的长约5mm的细绒毛，吸附大量的培养基，洗苗费工费时，在洗苗容易对种苗造成损伤，影响洗苗效率和移栽成活率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种白花泡桐无毒种苗的培育方法。该方法操作简单，脱毒、增殖及生根效率高，所得的生根苗植株健壮、根系发达、根系上的细绒毛短(<1mm)，洗苗省工省时，移栽成活率高。

本发明所述的白花泡桐无毒种苗的培育方法，包括以下步骤：

1)以白花泡桐带腋芽的茎段为外植体，消毒后接种于初代培养基中，光照培养，直至外植体上的腋芽发育生长形成初代幼苗；

2)将所得幼苗剪成带有1或2个以上腋芽的茎段，转入脱毒培养基中，在36-39℃结合蓝光照射的条件下进行脱毒培养，得到脱毒材料；

3)将所得脱毒材料剪成带有1或2个以上腋芽的茎段，交替接入高浓度植物激素继代培养基和低浓度植物激素继代培养基中光照培养，得到丛生苗；其中：

所述的高浓度植物激素继代培养基配方为：MS+6-BA 3.5-4.5mg·L^-1+IBA>-1+蔗糖25-35g·L^-1+琼脂3.0-4.0g·L^-1，pH>

所述的低浓度植物激素继代培养基配方为：MS+6-BA 0.2-0.6mg·L^-1+IBA>-1+蔗糖25-35g·L^-1+琼脂3.0-4.0g·L^-1，pH>

4)将所得丛生苗分株，转入生根培养基中，光照培养，得到生根苗；所述的生根培养基配方为：1/2MS+NAA>-1+蔗糖15-25g·L^-1+卡拉胶3.2-3.6g·L^-1，pH>

上述培育方法的步骤1)中，对外植体的消毒处理与现有技术相同，具体的消毒处理可按下述方法进行：取外植体置于质量浓度为1-3％的洗洁精水溶液中浸泡3-5min，取出后用流水冲洗干净，再置于超净工作台上用体积浓度为70-75％的乙醇浸泡50-70s，取出后再置于质量浓度为0.1-0.2％的HgCl₂中浸泡5-8min，取出，无菌水清洗3-5次。

上述培育方法的步骤1)中，所述的初代培养基配方优选为：MS+6-BA1.0-4.0mg·L^-1+IBA>-1+蔗糖25-35g·L^-1+琼脂3.0-4.0g·L^-1，pH5.6-6.0；更优选为：MS+6-BA>-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH>-2·s^-1；进一步优选为：温度为28±2℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。该步骤中，通常是当外植体上的腋芽发育生长至2-3cm时即认为形成初代芽苗。

上述培育方法的步骤2)中，所述的脱毒培养基配方优选为：MS+6-BA3.5-4.5mg·L^-1+IBA>-1+蔗糖25-35g·L^-1+琼脂3.0-4.0g·L^-1，pH5.6-6.0；更优选为：MS+6-BA>-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH>-2·s^-1、光照时间10-15h/d；进一步优选蓝光光照强度为40±5μmol·m^-2·s^-1、光照时间10-12h/d。

本申请人发现，在上述培育方法的步骤3)中，通过采用高浓度植物激素继代培养基和低浓度植物激素继代培养基交替培养的继代培养方法，在可以保证材料增殖效率的同时，还能将玻璃化率降低至5％以下。所述高浓度植物激素继代培养基和低浓度植物激素继代培养基交替培养的继代培养方法，是指将脱毒材料先接入高浓度植物激素继代培养基培养一个继代周期，然后取出材料再接入低浓度植物激素继代培养基培养一个继代周期；……；如此循环往复交替培养，直至得到足够的材料进行生根培养。在此过程中，不论材料是长在高浓度植物激素继代培养基中，或是长于低浓度植物激素继代培养基中，只要不出现玻璃化、植株高度在4cm以上的芽苗，均可用于生根培养；其它达不到生根要求的材料(如比较细弱或矮小的植株)，可作为继代材料进入下一个继代培养周期，为下一轮生根培养进行材料储备。该步骤中，所述的高浓度植物激素继代培养基配方优选为：MS+6-BA4.0mg·L^-1+IBA0.4mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH>-1+IBA0.05mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH>-2·s^-1；进一步优选为：温度为28±2℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

上述培育方法的步骤4)中，所述的生根培养基配方优选为：1/2MS+NAA0.2mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+卡拉胶3.4g·L^-1，pH>-2·s^-1；进一步优选为：温度为28±2℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。该步骤中，在将丛生苗分株时，优选是选择株高4.0cm以上的健壮丛生苗进行分株。

在上诉限定的培养条件下，外植体在初代培养基中培养得到初代幼苗(2-3cm)所需时间通常为25-35d；脱毒培养的时间通常10-15d；带腋芽的茎段在高浓度植物激素继代培养基中的一个继代周期和在低浓度植物激素继代培养基中的一个继代周期相同，通常为25-30d；丛生苗在生根培养基中培养得到生根苗所需时间通常为10-15d，此时每株长根3-10条，根长3-5cm，且所得生根苗的根系为白色，根系上的细绒毛短(<1mm)，便于洗涤，符合炼苗移栽要求。

与现有技术相比，本发明的特点在于：

1、在丛生芽大量扩增之前，采用波长465±10nm的蓝光照射结合36-39℃的高温培养10-15d，对芽苗进行脱毒处理，提高了脱毒效率，使脱毒率达到100％；

2、采用高浓度植物激素继代培养基和低浓度植物激素继代培养基交替培养的继代培养方法，既保证材料的增殖效率，又能将材料的玻璃化率降低至5％以下；

3、在生根培养阶段，以卡拉胶代替琼脂作为培养基固体支撑物，并结合特定的激素浓度，不仅使生根时间短、生根率高、根系发达洁白，而且抑制了生根苗根系上细绒毛的生长(绒毛长度<1mm)，使生根苗更易于洗涤，从而减小了在洗苗时对生根苗的损伤，大大提高了洗苗效率和移栽成活率；

4、本发明所述方法简单易操作，脱毒、增殖和生根效率高，可实现产业化批量生产。

附图说明

图1为本发明实施例1培育得到的初代幼苗的图片；

图2为本发明实施例1培育得到的丛生苗的图片；

图3为本发明实施例1培育得到的生根苗的图片，其中根系洁白、细绒毛短(<1mm)；

图4为对比例3培育得到的生根苗的图片，其中根系浅黄，周围长满了浅白色雾状、长约5mm的细绒毛；

图5为本发明实施例1和对比例3培育得到的生根苗洗涤后的图片，其中左边的生根苗(实施例1培育得到)根系细绒毛短(<1mm)，洗涤后基本无培养基附着；右边的生根苗(对比例3培育得到)根系细绒毛较长(约5mm)，洗涤后仍附着较多培养基，且很难洗净；

图6为本发明实施例1培育得到的移栽苗的图片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

1)以白花泡桐(该白花泡桐是从桂北地区广西植物研究所内的白花泡桐中按现有常规筛选方法进行筛选得到的白花泡桐优良无性系)带腋芽的茎段作为外植体，置于质量浓度为1％的洗洁精溶液中浸泡10min，取出后在流动的自来水下冲洗干净，再置于超净工作台上用体积浓度为70％的乙醇浸泡60s，取出后再置于质量浓度为0.1％的HgCl₂中浸泡7min，取出，用无菌水清洗5次；

2)将消毒后的外植体接种于初代培养基中，光照培养30d，外植体腋芽发育生长，形成2-3cm高的芽苗(如图1所示)，即为初代幼苗；其中，所述的初代培养基配方为：MS+6-BA>-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH>-2·s^-1；用上述方法所得初代幼苗健壮，叶片鲜绿色，生长良好，诱导率70％；

3)将所得的幼苗分剪成带有1或2个腋芽的茎段，接入脱毒培养基中，在37-39℃结合蓝光(波长465±10nm)照射条件下进行脱毒培养15d，对芽苗进行脱毒处理，得到脱毒材料；其中，所述的脱毒培养基配方为：MS+6-BA4.0mg·L^-1+IBA0.4mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH>-2·s^-1，光照时间为10h/d；用上述方法脱毒效率可达100％；

4)将所得脱毒材料分剪成带有1或2个腋芽的茎段，先接入高浓度植物激素继代培养基中，光照培养一个继代周期(25d)，繁殖系数为6.0/25d；然后取出材料分剪成带有1或2个腋芽的茎段，再接入低浓度植物激素继代培养基中，光照培养一个继代周期(25d)，繁殖系数5.0/25d；……；如此循环往复交替培养，直至得到足够的材料用于生根培养；其中，所述的高浓度植物激素继代培养基配方为：MS+6-BA4.0mg·L^-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH>-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH>-2·s^-1；通过上述交替培养所得的丛生苗数量多、平均繁殖系数5.0/25d以上，植株较壮、长势良好，玻璃化率低于5％，培养一个周期(25d)所得的丛生苗高度为3-6cm(如图2所示)；

5)选取高度在4cm以上的健壮丛生苗分株后转入生根培养基中，光照培养12d，得到白花泡桐生根苗；其中，所述的生根培养基配方为：1/2MS+NAA>-1+蔗糖20g·L^-1+卡拉胶3.4g·L^-1，pH>-2·s^-1；用上述方法所得的生根苗植株生长良好，根系发达、洁白、细绒毛短(<1mm)、易于洗涤，每株长根5-10条，根长3-5cm，生根率100％(如图3以及图5中左边的生根苗所示)；

6)将所得生根苗按常规方法进行炼苗，即得到白花泡桐无毒种苗(如图6所示)。

对比例1

重复实施例1，不同的是：

将步骤2)中初代培养基配方改为：MS+6-BA>-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH>

将步骤3)中的脱毒方法改为：采用白光(光照强度为40±5μmol·m^-2·s^-1、光照时间10h/d)结合33-35℃的温度培养25d，脱毒效率15％；

将步骤4)中的高浓度植物激素培养基配方改为：MS+6-BA>-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1(pH>-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1(pH>

将步骤5)中的生根培养基配方改为：1/2MS+NAA>-1+蔗糖20g·L^-1+卡拉胶3.4g·L^-1，pH>

对比例2

重复实施例1，不同的是：

将步骤2)中初代培养基配方改为：MS+6-BA 5.0mg·L^-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH>

将步骤3)中的脱毒方法改为：采用白光(光照强度为40±5μmol·m^-2·s^-1、光照时间10h/d)结合40-42℃的温度培养，由于温度过高，培养几天后材料大部分死亡，达不到育苗效果；

将步骤4)中的高浓度植物激素培养基配方改为：MS+6-BA 6.0mg·L^-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1(pH>-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1(pH>

将步骤5)中的生根培养基配方修改为：1/2MS+NAA 0.8mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+卡拉胶3.4g·L^-1，pH>

对比例3

重复实施例1，不同的是：

在步骤5)中，将生根培养基的固体支撑物由卡拉胶改为琼脂，即生根培养基配方修改为：1/2MS+NAA>-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH5.8；所得生根苗生长良好，每株长根3-7条，根长3-6cm，生根率100％，根颜色浅黄，但根系上长满大量长约5mm的细绒毛(如图4及图5中右边的生根苗所示)，粘附着大量的培养基，不易清洗干净，洗苗费工费时。

对比例4

重复实施例1，不同的是：

将步骤4)中的继代培养方法改为：只用单一低浓度植物激素继代培养基进行循环继代，其中，继代培养基为MS+6-BA>-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1(pH>

对比例5

重复实施例1，不同的是：

将步骤4)中的继代培养方法改为：只用单一中等浓度植物激素培养基进行循环继代，其中，继代培养基为MS+6-BA>-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1(pH>

对比例6

重复实施例1，不同的是：

将步骤4)中的继代培养方法改为：只用单一高浓度植物激素继代培养基进行循环继代，其中，继代培养基为MS+6-BA4.0mg·L^-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1(pH>

实施例2

1)以白花泡桐(该白花泡桐是从桂北地区广西植物研究所内的白花泡桐中按现有常规筛选方法进行筛选得到的白花泡桐优良无性系)带腋芽的茎段作为外植体，置于质量浓度为1％的洗洁精溶液中浸泡10min，取出后在流动的自来水下冲洗干净，再置于超净工作台上用体积浓度为70％的乙醇浸泡50s，取出后再置于质量浓度为0.1％的HgCl₂中浸泡6min，取出，用无菌水清洗4次；

2)将消毒后的外植体接种于初代培养基中，光照培养25d，外植体腋芽发育生长，形成2-3cm高的芽苗，即为初代幼苗，所得幼苗健壮，叶片鲜绿色，生长良好，诱导率65％；其中，所述的初代培养基配方为：MS+6-BA 1.0mg·L^-1+IBA>-1+蔗糖25g·L^-1+琼脂3.0g·L^-1，pH>-2·s^-1；

3)将所得的幼苗分剪成带有1或2个腋芽的茎段，接入脱毒培养基中，在37-39℃结合蓝光(波长465±10nm)照射条件下进行脱毒培养10d，对芽苗进行脱毒处理，脱毒效率100％，得到脱毒材料；其中，所述的脱毒培养基配方为：MS+6-BA>-1+IBA>-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH>-2·s^-1，光照时间为12h/d；

4)将所得脱毒材料分剪成带有1或2个腋芽的茎段，先接入高浓度植物激素继代培养基培养中，光照培养一个继代周期(25d)，繁殖系数为5.0/25d；然后取出材料分剪成带有1或2个腋芽的茎段，再接入低浓度植物激素继代培养基中光照培养一个继代周期(25d)，繁殖系数4.0/25d；……；如此循环往复交替培养，直至得到足够的材料用于生根培养；其中，所述的高浓度植物激素继代培养基配方为：MS+6-BA 3.5mg·L^-1+IBA>-1+蔗糖25g·L^-1+琼脂3.0g·L^-1，pH>-1+IBA>-1+蔗糖25g·L^-1+琼脂3.0g·L^-1，pH>-2·s^-1；通过上述交替培养所得的丛生苗数量较多、平均繁殖系数4.5/25d，植株长势良好，叶鲜绿、大小中等，玻璃化率低于5％，培养一个周期(25d)所得的丛生苗高度为2-6cm；

5)选取高度在4cm以上的健壮丛生苗分株转入生根培养基中，光照培养12d，得到白花泡桐生根苗；其中，所述的生根培养基配方为：1/2MS+NAA0.15mg·L^-1+蔗糖15g·L^-1+卡拉胶3.3g·L^-1，pH>-2·s^-1；用上述方法所得的生根苗植株生长良好，根系发达、洁白、细绒毛短(<1mm)、易于洗涤，每株长根4-7条，根长3-5cm，生根率95％；

6)将所得生根苗按常规方法进行炼苗，即得到白花泡桐无毒种苗。

实施例3

1)以白花泡桐(该白花泡桐为白花泡桐优良无性系C001)带腋芽的茎段作为外植体，置于质量浓度为1％的洗洁精溶液中浸泡10min，取出后在流动的自来水下冲洗干净，再置于超净工作台上用体积浓度为75％的乙醇浸泡70s，取出后再置于质量浓度为0.2％的HgCl₂中浸泡8min，取出，用无菌水清洗5次；

2)将消毒后的外植体接种于初代培养基中，光照培养25d，外植体腋芽发育生长，形成2-3cm高的芽苗，即为初代幼苗，所得幼苗健壮，叶片鲜绿色，生长良好，诱导率60％；其中，所述的初代培养基配方为：MS+6-BA>-1+IBA>-1+蔗糖35g·L^-1+琼脂4.0g·L^-1，pH>-2·s^-1；

3)将所得的幼苗分剪成带有1或2个腋芽的茎段，接入脱毒培养基中，在36-38℃结合蓝光(波长465±10nm)照射条件下进行脱毒培养13d，对芽苗进行脱毒处理，脱毒效率100％，得到脱毒材料；其中，所述的脱毒培养基配方为：MS+6-BA>-1+IBA>-1+蔗糖35g·L^-1+琼脂4.0g·L^-1，pH>-2·s^-1，光照时间为10h/d；

4)将所得脱毒材料分剪成带有1或2个腋芽的茎段，先接入高浓度植物激素继代培养基培养中，光照培养一个继代周期(25d)，繁殖系数为5.6/25d；然后取出材料分剪成带有1或2个腋芽的茎段，再接入低浓度植物激素继代培养基中光照培养一个继代周期(25d)，繁殖系数4.0/25d；……；如此循环往复交替培养，直至得到足够的材料用于生根培养；其中，所述的高浓度植物激素继代培养基配方为：MS+6-BA 4.5mg·L^-1+IBA>-1+蔗糖35g·L^-1+琼脂4.0g·L^-1，pH>-1+IBA0.06mg·L^-1+蔗糖35g·L^-1+琼脂4.0g·L^-1，pH>-2·s^-1；通过上述交替培养所得的丛生苗数量较多、平均繁殖系数4.8/25d，植株长势良好，叶鲜绿、大小中等，玻璃化率低于5％，培养一个周期(25d)所得的丛生苗高度为2-6cm；

5)选取高度在4cm以上的健壮丛生苗分株转入生根培养基中，光照培养12d，得到白花泡桐生根苗；其中，所述的生根培养基配方为：1/2MS+NAA0.35mg·L^-1+蔗糖25g·L^-1+卡拉胶3.5g·L^-1，pH>-2·s^-1；用上述方法所得的生根苗植株生长良好，根系发达、洁白、细绒毛短(<1mm)、易于洗涤，每株长根4-8条，根长3-7cm，生根率98％；

6)将所得生根苗按常规方法进行炼苗，即得到白花泡桐无毒种苗。