在双链核酸分子的两端使用纳米孔和锚分子来表征所述双链核酸的方法

摘要

本发明涉及一种用于表征例如测序目标双链多核苷酸的方法。使用具有不同的到膜的耦合强度的至少两个适配体将所述多核苷酸耦合到膜上。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于表征如测序目标双链多核苷酸的方法。使用具有耦合到所述膜的不同强度的至少两个适配体(adaptor)，将所述多核苷酸耦合到膜上。

背景技术

目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且廉价的多核昔酸(如DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有的技术是缓慢的且昂贵的，这主要由于它们依赖于扩增技术来产生大量的多核苷酸，且需要大量特定的用于信号检测的荧光化学物质。

跨膜孔(纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接的、电生物传感器，具有很大的潜力。特别是，目前作为一种有潜力的DNA测序技术的纳米孔得到了许多关注。

当跨纳米孔施加电势时，在，当分析物如核苷酸在桶(barrel)中短暂停留一段时间时，会产生电流的变化。所述核苷酸的纳米孔检测能产生已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中，单个多核苷酸链穿过所述孔并实现对核苷酸的鉴定。链测序可包括使用多核苷酸结合蛋白来控制所述多核苷酸穿过所述孔的移动。

以前已经证明，通过将所述分析物耦合到其中存在相关检测器的膜，能够实现超低浓度分析物递送。这使检测需要的分析物的量降低了为了若干数量级(WO 2012/164270)。

还已经表明，如果双链多核苷酸被修饰为包括含有前导序列和发夹适配体的Y适配体(双链茎和两个非互补臂)，还可以使用链测序有效地表征双链多核昔酸(WO 2013/014451)。优选的为，含有前导序列的Y适配体被连接到所述多核苷酸的一端，且发夹适配体被连接到另一端。所述前导序列优选旋入纳米孔，且连接所述多核苷酸的两条链的发夹环使得待作为所述多核苷酸研究的两条链解开且移动穿过所述孔。这是有利的，因为它将从单个双链多核苷酸获得的信息量加倍。此外，因为两条链中的序列是互补的，因此从这两条链中获得的信息可以信息化组合。这种机制提供了正交校阅功能，从而提供更高可信度的观察值。当Y适配体和发夹环以这种方式一起使用时，Y适配体通常包含将所述多核苷酸耦台到包含纳米孔的膜的锚。在一些情况下，在两端具有Y适配体的双链多核苷酸在样品制备中产生。所述前导序列和和Y适配体中的锚的存在意味着系统通常偏向于表征这些多核苷酸。然而，连接这种多核苷酸中的两条链的发夹环的缺乏意味着只有一条链被研究。

发明内容

本发明人已令人惊讶地证明，通过在系统中包括两个锚，可以避免偏向在两端包含Y适配体的双链多核苷酸。本发明人已经使用包括用于将多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚的Y适配体和包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚的发夹适配体。发夹适配体以比Y适配体更大的强度将所述多核苷酸耦合到所述膜。

因此，本发明提供了一种使用膜中的跨膜孔表征目标双链多核苷酸的方法，包括：

a)提供在一端具有Y适配体并在另一端具有发夹适配体所述目标双链多核苷酸，其中所述Y适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚，其中所述发夹适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚，并且其中将所述发夹适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大；

b)将在步骤a)中提供的所述多核苷酸与所述跨膜孔接触，使得所述多核苷酸的至少一条链穿过所述孔；和

c)随着所述多核苷酸的至少一条链相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值表示所述多核苷酸的至少一条链的一个或多个特性且由此表征所述目标双链多核苷酸。

本发明还提供：

-一种修饰目标双链多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征的方法，包括将Y适配体接合到所述多核苷酸的一端，且将发夹适配体连接到所述多核苷酸的另一端，其中所述Y适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚，其中所述发夹适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚，且其中将所述发夹适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大，且由此提供修饰的目标双链多核苷酸；

-一种修饰目标双链多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征的方法，包括(a)将Y适配体接合到多核苷酸的一端，且将发夹适配体接合到所述多核苷酸的另一端；和(b)将用于耦合所述多核昔酸到所述膜的一个或多个第一锚连接到所述Y适配体，将用于耦合所述多核苷酸到所述膜的一个或多个第二锚连接到所述发夹适配体，且由此提供修饰的目标双链多核苷酸；其中将所述发夹适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大；

-一种使用本发明的方法修饰的目标双链多核苷酸；

-一种修饰目标双链多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征的方法，包括使所送目标多核苷酸与MuA转座酶以及一组双链MuA底物接触，其中所述组中底物的一部分是含有用于将所述多核昔酸与所述膜耦合的一个或多个第一锚的Y适配体，其中所述组中底物的一部分是包括将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚的发夹适配体，并且其中所述发夹适配体耦合到所述膜的强度比所述Y适配体耦合到所述膜的强度大，且由此产生多个修饰的双链多核苷酸；

-一种修饰目标双链多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征的方法，包括：(a)将所述目标多核苷酸与MuA转座酶和一组双链MuA底物接触，其中所述组中底物的一部分是Y适配体，且其中所述组中底物的一部分是发夹适配体，使得所述转座酶将所述目标多核苷酸片段化，且将所述底物接合到所述双链片段的一端或两端，且由此产生多个片段/底物构建体；和(b)向多个片段/底物构建体中的所述Y适配体连接一个或多个第一锚，且向所述多个片段/低物构建体中的发夹适配体连接一个或多个第二锚，且由此产生多个修饰的双链多核苷酸；其中每个发夹适配体耦合到所述膜的强度比每个Y适配体耦合到所述膜的强度大；

-一种使用本发明方法修饰的多个多核苷酸；

-一种使用膜中的跨膜孔表征目标双链多核苷酸的方法，包括：

a)提供在一端具有Y适配体且在另一端具有发夹适配体的所述目标双链多核苷酸，其中所述Y适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚，其中所述发夹适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚，且其中所述发夹适配体耦合到所述膜的强度比所述Y适配体耦合到所述膜的强度大；

b)使在步骤a)中提供的所述多核苷酸与所述跨膜孔、聚合酶和标记的核苷酸接触，使得当通过聚合酶将核苷酸添加到所述多核苷酸时，磷酸盐标记的物质(species)依次释放，其中所述磷酸盐物质含有对每个核苷酸具有特异性的标记；和

c)使用所述孔检测所述磷酸盐标记的物种，且由此表征所述目标双链多核苷酸；

-一种用于修饰目标双链多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征的适配体对，其中一个适配体组是包含用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚的Y适配体，其中另一个适配体是包含用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚的发夹适配体，并且其中将所述发夹适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大；

-一组用于修饰目标多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征的适配体，其中所述适配体的一部分是用于将所述多核苷酸耦合到所述膜包含一个或多个第一锚的Y适配体，其中所述适配体的一部分是包含用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚的发夹适配体，且其中将所述发夹适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大；以及

-一种用于修饰目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)本发明的一对适配体或一组适配体，和(b)MuA转座酶。

附图说明

图1的(A)部分和(B)部分示出了在实施例2中使用的DNA构建体的卡通示意图——四个iSpC3间隔区示为十字，且4个5-硝基吲哚为黑色0，胆固醇耦合剂为灰色椭圆，且棕榈酸酯耦合剂为灰色正方形；标签a1-10在实施例1中全面描述。

图2的(A)部分和(B)部分示出了在实施例3中使用的DNA构建体的卡通示意图——四个iSpC3间隔区示为十字，且4个5-硝基吲哚为黑色0，胆固醇耦合剂为灰色椭圆，且棕榈酸酯锚为灰色方形；标签a1-9在实施例1中全面描述。

图3示出了针对构建体1检测的解旋酶控制的DNA移动的比例，其中链a1移位穿过纳米孔和构建体2，其中链a2移位穿过纳米孔。x轴示出了沿λDNA序列，解旋酶控制的DNA移动所映射的位置(它们全部集中在与45，042bp和48，487bp之间λ区域的模板和互补模板对应的链a1和a2相同的区域)。Y轴示出了链a1(构建体1)解旋酶控制的DNA移动(标记为a1)与链a2(构建体2)解旋酶控制的DNA移动(标记为a2)的比例。当使用单个胆固醇将构建体耦合到所述膜上时，观察到该比例为大约50∶50。本对照显示，如果使用相同的耦合剂将不同的构建体耦合到所述膜上，则解旋酶控制的DNA移动的数目对每个构建体而言大概相等，例如没有观察到偏向。

图4示出了针对其中链a2移位穿过纳米孔的构建体2和其中链a1移动穿过纳米孔构的建体3检测的解旋酶控制的DNA移动的比例。x轴示出了沿λDNA序列，解旋酶控制的DNA移动映射的位置(它们全部集中在与45，042bp和48，487bp之间λ区域的模板和互补模板对应的链a1和a2相同的区域)。Y轴示出了链a2(构建体2)解旋酶控制的DNA移动(标记为a2)与链a1(构建体3)解旋酶控制的DNA移动(标记为a1)的比例。当使用单个胆固醇将构建体2耦合到所述膜上时，与使用胆固醇和棕榈酸酯将构建体3耦合到所述膜上时比较，观察到该比例为大约5∶95。该实验表明，与单个耦合剂相比(胆固醇)，当使用两种耦合剂将构建体耦合到所述膜(其中一个耦合剂比另一个耦合剂强，如胆固醇比棕榈酸酯强)时，解旋酶控制的DNA移动的数目比单耦合的构建体更强地偏向双重耦合的构建体。

图5示出了针对其中链a1移位穿过纳米孔的构建体4和其中链a1或a2移动穿过纳米孔的构建体5检测的解旋酶控制的DNA移动的比例。x轴示出了沿λDNA序列，解旋酶控制的DNA移动映射的位置(它们全部集中在与45，042bp和48，487bp之间λ区域的模板和互补模板对应的链a1和a2相同的区域)。Y轴示出了链a1(构建体4或5)解旋酶控制的DNA移动(标记为a1)与链a2(仅构建体5)解旋酶控制的DNA移动(标记为a2)的比例。当使用两个胆固醇将这两个构建体耦合到所述膜上时，观察到该比例为约33∶66(a2：a1解旋酶控制的DNA移动)。由于如果构建体4被纳米孔捕获，仅能检测到a2移动，因此可以预测到2∶1偏向a1解旋酶控制的DNA移动，而a1移动将从构建体4和5检测到，因此可以预计到2倍的a1移动。

图6示出了针对其中链a1移位穿过纳米孔的构建体3和其中链a1或a2移动穿过纳米孔的构建体6检测的解旋酶控制的DNA移动的比例。x轴示出了沿λDNA序列，解旋酶控制的DNA移动映射的位置(它们全部与模板对应的链a1和a2集中在相同的区域，且λ的区域模板互补在45，042bp和48，487bp之间)。Y轴示出了链a1(构建体3或6)解旋酶控制的DNA移动(标记为a1)与链a2(仅构建体6)解旋酶控制的DNA移动(标记为a2)的比例。当使用胆固醇和棕榈酸酯的组合将构建体3耦合到所述膜上和使用两种棕榈酸酯将构建体6耦合到所述膜上时，观察到该比例为约5∶95(a2：a1解旋酶控制的DNA移动)。与图5中示出的对照实验相比，偏向解旋酶控制的DNA移动表明，使用不同强度的两种不同耦合剂的组合时，可以选择这种构建体，而不是含有两种类似强度的耦合剂的构建体。

图7的(A)部分和(B)部分示出了中在实施例4中使用的DNA构建体的卡通示意图——四个iSpC3间隔区示为十字，且4个5-硝基吲哚为黑色0，胆固醇耦合剂为灰色椭圆，且在本实施例中研究的另外的耦合剂为黑色三角形；标签a1-10(a-c)在实施例1和4中全面描述。

图8示出了针对其中链a1移位穿过纳米孔的构建体1(使用单个胆固醇耦合到所述膜)和其中链a2移动穿过纳米孔的构建体2(也使用单个胆固醇耦合到所述膜)检测的解旋酶控制的DNA移动的比例。x轴示出了沿λDNA，序列解旋酶控制的DNA移动映射的位置(它们全部集中在与45，042bp和48，487bp之间λ区域的模板和互补模板对应的链a1和a2相同的区域)。Y轴示出了链a1(构建体1)解旋酶控制的DNA移动(标记为a1)和链a2(构建体2)解旋酶控制的DNA移动(标记为a2)的比例。当使用单个胆固醇将每个构建体耦合到所述膜上时，观察到该比例为大约50∶50。该对照表明，如果使用相同的耦合剂将不同的构建体耦合到所述膜上，解旋酶控制的DNA移动的数目对每个构建体大约相等，例如没有观察到偏向。

图9示出了针对其中链a1移位穿过纳米孔的构建体1(使用单个胆固醇耦合到所述膜)与针对其中链a2移动穿过纳米孔的构建体7a(使用连接有两个胆固醇TEG′s的DNA片段耦合到所述膜，每个以黑色三角形显示)检测的解旋酶控制的DNA移动的比例。x轴示出了沿λDNA序列解旋酶控制的DNA移动映射的位置(它们全部集中在与45，042bp和48，487bp之间λ区域的模板和互补模板对应的链a1和a2相同的区域)。Y轴示出了链a1(构建体1)解旋酶控制的DNA移动(标记为a1)与链a2(构建体7a)解旋酶控制的DNA移动(标记为a2)的比例。当使用单个胆固醇将构建体1耦合到所述膜上时，与使用两个胆固醇将构建体7a耦合到所述膜上时相比，观察到该比例为大约50∶50。该实验表明，当使用连接到相同的DNA片段的两个胆固醇将构建体7a耦合到所述膜时，与使用单个胆固醇时相比，检测到的解旋酶控制的DNA移动的数目显示，没有偏向任何一个构建体。因此，在相同的DNA片段中两个胆固醇时观察到的耦合强度与单个胆固醇时相似。

图10示出了针对其中链a1移位穿过纳米孔的构建体1(使用单个胆固醇耦合到所述膜)和针对其中链a2移动穿过纳米孔的构建体7b(使用生育酚耦合到所述膜，示为黑色三角形)检测到的解旋酶控制的DNA移动的比例。x轴示出了沿λDNA序列，解旋酶控制的DNA移动映射的位置(它们全部集中在与45，042bp和48，487bp之间λ区域的模板和互补模板对应的链a1和a2相同的区域)。Y轴示出了链a1(构建体1)解旋酶控制的DNA移动(标记为a1)与链a2(构建体7b)解旋酶控制的DNA移动(标记为a2)的比例。当使用单个胆固醇将构建体1耦合到所述膜上时，与使用单个生育酚将构建体7b耦合到所述膜上时相比，观察到该比例为大约35∶65。该实验表明，当使用生育酚将构建体7b耦合到所述膜上时，与使用单个胆固醇时相比，检测到的解旋酶控制的DNA移动的数目显示偏向于使用生育酚耦合的构建体。因此，生育酚时所观察到的耦合强度比胆固醇时观察到的耦合强度略强。

图11示出了针对其中链a1移位穿过纳米孔的构建体1(使用单个胆固醇耦合到所述膜)和针对中链a2移动穿过纳米孔的构建体7c(使用棕榈酸酯耦合到所述膜，示为黑色三角形)检测的解旋酶控制的DNA移动的比例。x轴示出了沿λDNA序列，解旋酶控制的DNA移动映射的位置(它们全部集中在与45，042bp和48，487bp之间λ区域的模板和互补模板对应的链a1和a2相同的区域)。Y轴示出了链a1(构建体1)解旋酶控制的DNA移动(标记为a1)与链a2(构建体7c)解旋酶控制的DNA移动(标记为a2)的比例。当使用单个胆固醇将构建体1耦合到所述膜上时，与使用单个棕榈酸酯将构建体7c耦合到所述膜上时相比，观察到该比例为大约70∶30。该实验表明，当使用棕榈酸酯将构建体7c耦合到所述膜上时，与使用单个胆固醇时相比，检测到的解旋酶控制的DNA移动的数目显示偏向于使用胆固醇时耦合的构建体。因此，棕榈酸酯时所观察到的耦合强度弱于胆固醇时观察到的耦合强度。

图12的(A)部分和(B)部分示出了在实施例6中使用的DNA构建体的卡通示意图一一25个iSpC3间隔区表示为三个黑色十字，4个iSp18’表示为灰色矩形，胆固醇耦合剂表示为灰色圆，且棕榈酸酯耦合剂表示为灰色方块；标签a11-15在实施例5中全面描述。

图13示出片段化和连接适配体后产生的可能的构建体(如实施例5中描述的)。构建体10具有两个发夹适配体且不能被纳米孔捕获。构建体8是所需的构建体，其具有1个Y适配体和1个发夹，链X和链Y在被捕获后移位穿过纳米孔。构建体11具有两个Y适配体，因此，仅可以捕获和移位链X或链Y。

图14示出片段化和连接适配体后产生的可能的构建体(如实施例5中描述的)。构建体10具有两个发夹适配体且不能被纳米孔捕获。构建体9是所需的构建体，其具有1个Y适配体和1个发夹环，链X和链Y被捕获后移位穿过纳米孔。构建体12具有两个Y适配体，因此，仅可以捕获和移位链X或链Y。

图15的(A)部分和(B)部分示出了在实施例7中使用的两个DNA构建体(构建体13和14)的卡通示意图——30个iSpC3间隔区表示为4个黑色十字，4个iSp18’表示为灰色矩形，胆固醇耦合剂表示为灰色圆，且棕榈酸酯耦合剂表示为灰色方块；标签a12，a16-21在实施例7中全面描述。DNA构建体的两个区域标记为R1和R2。

图16的(A)部分和(B)部分示出了在实施例7中使用的两个DNA构建体(构建体15和16)的卡通示意图——30个iSpC3间隔区表示为4个黑色十字，4个iSp18’表示为灰色矩形，胆固醇耦合剂表示为灰色圆形，标记a12，a16-a18，a20，a22-23在实施例7中全面描述。DNA构建体的两个区域标记为R1和R2。

图17示出了检测到的解旋酶控制的DNA移动的％的图，其对应于区域R1和R2穿过纳米孔的受控移位，以观察到的所有的解旋酶控制的DNA移动的比例表示。y轴标记＝百分比(％)，x轴标记＝DNA构建体数目(13-16)。图上的每个点对应单独的实验(n＝3)。

图18示出了对于每个DNA构建体，每个纳米孔中检测到的解旋酶控制的DNA移动的数目的图。Y轴标记＝每个纳米孔中解旋酶控制的DNA移动，x轴标记＝DNA构建体数目(13-16)。图上的每个点对应单独的实验(n＝3)。

序列表说明

SEQ ID NO：1示出了编码MS-B1突变体MspA单体的密码子优化的多核苷酸序列。该突突变缺少信号序列，并包括下列突变：D90N、D91N、D93N、D118R、D134R和E139K。

SEQ ID NO：2示出了MspA单体的MS-B1突变体的成熟形式的氨基酸序列。该突变体缺少信号序列，并包括下列突变：D90N、D91N、D93N、D118R、D134R和E139K。

SEQ ID NO：3示出了编码α-溶血素-E111N/K147N(α-HL-NN；Stoddart等人，PNAS，2009；106(19)：7702-7707)的1个单体的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：4显示了α-HL-NN的1个单体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：7显示了MspB、C和D的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8显示了编码Phi29 DNA聚合酶的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：9显示了Phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10显示了衍生自大肠杆菌的sbcB基因的密码子优化的多核昔酸序列。它编码来自大肠杆菌的核酸外切酶I(EcoExo I)。

SEQ ID NO：11显示了来自大肠杆菌的核酸外切酶I酶(EcoExo I)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12显示了衍生自大肠杆菌的xthA基因的密码子优化的多核苷酸序列。其编码来自大肠杆菌的核酸外切酶III。

SEQ ID NO：13显示了来自大肠杆菌的核酸外切酶III的氨基酸序列。这种酶沿3′-5′的方向对双链DNA(dsDNA)的一条链的5′单磷酸核苷进行分配消化。链上酶的启动需要约4个核苷酸的5′突出端(overhang)。

SEQ ID NO：14显示了由嗜热栖热菌(T.thermophilus)的recJ基因衍生的密码子优化的多核昔酸序列。其编码来自嗜热栖热菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)。

SEQ ID NO：15显示了来自嗜热栖热菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)的氨基酸序列。该酶在5′-3′的方向对ssDNA的5′单磷酸核苷进行进行性(processive)消化。链上酶的启动需要至少4个核苷酸。

SEQ ID NO：16显示了由细菌噬菌体λ(redX)核酸外切酶基因衍生的密码子优化的多核苷酸序列。其编码细菌噬菌体λ核酸外切酶。

SEQ ID NO：17显示了细菌噬菌体λ核酸外切酶的氨基酸序列。该序列是装配成三聚体的三个相同的亚基之一。该酶在5′-3′方向上对dsDNA的一条链的核苷酸进行高度的进行性消化(http：//www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp)。链上酶的启动优选需要约4个具有5′磷酸的核苷酸的5′突出端。

SEQ ID NO：18显示了He1308 Mbu的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19显示了He1308 Csy的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20显示了He1308 Tga的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21显示了Hel308 Mhu的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22显示了Tral Eco的氨基酸序列。

SEQ ID NO：23显示了XPD Mbu的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24显示了Dda 1993的氨基酸序列。

SEQ ID NO：25显示了Trwc Cba的氨基酸序列。

SEQ ID NO：26示出了本发明的MuA底物的双链部分的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：27示出了本发明的MuA底物的双链部分的多核苷酸序列。该序列与SEQID NO：26互补，不同之处在于它在3′端含有U。

SEQ ID NO：28示出了本发明的双链MuA底物的突出端链的多核昔酸序列。

SEQ ID NOs：29-32示出了在实施例1中使用的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：33-41示出了在实施例1、2和3中使用的多核昔酸序列。

SEQ ID NO：42示出了在实施例4中使用的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：43示出了肠杆菌噬菌体λ的多核苷酸序列。该序列包含连接在模板链的5′端的额外的12碱基突出端。这里示出的序列仅为模板链(未示出模板互补链)。该序列在实施例5中使用。

SEQ ID NO：44-48示出了在实施例5和6中使用的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：49示出了在实施例7中使用的多核昔酸序列。在5′端，该序列含有磷酸基团。

SEQ ID NO：50示出了在实施例7中使用的多核苷酸序列。在第3′端，该序列中的最后的胸腺嘧啶具有硫代磷酸基团。

SEQ ID NO：51示出了在实施例7中使用的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：52示出了在实施例7中使用的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：53示出了在实施例7中使用的多核昔酸序列。在5′端，所述序列含有磷酸基。

SEQ ID NO：54示出在实施例7中使用的多核苷酸序列。

具体实施方式

应该理解的是，所公开的产品和方法的不同应用可以适用于本领域中的特定需要。也应理解的是，这里使用的术语仅用于描述本发明的具体实施方案，并且不意在限制。

此外，除非内容另外明确指出，否则用于本说明书和所附权利要求书中的单数形式“一”，“一个”，和“所述”包括复数指代。因此，例如，涉及“多核苷酸”时包括两个或更多个多核苷酸，涉及“锚”时包括两个或更多个锚，涉及“解旋酶”时包括两个或更多个解旋酶，涉及“跨膜孔”时包括两个或更多个孔，等。

本文中，无论在上文还是下文中，引用的所有出版物、专利和专利申请，以全文参考的方式引入本文。

本发明的表征方法

当Y适配体和发夹环适配体一起使用以表征双链多核苷酸时，所述Y适配体通常包括用于将多核苷酸耦合到所述膜的锚，以及优先旋入所述孔的前导序列。所述锚和更重要地所述前导序列通常会导致偏向于表征在两端具有Y适配体的双链多核苷酸。

当使用大致等量的Y适配体和发夹环适配体修饰一组双链多核苷酸时，产生三组不同的修饰的多核苷酸。近似地，50％的修饰的多核苷酸在一端具有Y适配体，和在另一端具有发夹环适配体(即是“拐角(round the corner)”或RTC多核苷酸)。优选的是，这些RTC多核苷酸使用在WO 2013/014451中公开的方法表征。近似地，25％的修饰的多核苷酸在每端具有Y适配体(即双Y多核苷酸)和约25％的修饰的多核苷酸在每端具有发夹环适配体(即双链发夹多核昔酸)。如果Y适配体包括所述锚，则偏向于表征双Y多核昔酸，因为它们具有两个锚并因此能更强地耦合到所述膜。如果Y适配体包括前导，则偏向于表征双Y多核苷酸，因为它们具有两个前导且因此优选旋入所述孔中。与锚的存在相比，前导的存在通常导致更大的偏向。如果Y适配体既包括锚也包括前导，则偏向于表征双Y多核苷酸的程度最大。本发明人已经发现，具有约50倍的偏向于双Y多核苷酸。双链发夹多核苷酸通常不能被特征，因为它们不具有能够旋入用于表征的纳米孔中的单链区域。

本发明人已表明，在发夹环适配体上使用一个或多个锚，不仅降低了对双Y多核苷酸的表征，同时也显著降低了观察到的双Y多核苷酸的吞吐量(throughput)。本发明人由此得出结论：该吞吐量取决于在旋入所述纳米孔中的修饰的多核昔酸的一端的锚的存在(即RTC多核苷酸的Y适配体末端)。

本发明人还令人惊奇地表明，偏向于双Y多核苷酸可以通过使用对膜具有不同耦合强度的Y适配体和发夹环适配体来克服。如果发夹环适配体比Y适配体具有更大的耦合强度，则可实现偏向于RTC多核苷酸。“强”的发夹环适配体有效地将RTC多核苷酸耦合到所述膜，这使得它们能够竞争含有两个“较弱”系链的双Y适配体。由于“较弱”的Y适配体，维持了RTC多核苷酸的高吞吐量。

本发明涉及使用在膜中的跨膜孔表征目标双链多核苷酸。所述目标双链多核苷酸配置为在一端具有Y适配体，而在另一端具有发夹环适配体。这样的方法在下面详细论述。Y适配体包括将多核苷酸耦合到膜的一个或多个第一锚，且发夹环适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚。将所述发夹环适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大。

配置有两个适配体的多核苷酸与跨膜孔接触，使得所述多核苷酸的至少一条链移动穿过所述孔。随着所述多核苷酸的至少一条链相对于所述孔的移动，获取一个或多个测量值。所述测量值表示所述多核苷酸的至少一条链的一个或多个特征。

本发明优选涉及测序或估计目标双链多核苷酸的序列。如下文所详细描述的，只有目标双链多核苷酸的一部分可以被表征或测序。

目标双链多核苷酸

本发明的方法表征目标双链多核苷酸。所述目标双链多核苷酸也可被称为模板双链多核苷酸或感兴趣的双链多核苷酸。

多核苷酸如核酸是含有两个或更多个核苷酸的大分子。所述多核苷酸或核酸可包括任何核苷酸的任意组合。核苷酸可以是天然存在的或人工合成的。目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或甲基化。目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸的可被损坏。例如，多核苷酸可包含嘧啶二聚体。此类二聚体通常与紫外线导致的损坏相关，且是皮肤黑素瘤的首要原因。目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可被修饰，例如用标记物或标签。合适的标记物如下所述。所述目标多核苷酸可包含一个或多个间隔区。

核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个磷酸基团。所述核碱基和糖形成核苷。

核昔碱基通常为杂环的。核碱基包括但不限于：嘌呤和嘧啶，更具体地，腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)。

糖通常为戊糖。核苷酸糖包括但不限于，核糖和脱氧核糖。所述糖优选为脱氧核糖。

所述目标双链多核苷酸优选包含下列核苷：脱氧腺苷(dA)、脱氧尿昔(dU)和/或胸苷(dT)、脱氧鸟苷(dG)和脱氧胞苷(dC)。

核苷酸通常为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸优选是脱氧核糖核苷酸。所述核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸可以被连接在核昔酸的5′或3′侧。

核苷酸包括但不限于，单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟昔(GMP)、单磷酸胸苷(TMP)、单磷酸尿苷(UMP)、5-甲基胞苷单磷酸、5-羟甲基胞苷单磷酸、单磷酸胞苷(CMP)、环单磷酸腺苷(cAMP)、环单磷酸鸟苷(cGMP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、单磷酸脱氧胸苷(dTMP)、单磷酸脱氧尿昔(dUMP)和单磷酸脱氧胞昔(dCMP)。所述核苷酸优选选自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP、dCMP和dUMP。核苷酸最优选选自dAMP、dTMP、dGMP、dCMP和dUMP。目标双链多核苷酸优选包含下列核苷酸：dAMP、dUMP和/或dTMP、dGMP和dCMP。

所述目标双链多核苷酸优选包含下列核苷酸：dAMP、dUMP和/或dTMP、dGMP和dCMP。

核苷酸可以是无碱基的(即缺乏核碱基)。核苷酸也可以是缺乏核碱基和糖(即是C3间隔区)。

目标多核苷酸中的核苷酸可以以任何方式彼此连接。如在核酸中一样，核苷酸通常通过它们的糖和磷酸基团连接。如嘧啶二聚体中一样，所述核苷酸可通过它们的核碱基连接。

目标多核苷酸是双链的。目标多核苷酸可以含有一些单链区，但至少目标多核苷酸的一部分是双链的。

所述目标多核苷酸可以是核酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。目标多核苷酸可以包含与DNA的一条链杂交的一条RNA链。多核苷酸可以是本领域中已知的任何合成核酸，例如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)、桥连核酸(BNA)或其它具有核苷酸侧链的合成聚合物。PNA骨架是由通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)甘氨酸重复单元组成。GNA骨架是由通过磷酸二酯键连接的甘醇(glycol)重复单元组成。TNA骨架是由通过磷酸二酯键连接在一起的苏糖重复单元组成。LNA是由在核糖部分中具有连接2′氧和4′碳的额外的桥的如上所述的核糖核苷酸形成。桥连核酸(BNA)为经修饰的RNA核苷酸。它们也可以被称为被约束的或不可接近的RNA。BNA单体可含有具有“固定的”C3′-内糖褶皱(C3’-endo sugar puckering)的五元的、六元的或甚至七元的桥连结构。所述桥是在核糖的2′，4′-位置通过合成而引入的，以产生2′，4′-BNA单体。

所述多核苷酸最优选为核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。

所述目标多核苷酸可以是任何长度。例如，多核苷酸可以是至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少400或至少500个核苷酸对的长度。所述多核苷酸可以是1000或更多个核苷酸对、5000或更多个核昔酸对长度，或100000或更多个核苷酸对长度。

所述目标多核苷酸通常存在于任何合适的样品中。本发明通常针对已知含有或怀疑含有所述目标多核苷酸的样品实施。或者，可对样品实施本发明，以确认在样品中的存在是已知的或期望的一个或多个目标多核苷酸的同一性。

所述样品可以是生物样品。本发明可以针对从任何有机体或微生物中获得或提取的样品在体外实施。所述有机体或微生物通常是古细菌的(archaeal)、原核的或真核的，并且通常属于以下五界之一：植物界、动物界、真菌、原核生物和原生生物。本发明针对从任何病毒中获得或提取的样品在体外实施。所述样品优选是液体样品。样品通常包括患者的体液。所述样品可以是尿液，淋巴液，唾液，粘液或羊水，但优选血液，血浆或血清。通常，所述样品来源于人，但替代地可以是来自其他哺乳动物，如自商业上养殖的动物如马，牛，绵羊，鱼，鸡或猪，或者替代地可以是宠物如猫或狗。或者，所述样品可以来源于植物，例如从商业作物获得的样品，如谷类，豆类，水果或蔬菜，例如小麦，大麦，燕麦，芸苔，玉米，大豆，水稻，大黄，香蕉，苹果，番茄，土豆，葡萄，烟草，菜豆，小扁豆，甘蔗，可可，棉花。

所述样品可以是非生物样品。所述非生物样品优选为流体样品。非生物样品的实例包括手术液，水如饮用水、海水或河水，以及用于实验室试验的试剂。

所述样品通常是在本发明中使用前处理，例如通过离心，或通过膜过滤掉不需要的分子或细胞，例如红细胞。所述样品可在采集后立即测量。样品也可通常在测定前被存储，优选低于-70℃存储。

提供具有两个适配体的多核苷酸

目标双链多核苷酸上配置为在一端具有Y适配体，而在另一端具有发夹环适配体。Y适配体和/或发夹环适配体是典型的多核苷酸适配体。它们可以由上面论述的任何多核苷酸形成。

Y适配体通常包括双链区域和单链区域或在另一端不互补的区域。如果Y适配体包括单链区域，则可被描述为具有突出端。Y适配体中非互补区的存在给予适配体以Y形，因为这两条链与双链部分不同，通常彼此不杂交。Y适配体包括一个或多个第一锚。锚在下面更详细地论述。

Y适配体优选包括优先旋入所述孔中的前导序列。所述前导序列有助于本发明的方法。前导序列被设计为优先地旋入跨膜孔，且由此有助于多核苷酸穿过所述孔的移动。所述前导序列也可以用于将所述多核苷酸连接到锚(一个或多个)，如下面所论述的。

所述前导序列通常包括聚合物。所述聚合物优选带负电荷。所述聚合物优选多核苷酸，如DNA或RNA、修饰的核苷酸(如脱碱基的DNA)、PNA、LNA、聚乙二醇(PEG)或多肽。前导优选包含多核苷酸，更优选包含单链多核苷酸。前导序列可以包括上面论述的任何多核苷酸。单链前导序列最优选包括DNA的单链，如聚胸苷部分。所述前导序列优选包括所述一个或多个间隔区。

所述前导序列可以是任意长度，但通常长度为10至150个核苷酸长度，例如20至150个核苷酸长度。所述前导的长度通常取决于本方法中使用的跨膜孔。

合适的发夹环适配体可以使用本领域已知的方法来设计。发夹环可以是任何长度。发夹环一般为110或更少个核苷酸，例如100或更少个核苷酸，90或更少个核苷酸，80或更少个核苷酸，70或更少个核苷酸，60或更少个核苷酸，50或更少个核苷酸，40或更少个核苷酸，30个或更少核苷酸，20或更少个核苷酸，或10或更少个核苷酸长度。发夹环优选约1至110，2到100，5至80，或6到50个核苷酸长度。如果发夹环包含在适配体的不同选择性中，较长长度的发夹环，如50到110个核苷酸，是优选的。类似地，如果所述发夹环不包含在如下论述的可选结合中，较短长度的发夹环，如1至5个核苷酸，是优选的。

所述发夹环适配体优选包括可选结合部分。这允许所述第一和/或第二多核苷酸被纯化或分离。可选结合部分是在其结合特性的基础上可以被选择的部分。因此，可选结合部分优选为特异性结合到表面的部分。可选结合部分特异性地结合到表面上——如果其与本发明中使用的任何部分相比，能以更大的程度结合到表面。在优选的实施方案中，所述部分结合到本发明中使用的何其他部分未结合的表面。

合适的可选结合部分是本领域已知的。优选的可选结合部分包括，但不限于，生物素、多核昔酸序列、抗体、抗体片段，如Fab和ScSv，抗原、多核苷酸结合蛋白、聚组氨酸尾部和GST标签。最优选的可选结合部分是生物素和可选的多核昔酸序列。生物素特异性结合到涂覆有抗生物素蛋白的表面。可选的多核苷酸序列特异性结合(即杂交)到涂覆有同源序列的表面。或者，可选的多核苷酸序列特异性结合到涂覆有多聚核苷酸结合蛋白的表面。

所述发夹环适配体和/或所述可选结合部分可包括可被切割、缺口、劈裂或水解的区域。这种区域可以被设计为允许所述第一和/或第二多核苷酸在纯化或分离之后从其所结合的表面去除。合适的区域是本领域中公知的。合适的区域包括，但不限于，RNA区域、包括脱硫生物素和链霉亲和素、二硫键的区域，和可光裂解的区域。

可以使用本领域中已知的任何方法，将Y适配体和/或发夹环适配体接合到所述多核苷酸。适配体中的一个或两者可使用连接酶，如T4 DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、Taq酶DNA连接酶、Tma DNA连接酶和9°N DNA连接酶进行接合。或者，所述适配体可以使用以下论述的本发明的方法加入到所述多核苷酸。

在优选的实施方案中，本方法的步骤a)包括修饰目标双链多核昔酸，使得其一端包括Y适配体且在另一端包括发夹环适配体。任何修饰方式均可以使用。本方法优选包括根据本发明修饰目标双链多核苷酸。这在下面更详细地论述。修饰和表征的方法可以以任何方式进行组合。

膜

根据本发明可以使用任何膜。合适的膜是本领域公知的。膜优选是两亲性层。两亲性层是由两亲性分子形成的层，例如磷脂，其具有亲水性和亲脂性。两亲分子可以是合成的或天然存在的。形成单层的非天然存在的两亲物(一个或多个)是本领域已知的，包括例如嵌段共聚物(Gonzalez-Perez等人，Langmuir，2009，25，10447-10450)。嵌段共聚物是其中两个或更多个单体亚单元聚合在一起产生单一聚合物链的聚合物材料。嵌段共聚物通常具有由每个单体亚单元贡献的性质。然而，嵌段共聚物可具有由各个亚单元形成的聚合物不具有的独特性质。可以改造嵌段共聚物，使得单体亚单元之一是疏水的(即亲脂的)，而其它亚单元在水性介质中是亲水的。在这种情况下，嵌段共聚物可以具有两亲性质并且可以形成能模拟生物膜的结构。嵌段共聚物可以是二嵌段(由两个单体亚单元组成)，但也可以由多于两个单体亚单元构成，以形成表现为两亲物的更复杂的构型。共聚物可以是三嵌段，四嵌段或五嵌段共聚物。膜优选是三嵌段共聚物膜。

古细菌双极性性四醚脂质(bipolar tetraether lipids)是天然存在的脂质，其被构建为使得该脂质形成单层膜。这些脂质通常存在于在恶劣的生物环境存活的极端微生物，嗜热菌，嗜盐菌和嗜酸菌中。它们的稳定性被认为源于最终双层的融合性质。通过产生具有亲水-疏水-亲水的通用基序的三嵌段聚合物，可以直接构建模拟这些生物实体的嵌段共聚物材料。这种材料可以形成单体膜，其类似于脂质双层而发挥作用，并且包括从囊泡到层状膜的一系列相行为。由这些三嵌段共聚物形成的膜与生物脂质膜相比具有一些优点。因为所述三嵌段共聚物是合成的，可仔细控制精确的构造以提供形成膜和与孔及其它蛋白质相互作用所需的正确的链长度和性质。

嵌段共聚物也可以由不归类为脂质亚材料的亚单元构造而成；例如疏水性聚合物可以由硅氧烷或其它非烃基单体制成。嵌段共聚物的亲水性子部也可以具有低的蛋白质结合性质，这允许产生当暴露于未加工的生物样品时高度耐受的膜。该头部基团单元还可以衍生自非经典脂质头部基团。

与生物脂质膜相比，三嵌段共聚物膜还具有增加的机械和环境稳定性，例如高得多的操作温度或pH范围。嵌段共聚物的合成性质为广泛的应用提供了定制基于聚合物的膜的平台。

在优选的实施方案中，本发明提供了在包含三嵌段共聚物的膜中使用跨膜孔来表征目标双链多核苷酸的方法，可选地，其中所述膜被修饰为有助于耦合。

所述膜最优选为在国际申请No.PCT/GB2013/052766或PCT/GB2013/052767中公开的膜之一。

所述两亲分子可以是经化学修饰的或官能化的以有助于对多核苷酸的耦合。

该两亲性层可以是单层或双层。两亲性层通常是平面的。两亲性层可以是弯曲的。两亲性层可以被支撑。

两亲膜通常是天然可移动的，本质上充当具有约10^-8cm>-1的脂质扩散速率的二维流体。这意味着所述孔和耦合的多核苷酸通常在两亲膜内移动。

膜可以是脂质双层。脂质双层是细胞膜的模型，并且作为一系列实验研究的优良平台。例如，脂质双层可以用于通过单通道记录进行的膜蛋白的体外研究。或者，脂质双层可用作生物传感器以检测多种物质的存在。脂质双层可以是任何脂质双层。合适的脂质双层包括但不限于平面脂质双层、受支撑双层，或脂质体。脂质双层优选为平面脂质双层。合适的脂质双层在国际申请号PCT/GB08/000563(公开为WO 2008/102121)，国际申请号PCT/GB08/004127(公开为WO 2009/077734)和国际申请号PCT/GB2006/001057(公开为WO 2006/100484)中公开。

形成脂质双层的方法是本领域已知的。合适的方法公开在实施例中。脂质双层通常通过Montal和Mueller(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1972；69：3561-3566)的方法形成，其中脂质单层被携带在水溶液/空气界面上，穿过垂直于该界面的孔的任一侧。通常通过下述将脂质添加到电解质水溶液的表面：首先将脂质溶解在有机溶剂中，然后允许溶剂滴在孔的任一侧上的水溶液的表面上蒸发。一旦有机溶剂蒸发，孔的任一侧上的溶液/空气界面物理地上下移动，穿过所述孔直到形成双层。平面脂质双层可以形成为，穿过膜中的孔或穿过开口而进入凹部。

Montal&Mueller的方法是受流行的，因为它是形成适合于蛋白质孔插入的优质脂质双层的成本划算和相对直接的方法。形成双层的其他常见方法包括脂质体双层的尖端浸渍、喷涂双层和膜片钳。

尖端浸渍双层的形成需要使孔表面(例如，移液管尖端)接触到携带脂质单层的测试溶液的表面上。另外，首先通过允许溶解在有机溶剂中的脂质滴在溶液表面蒸发而在溶液/空气界面处产生脂质单层。然后通过Langmuir-Schaefer方法形成双层，并且需要机械自动化以相对于溶液表面移动所述孔。

对于喷涂双层，将溶解在有机溶剂中的脂质滴直接施加到孔中，将该孔浸没在水性测试溶液中。使用油漆刷或等效物将脂质溶液薄薄地铺在孔上。溶剂的稀释(thinning)导致脂质双层的形成。然而，从双层中完全去除溶剂是困难的，因此由该方法形成的双层在电化学测量期间不太稳定且更容易产生噪声。

膜片钳通常用于生物细胞膜的研究。通过抽吸将细胞膜夹到移液管的末端，并且膜的小块贴附在孔上。该方法已经被调整为通过夹住脂质体，然后脂质体破裂而在移液管的孔口上形成脂质双层密封，而产生脂质双层。该方法需要稳定的巨大且单层的脂质体以及需要在具有玻璃表面的材料中制造小孔。

脂质体可以通过超声，挤出或Mozafari方法(Colas等人(2007)Micron 38：841-847)形成。

在优选的实施方案中，脂质双层如国际申请号PCT/GB08/004127(公开为WO 2009/077734)中所述形成。有利地，在该方法中，脂质双层由干燥的脂质形成。在最优选的实施方案中，脂质双层穿越开口形成，如WO2009/077734(PCT/GB08/004127)中所述。

脂质双层由两个相对的脂质层形成。两层脂质排列成使得它们的疏水尾部基团彼此面对以形成疏水内部。脂质的亲水性头部基团在双层的每一侧上面向外朝向水性环境。双层可存在于许多脂质相中，包括但不限于液体无序相(流体层状相)，液态有序相，固态有序相(层状凝胶相，交叉凝胶相(interdigitated gel phase))和平面双层晶体(层状亚凝胶相，层状结晶相)。

可以使用形成脂质双层的任何脂质组合物。选择脂质组合物，使得形成的脂双层具有所需的特性，例如表面电荷、支撑膜蛋白的能力、填充密度(packing density)或机械特性。脂质组合物可以包含一个或多个不同的脂质。例如，脂质组合物可以含有多达100个脂质。脂质组合物优选含有1至10个脂质。脂质组合物可以包含天然存在的脂质和/或人工脂质。

脂质通常包含头部基团、界面部分和两个可以相同或不同的疏水尾部基团。合适的头部基团包括但不限于中性头部基团，例如二酰基甘油酯(DG)和神经酰胺(CM)；两性离子头部基团，例如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)；带负电荷的头部基团，例如磷脂酰甘油(PG)；磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰肌醇(PI)，磷酸(PA)和心磷脂(CA)；以及带正电荷的头部基团，例如三甲基铵-丙烷(TAP)。合适的界面部分包括但不限于天然存在的界面部分，例如基于甘油或基于神经酰胺的部分。合适的疏水性尾部基团包括但不限于饱和烃链，例如月桂酸(正十二烷酸)，肉豆蔻酸(正十四烷酸)，棕榈酸(正十六烷酸)，硬脂酸(正十八烷酸)和花生酸(正二十烷酸)；不饱和烃链，例如油酸(顺-9-十八烷酸)；和支链烃链，例如植烷酰基(phytanoyl)。链的长度和不饱和烃链中双键的位置和数目可以变化。链的长度和支链烃链中支链(例如甲基)的位置和数目可以变化。疏水性尾部基团可以作为醚或酯连接到界面部分。脂质可以是分枝菌酸。

脂质也可以是化学修饰的。脂质的头部基团或尾部基团可以是化学修饰的。头部基团已被化学修饰的合适的脂质包括但不限于PEG修饰的脂质，例如1，2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]；官能化的PEG脂质，例如1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[生物素基(聚乙二醇)2000]；和修饰为用于轭合的脂质，例如1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰基)和1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基)。尾部基团已经化学修饰的合适的脂质包括但不限于可聚合脂质，例如1，2-双(10，12-二十三碳二炔酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱；氟化脂质，例如1-棕榈酰基-2-(16-氟棕榈酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱；氘代脂质，例如1，2-二棕榈酰基-D62-sn-甘油-3-磷酸胆碱；和醚连接的脂质，例如1，2-二-O-植烷基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。脂质可以被化学修饰或官能化以促进多核苷酸的耦合。

两亲性层，例如脂质组合物，通常包含一个或多个将影响该层的性质的添加剂。合适的添加剂包括但不限于脂肪酸，例如棕榈酸，肉豆蔻酸和油酸；脂肪醇，例如棕榈醇，肉豆蔻醇和油醇；甾醇，例如胆固醇，麦角固醇，羊毛甾醇，谷甾醇和豆甾醇；溶血磷脂，例如1-酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱；和神经酰胺。

在另一个优选的实施方案中，膜是固态层。固态层可以由有机和无机材料形成，包括但不限于微电子材料，绝缘材料例如Si₃N₄，Al₂O₃和SiO，有机和无机聚合物例如聚酰胺，塑料例如或者弹性体例如双组分加成固化硅橡胶，以及玻璃。固态层可以由石墨烯形成。合适的石墨烯层公开在国际申请号PCT/US2008/010637(公开为WO 2009/035647)中。

该方法通常使用(i)包含孔的人工两亲性层，(ii)包含孔的分离的天然存在的脂质双层，或(iii)具有插入其中的孔的细胞进行实施。该方法通常使用人工两亲性层，如人工三嵌段共聚物层进行实施。该层除了孔之外还可以包含其它跨膜蛋白和/或膜内蛋白以及其他分子。下面论述合适的装置和条件。本发明的方法通常在体外进行。

耦合

所述多核苷酸可以使用任何已知的方法耦合到所述膜。使用至少两个锚将所述多核苷酸耦合到所述膜。

所述Y适配体包括一个或多个第一锚。发夹环适配体包括一个或多个第二锚。每个锚包括耦合到(或结合到)所述适配体的基团，和耦合到(或结合到)所述膜的基团。每个锚可以共价地耦合到(或结合到)所述适配体和/或所述膜。

所述Y适配体可以包含任何数量的第一锚，如2，3，4个或更多的锚。发夹环适配体可以包含任意数量的第二锚，例如2，3，4个或更多的锚。例如，一个或这两个适配体可包括两个锚，其中每个锚独立耦合到(或结合到)适配体(一个或多个)和膜。

所述一个或多个第一锚和/或所述一个或多个第二锚可以包括一个或多个多核苷酸结合蛋白。每个锚可以包含一个或多个多核苷酸结合蛋白。所述多核苷酸结合蛋白(一个或多个)可以是上文论述的任何多核苷酸结合蛋白。

如果膜是两亲性层，如共聚物膜或脂质双层，则所述一个或多个锚优选地包括存在于所述膜中的多肽锚和/或存在于所述膜中的疏水锚。所述疏水锚优选是脂质、脂肪酸、甾醇、碳纳米管、多肽、蛋白质或氨基酸，例如胆固醇、棕榈酸酯或生育酚。在优选的实施方案中，所述一个或多个锚不是检测器。

膜的组分，如两亲分子、共聚物或脂质，可以是化学修饰的或官能化的，以形成一个或多个锚。合适的化学修饰和合适的官能化所述膜的组分的方式的实例在下面更详细地论述。任何比例的膜组分可以被官能化，例如至少0.01％、至少0.1％、至少1％、至少10％、至少25％、至少50％或100％。

所述Y适配体和/或发夹环适配体可以直接耦合到膜上。所述一个或多个第一锚和/或所述一个或多个第二锚优选包括连接体。所述一个或多个第一锚和/或所述一个或多个第二锚可以包括一个或多个，例如2，3，4个或更多个连接体。1个连接体可用于将多于一个的，例如2，3，4个或更多个多核苷酸或适配体耦合到所述膜上。

优选的连接体包括，但不限于，聚合物，如多核苷酸、聚乙二醇(PEG)、多糖和多肽。这些连接体可以是直链的、支链的或环状的。例如，所述连接体可以是环形的多核苷酸。待表征的所述多核苷酸可杂交到环状多核苷酸连接体上的互补序列。

所述一个或多个锚或一个或多个连接体可包含可切割或可断开的组分，如限制性位点或光不稳定基团。

官能化的连接体以及它们耦合分子的方式在本领域中是已知的。例如，用马来酰亚胺基团官能化的连接体将与蛋白质中的半胱氨酸残基反应并连接到其上。在本发明的上下文中，该蛋白质可以存在于该膜中，或者可以用于耦合(或结合)到多核昔酸。这在下面更详细地论述。

可使用“锁和钥匙”排列避免多核苷酸的交联。每个连接体仅一端可一起反应以形成更长的连接体，连接体的其他端各自分别与多核苷酸或膜反应。此类连接体在国际申请No.PCT/GB10/000132(公开为WO 2010/086602)中有描述。

连接体优选用在下文论述的测序实施方案中。如果多核苷酸被永久地直接耦合到所述膜，其意义在于当多核苷酸与孔相互作用时不解耦合，则一些序列数据将由于膜和检测器之间的距离导致测序不能继续进行到多核苷酸的末端而丢失。如果使用连接体，则多核苷酸可以进行到完成为止。

所述耦合可以是永久的或稳定的。换言之，耦合可以是，使得当多核苷酸与所述孔相互作用时，多核苷酸保持耦合到膜上。

所述耦合可以是短暂的。换言之，耦合可以是，使得当多核苷酸与所述孔相互作用时，多核苷酸可以从所述膜上解耦合。

形成永久的/稳定的或短暂的连接的化学基团在下面更详细地论述。所述多核苷酸可使用胆固醇或脂肪酰链短暂地耦合到两亲性层或三嵌段共聚物膜。可以使用具有6至30个碳原子长度的任何脂肪酰链，例如十六烷酸。

在优选的实施方案中，多核苷酸，例如核酸，被耦合到两亲性层，如三嵌段共聚物膜或脂质双层。将核酸耦合到合成脂双层在以前曾使用多种不同的拴系策略(tetheringstrategies)实施。这些总结于下表1中。

表1

合成的多核苷酸和/或连接体可使用在合成反应中经修饰的亚磷酰胺官能化，所述经修饰的亚磷酰胺易于与直接添加合适的锚固基团，如胆固醇、生育酚、棕榈酸酯、硫醇、脂质和生物素基团兼容。这些不同的连接化学物给出了用于连接多核苷酸的一组选择。每个不同的修饰基团以略微不同的方式耦合多核苷酸，并且耦合并不总是永久的，所以给予了连接到膜的多核苷酸以不同的停留时间(dwell time)。短暂的耦合的优点如上所述。

将多核苷酸耦合到连接体或将多核苷酸耦合到官能化的膜还可以通过许多其他手段实现，条件是互补的反应性基团或锚固基团被添加到所述多核苷酸。将反应性基团添加到多核苷酸的任一端在以前已经有报道。硫醇基团可以使用T4多核昔酸激酶和ATPγS添加到ssDNA或dsDNA的5’末端(Grant，G.P.and P.Z.Qin(2007).″在核酸的5′末端连接硝基氧自旋标记物的简伸方法″，Nucleic> 35(10)：e77))。叠氮基可以用T4多核苷酸激酶和γ-[2-叠氮基乙基]-ATP或-γ-〔6-叠氮己基]-ATP添加到ssDNA或dsDNA的5′-磷酸酯。使用硫醇或点击化学(Click chemistry)，将含有硫醇、碘乙酰胺OPSS或马来酰亚胺基团(对硫醇具有反应性)或DIBO(二苯并环辛炔(dibenzocyclooxtyne))或炔基(对叠氮化物具有反应性)的系链共价连接到多核苷酸。更多样化的选择的化学基团，如生物素、硫醇和荧光团，可以使用末端转移酶进行添加，以将修饰的寡核苷酸纳入到ssDNA的3′端(Kumar，A.，P.Tchen，et al.(1988).“以末端脱氧核苷酸转移酶非放射性标记合成的寡核苷酸探针”Anal Biochem 169(2)：376-82)。链霉亲和素/生物素和/或链霉亲和素/脱硫生物素耦合可用于任何其它的多核苷酸。也可以使用具有经合适修饰的核苷酸(例如，胆固醇或棕榈酸酯)的末端转移酶将锚直接添加到多核苷酸。

所述一个或多个第一锚和/或所述一个或多个第二锚优选将目标双链多核苷酸经杂交耦合到所述膜。所述杂交可以存在于一个或多个锚中的任何部分，例如一个或多个锚和多核苷酸之间，所述一个或多个锚内，或所述一个或多个锚和膜之间。在一个或多个锚中的杂交使得以如上所论述的瞬时方式耦合。例如，连接体可以包括两个或更多个杂交在一起的多核苷酸，如3，4或5个多核苷酸。所述一个或多个第一锚和/或所述一个或多个第二锚可以杂交到所述目标双链多核苷酸。所述一个或多个第一锚可以直接杂交到目标双链多核苷酸，或直接杂交到Y适配体和/或前导序列。所述一个或多个第二锚可以直接杂交到所述目标双链多核苷酸，或直接杂交到发夹环适配体。替代地，所述一个或多个第一锚可以被杂交到一个或多个，例如2或3个，杂交到目标双链目标多核苷酸或Y适配体和/或前导序列的中间多核苷酸(或“夹板”)。替代地，所述一个或多个第二锚可以杂交到一个或多个，例如2或3个，杂交到目标目标双链多核苷酸或发夹环适配体的中间多核苷酸(或“夹板”)。如下面更详细地论述的，所述一个或多个锚与一个或多个夹板的杂交可形成一个或多个刚性双链多核苷酸连接体。

所述一个或多个第一锚和/或一个或多个第二锚可包括单链多核苷酸或双链多核苷酸。锚的一部分可以接合到双链多核苷酸。使用T4 RNA连接酶I接合ssDNA的短片段已经被报道(Troutt，A.B.，M.G.McHeyzer-Williams等人(1992).″接合-锚定PCR技术：具有单侧特异性的简单扩增技术.″Proc Natl Acad Sci U S A 89(20)：9823-5)。替代地，单链或双链多核苷酸可以接合到双链多核苷酸，然后通过热变性或化学变性分离两条链。对于双链目标多核苷酸，可以将单链多核苷酸的片段添加到该双链体的一端或两端，或将一双链多核昔酸添加到一端或两端。对于将单链多核苷酸添加到双链多核苷酸，可以使用T4RNA连接酶I来实现，用于连接到单链多核昔酸的其他区域。对于将双链多核苷酸添加到双链多核苷酸，接合可以用分别在目标多核昔酸和添加的多核苷酸上互补的3′dA/dT尾部(如同常规地对许多样品制备应用所做的，以防止多联体或者二聚体形成)或使用由多核苷酸的限制消化和相容适配体的接合而产生的“粘性末端”，进行“钝化终止(blunt-ended)”。然后，当双链体熔化时，每条单链将具有5′或3′修饰——如果使用单链多核苷酸在5’端进行连接或修饰，每天单链具有3′端或两端修饰——如果使用双链多核苷酸进行接合。

如果多核昔酸是合成链，可以在多核苷酸的化学合成过程中引入适配体和锚。例如，多核昔酸可以使用具有连接到它的反应性基团的引物来合成。

腺苷化(Adenylated)的多核昔酸是接合反应中的中间体，其中单磷酸腺苷连接到多核苷酸的5′-磷酸。多种试剂盒可用于产生该中间体，例如来自NEB的5′-DNA腺苷化试剂盒。通过在反应中用ATP取代修饰的核苷酸三磷酸，可以将反应性基团(例如硫醇、胺、生物素、叠氮化物等)添加到多核苷酸的5′端。也可以使用具有适当修饰的核苷酸(例如，胆固醇或棕榈酸酯)的5′DNA腺苷酰化试剂盒将锚直接添加到多核苷酸。

基因组DNA的片段的扩增的常用技术是使用聚合酶链反应(PCR)。本文中，使用两个合成寡核苷酸引物可以生成许多的DNA相同片段的拷贝，其中对于每个拷贝，双链体中每条链的5′将是合成的多核苷酸。单个或多个核苷酸可以通过使用聚合酶被添加到单链或双链的DNA的3′端。可使用的聚合酶的实例包括，但不限于，末端转移酶、Klenow和大肠杆菌多(A)(Poly(A))聚合酶。通过在反应中用dATP取代被修饰的核苷酸三磷酸，可将锚，例如胆固醇、硫醇、胺、叠氮化物、生物素或脂质，纳入到双链多核苷酸中。因此，扩增的多核苷酸的每个拷贝将包含锚。

所述锚可包含耦合到、结合到下述物质或与之相互作用：单链或双链多核苷酸、多核苷酸内特定的核苷酸序列，或多核苷酸内经修饰核苷酸的模式，或多核苷酸上存在的任何其它配体。

在锚中使用的合适的多核苷酸结合蛋白包括但不限于，大肠杆菌单链结合蛋白、P5单链结合蛋白、T4gp32单链结合蛋白、TOPO V dsDNA结合区域、人类组蛋白、大肠杆菌HUDNA结合蛋白和其他古细菌的、原核的或真核的单链或双链多核苷酸(或核酸)结合蛋白，包括下文列出的那些。

特定的核苷酸序列可以是由转录因子、核糖体、核酸内切酶、拓扑异构酶或复制起始因子识别的序列。修饰的核苷酸的模式可以是甲基化模式或损伤模式。

所述一个或多个第一锚和/或所述一个或多个第二锚可包含结合到、嵌入多核苷酸或与多核苷酸相互反应的任何基团。该基团可以通过静电结合、氢键合或范德华相互作用而嵌入或与多核苷酸相互作用。这类基团包括赖氨酸单体、聚赖氨酸(其将与ssDNA或dsDNA相互作用)，溴化乙锭(其将嵌入dsDNA)，通用碱基或通用核苷酸(可以与任何多核苷酸杂交)和锇络合物(可以对甲基化碱基反应)。因此多核苷酸可使用连接到膜的一个或多个通用核苷酸耦合到膜。每个通用核苷酸可以使用一个或多个连接体耦合到膜。通用核苷酸优选包括以下的核碱基中的一个：次黄嘌呤、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚、6-硝基吲哚、甲酰基吲哚、3-硝基吡咯、硝基咪唑、4-硝基吡唑、4-硝基苯并咪唑、5-硝基吲唑、4-氨基苯并咪唑或苯基(C6-芳族环)。通用核苷酸更优选包括下列核苷中的一个：2′-脱氧肌苷，肌苷、7-脱氮杂-2′-脱氧肌苷、7-脱氮杂-肌苷、2-氮杂-脱氧肌苷、2-氮杂-肌苷、2-O′-甲基肌苷、4-硝基吲哚2′-脱氧核糖核苷、4-硝基吲哚核糖核苷、5-硝基吲哚-2′-脱氧核糖核昔、5-硝基吲哚核糖核苷、6-硝基吲哚-2′-脱氧核糖核苷、6-硝基吲哚核糖核苷、3-硝基吡咯2′-脱氧核糖核苷、3-硝基吡咯核糖核昔、次黄嘌呤的无环糖类似物、硝基咪唑2′-脱氧核糖核昔、硝基咪唑核糖核苷、4-硝基吡唑2′-脱氧核糖核苷、4-硝基吡唑核糖核苷、4-硝基苯并咪唑2′-脱氧核糖核苷、4-硝基苯并咪唑核糖核苷、5-硝基吲唑2′-脱氧核糖核苷、5-硝基吲唑核糖核苷、4-氨基苯并咪唑2′-脱氧核糖核苷、4-氨基苯并咪唑核糖核苷、苯基C-核糖核苷、苯基C-2′-脱氧核糖基核苷、2′-脱氧水粉蕈素(2′-deoxynebularine)、2′-脱氧异鸟苷、K-2′-脱氧核糖、P-2′脱氧核糖和吡咯烷。通用核昔酸更优选包含2′-脱氧肌苷。通用核苷酸更优选为IMP或dIMP。通用核苷酸最优选为dPMP(2′-脱氧-P-核苷单磷酸)或dKMP(N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤单磷酸)。

所述一个或多个锚可以通过Hoogsteen氢键(其中两个核碱基通过氢键保持在一起)或反向Hoogsteen氢键(其中一个核碱基相对于另一个核碱基旋转180°)耦合到(或结合到)多核苷酸。例如，所述一个或多个锚可以包含一个或多个核苷酸、一个或多个寡核昔酸，或一个或多个多核苷酸，其与多核苷酸形成Hoogsteen氢键或反向Hoogsteen氢键。这种类型的氢键允许第三个多核苷酸链缠绕到双链螺旋并形成三链体。所述一个或多个锚可以通过与双链二链体形成三链体而耦合到(或结合到)双链多核苷酸。

在本实施方案中，至少1％、至少10％、至少25％、至少50％或100％的膜组分可以被官能化。

如果所述一个或多个第一锚和/或一个或多个第二锚包含蛋白，其能够无需进一步官能化，直接锚固到膜中，例如，如果其已经具有一个与膜相容的外部疏水区时。这类蛋白的实例包括，但不限于，跨膜蛋白、膜内蛋白和膜蛋白。或者，所述蛋白可以用与膜相容的遗传融合的疏水区来表达。这种疏水蛋白区在本领域中是已知的。

在另一个方面，所述Y适配体和/或所述发夹环适配体可使用上述方法官能化，从而使其可以被特定的结合基团识别。具体地，所述适配体可以用配体如生物素(用于结合到链霉亲和素)、直链淀粉(用于结合到麦芽糖结合蛋白或融合蛋白)、Ni-NTA(用于结合到聚组氨酸或聚组氨酸标记的蛋白)或肽(如抗原)官能化。

在化学连接中使用的分子的实例是EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)。反应性基团也可以使用商购的试剂盒(Thermo Pierce，货号No.22980)被添加到多核苷酸的5’端。合适的方法包括，但不限于，使用组氨酸残基和Ni-NTA进行的短暂亲和连接，以及由反应性半胱氨酸、赖氨酸或非天然氨基酸进行的更牢固的共价连接。

耦合强度

将发夹环适配体耦合(或结合)到膜的强度比将Y适配体耦合(或结合)到膜的强度大。这可以用任何方式来测量。用于测量耦合(或结合)的强度的合适方法在实施例中公开。

发夹环适配体的耦合(或结合)强度优选为Y适配体的耦合(或结合)强度的至少1.5倍，例如至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍或至少10倍于Y适配体的耦合(或结合)强度。发夹环适配体对膜的亲和常数(Kd)优选为Y适配体对膜的亲和常数的至少1.5倍，例如至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍或至少10倍于Y适配体的耦合强度。

有几种将所述发夹环适配体比所述Y适配体更强地耦合(或结合)到所述膜的方法。例如，发夹环适配体可以比Y适配体包括更多锚。例如，所述发夹环适配体可以包括2个、3个或更多个第二锚，而Y适配体可以包括1个第一锚。

所述一个或多个第二锚耦合(或结合)到所述膜的强度可以比所述一个或多个第一锚耦合(或结合)到所述膜的强度大。所述一个或多个第二锚耦合(或结合)到所述发夹环适配体的强度可以比所述一个或多个第一锚耦合(或结合)到所述Y适配体的强度大。所述一个或多个第一锚和所述一个或多个第二锚可通过杂交连接到各自的适配体，且杂交的强度在所述一个或多个第一锚中比在所述一个或多个第二锚中更大。这些实施方案的任何组合也可以用于本发明。耦合(或结合)的强度可以使用本领域已知的技术测量。

所述一个或多个第二锚优选包括耦合(或结合)到所述膜的一个或多个基团，其比耦合(或结合)到所述膜的所述一个或多个第一锚中的一个或多个基团具有更大的强度。在优选的实施方案中，所述发夹环适配体/一个或多个第二锚使用胆固醇耦合(或结合)到所述膜，Y适配体/一个或多个第一锚使用棕榈酸酯耦合(或结合)到所述膜。胆固醇比棕榈酸酯更强地结合到三嵌段共聚物膜和脂质膜。在一个替代性实施方案中，所述发夹环适配体/一个或多个第二锚使用单酰基物质例如棕榈酸酯耦合(或结合)到所述膜，且Y适配体/一个或多个第一锚使用二酰基物质例如二棕榈酰磷脂酰胆碱耦合(或结合)到所述膜。可能会影响所述一个或多个基团耦合(或结合)到所述膜的能力的其它因素包括，但不限于，所述一个或多个锚或所述一个或多个连接体的电荷或疏水性，或者熵值(entropic cost)。例如，所述一个或多个第一锚和一个或多个第二锚可包括胆固醇，但所述一个或多个第二锚的电荷可以增加其胆固醇耦合(或结合)到膜的能力，或所述一个或多个第一锚的电荷可以降低其胆固醇耦合(或结合)到膜的能力。

所述一个或多个第一锚可包括一个或多个刚性连接体且所述一个或多个第二锚可包括一个或多个柔性连接体。所述柔性连接体可以使得耦合(或结合)到膜一个或多个基团能相对于目标双链多核苷酸移动，且由此增加耦合的可能性。在本实施例中，在第一锚和第二锚中，耦合(或接合)到所述膜的所述一个或多个基团可以相同。例如，所述一个或多个第一锚可包括一个或多个刚性连接体和胆固醇，且所述一个或多个第二锚可包括一个或多个柔性连接体和胆固醇。合适的连接体如上所述。所述刚性连接体是基本上不弯曲或挠曲，且不允许沿着它们的长度或在它们的连接点大量旋转的那些连接体。刚性连接体是不允许耦合(或结合)到所述膜的所述一个或多个基团相对于目标双链多核苷酸大量移动的那些连接体。在刚性连接体包括聚合部分或低聚部分的情况下，在刚性测量时，所述聚合部分或低聚部分比对应聚合物或低聚物的持续长度(persistence length)短。持续长度可以使用本领域中已知的方法测量或计算。例如，双链DNA的持续长度为大约50nm或500埃或147个核苷酸对。小于147个核苷酸对长度的DNA的双链DNA的链段被认为是刚性的。刚性连接体包括，但不限于，包含双链多核苷酸的那些刚性连接体，包括DNA，共轭有机部分或具有限制构象自由度的庞大侧链的有机部分。所述一个或多个刚性连接体优选包含一个或多个双链多核苷酸。也可以使用上面论述的任何多核苷酸。所述一个或多个刚性连接体的优选长度为5，10，15，20，25，27，30，35，40或更多个核苷酸对。

柔性连接体是基本上弯曲或挠曲或旋转的那些连接体。柔性连接体可以沿着它们的长度或在一个或两个其连接点处弯曲或挠曲。柔性连接体允许耦合(或结合)到膜的一个或多个基团相对于目标双链多核苷酸的大量移动。柔性连接体是允许目标双链多核昔酸的取向进行实质变化的那些连接体。柔性连接体可通过一维或二维挠曲允许所述一个或多个基团移动。替代地或另外地，柔性连接体可允许一个或多个基团绕轴旋转而移动。在柔性连接体包括聚合部分的或低聚部分的情况下，如果聚合部分或低聚部分与相应的聚合物或低聚物的持续长度相似或比其更长，则聚合部分或低聚部分贡献显著的柔性。柔性连接体包括，但不限于，那些含有单链寡核昔酸或多核苷酸、短碳间隔区(例如烷烃和烯烃)、多肽、多组氨酸标签、核苷衍生物、短多糖或它们的组合的连接体。柔性连接体通常还允许耦合(或结合)到膜的一个或多个基团的旋转。柔性连接体可以允许在至少一个轴中的转动。所述轴优选为连接体的纵向轴。所述一个或多个柔性连接体优选包括一个或多个间隔区(iSp9)基团或一个或多个间隔区18(iSp18)基团。所述一个或多个柔性连接体优选包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个间隔区9(iSp9)基团和/或1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个间隔区18(iSp18)基团。

优选地，(a)所述发夹环适配体比Y适配体包括更多锚，(b)所述一个或多个第二锚耦合到膜的强度比所述一个或多个第一锚耦合到膜的强度大，(c)将所述一个或多个第二锚耦合到所述发夹环适配体的强度比将所述一个或多个第一锚耦合到Y适配体的强度大，(d)所述一个或多个第一锚和所述一个或多个第二锚经杂交将它们各自的适配体耦合到膜，且杂交的强度在所述一个或多个第二锚中比在所述一个或多个第一锚中大，(e)所述一个或多个第一锚包括一个或多个刚性连接体，且所述一个或多个第二锚包括一个或多个柔性连接体，或(f)(a)到(e)的任何组合。换句话说，本发明优选包含(a)和(b)的组合，(b)和(c)的组合，(c)和(d)的组合，(a)和(c)的组合，(b)和(d)的组合，(a)和(d)的组合，(a)和(e)的组合，(b)和(e)的组合，(c)及(e)的组合，(d)和(e)的组合，(a)、(b)及(c)的组合，(b)、(c)及(d)的组合，(a)、(b)和(d)的组合，(a)、(c)和(d)的组合，(a)、(b)和(e)的组合，(a)、(c)和(e)的组合，(a)、(d)和(e)的组合，(b)、(c)和(e)的组合，(b)、(d)和(e)的组合，(c)、(d)和(e)的组合，(a)、(b)、(c)及(d)的组合，(a)、(b)、(c)和(e)的组合，(a)、(b)、(d)和(e)的组合，(a)、(c)、(D)和(e)的组合，(b)、(c)、(d)和(e)的组合，或(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的组合。

跨膜孔

所述方法包括当多核苷酸的至少一条链相对于跨膜孔移动时，获取一个或多个测量值。可使用所述孔得到多种不同类型的测量值。这包括但不限于：电测量和光学测量。可能的电测量包括：电流测量、阻抗测量、隧道测量(tunnelling measurement)(Ivanov APet al.，Nano Lett.2011 Jan 12；11(1)：279-85)以及FET测量(国际申请号WO 2005/124888)。光学测量可以与电测量组合(Soni GV et al.，Rev Sci Instrum.2010 Jan；81(1)：014301)。所述测量可以是跨膜电流测量，如流经孔的离子电流的测量值。

电测量值可以使用在Stoddart D等人，Proc Natl Acad Sci，12；106(19)：7702-7，Lieberman KR等人，J Am Chem Soe.2010；132(50)：17961-72，和国际申请WO 2000/28312中所描述的标准的单通道记录设备获得。或者，电测量可以使用多通道系统进行，例如国际申请WO 2009/077734和国际申请号WO 2011/067559中描述的。

本方法优选用跨膜施加的电势实施。所施加的电势可以是电压电势。或者，所施加的电势可以是化学势。这方面的实例是跨膜，如两亲性层，使用盐梯度。盐梯度在Holden etal.，J Am Chem Soc.2007 Jul 11；129(27)：8650-5中公开。在一些情况下，当多核苷酸相对于孔移动时，使用流经检测器(或孔)的电流来评估或确定多核苷酸的序列。这就是链测序。

该方法包括将多核苷酸与跨膜孔接触。跨膜孔是在一定程度上穿过所述膜的结构。其允许由施加的电势驱动的水合离子流过膜或在膜内流动。跨膜孔通常穿过整个膜，使得水合离子可从膜的一侧流到膜的另一侧。然而，跨膜孔不是必须穿过膜。它可以是一端闭合的。例如，所述孔可以是位于水合离子沿其流动或流入其中的膜中的阱、间隙、通道、沟槽或狭缝。

步骤(c)优选包括：随着至少一条链相对于所述孔的移动，获取流经所述孔的电流的一个或多个测量值，其中所述一个或多个测量值表示所述至少一条链的一个或多个特征。

任何跨膜孔可以在本发明中使用。所述孔可以是生物的或人工的。合适的孔包括但不限于，蛋白孔、多核昔酸孔和固态孔。所述孔可以是DNA折纸(origami)孔(Langecker等人，Science，2012；338：932-936)。

跨膜孔优选为跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔是允许水合离子如分析物从膜的一侧流向膜的另一侧的多肽或多肽的集合。在本发明中，跨膜蛋白孔能够形成孔，所述孔允许由施加的电势驱动的水合离子从膜的一侧流到膜的另一侧。跨膜蛋白质孔优选允许分析物如核苷酸从膜如三嵌段共聚物膜的一侧流动到另一侧。跨膜蛋白孔允许多核苷酸如DNA或RNA，移动穿过所述孔。

跨膜蛋白质孔可以是单体或低聚物。所述孔优选由几个重复的亚基，例如至少3个，至少4个，至少5个，至少6个、至少7个、至少8个或至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，或至少14个亚基组成。例如3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14个亚基。所述孔优选是六聚体的、七聚体的、八聚体的或九聚体的孔。所述孔可以是同源低聚物或异源低聚物。

跨膜蛋白质孔通常包含该离子可流动通过的桶状体或通道。孔的亚基通常围绕中心轴并且将链贡献到跨膜β桶状体或通道或跨膜α-螺旋束或通道。

跨膜蛋白孔的桶状体或通道通常包含有助于与分析物如核苷酸、多核苷酸或核酸相互作用的氨基酸。这些氨基酸优选定位于靠近桶状体或通道的收缩部(constriction)。跨膜蛋白孔通常包括一个或多个带正电荷的氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸或组氨酸，或芳族氨基酸，例如酪氨酸或色氨酸。这些氨基酸通常有助于孔和核苷酸、多核昔酸或核酸之间的相互作用。

本发明使用的跨膜蛋白孔可衍生自β桶状体孔或α-螺旋束孔。β桶状体孔包含由β链形成的桶状体或通道。合适的β桶状体孔包括，但不限于，β-毒素、如α-溶血素、炭疽毒素和杀白细胞素，和细菌的外膜蛋白/孔蛋白，如耻垢分枝杆菌(Mycobaeterium smegmatis)孔蛋白(Msp)，例如MspA、MspB、MspC或MspD、胞溶素、外膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A和奈瑟球菌属(Neisseria)自转运脂蛋白(NalP)。α-螺旋束孔包含由α-螺旋形成的桶状体或通道。合适的α-螺旋束孔包括但不限于内膜蛋白和α-外膜蛋白，如WZA和ClyA毒素。跨膜孔可以衍生自胞溶素。衍生自胞溶素的合适的孔在国际申请No.PCT/GB2013/050667(公开为WWO 2013/153359)中公开。跨膜孔可以衍生自Msp或α-溶血素(α-HL)。

跨膜蛋白孔优选衍生自Msp，优选MspA。这类孔为寡聚的且通常包含7个，8个，9个或10个衍生自Msp的单体。所述孔可以是衍生自含相同单体的MsP的同源寡聚孔。或者，所述孔可以是从含至少一个与其他单体不同的单体的Msp衍生的异源寡聚孔。优选地，所述孔衍生自MspA或其同源物或旁系同源物(paralog)。

衍生自Msp的单体通常包含SEQ ID NO：2或其变体所示的序列。SEQ ID NO：2为MspA单体的MS-(B1)8突变体。其包括以下突变：D90N，D91N，D93N，D118R，D134R和E139K。SEQID NO：2的变体是多肽，所述多肽具有这样的氨基酸序列：从SEQ ID NO：2的氨基酸序列变化而来且保留了其形成孔的能力。可以使用本领域已知的任何方法测定变体形成孔的能力。例如，变体可以与其他合适的亚基一起插入到两亲性层中，且可以确定其寡聚形成孔的能力。将亚基插入膜例如两亲性层中的方法是本领域已知的。例如，亚基可以以纯化的形式悬浮在含有三嵌段共聚体膜的溶液中，从而使其扩散到膜并通过结合到膜并组装成功能状态而插入。或者，可以使用如M.A.Holden，H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005，127，6502-6503和国际申请No.PCT/GB2006/001057(公开为WO 2006/100484)中所描述的“拾取和放置”方法将亚基直接插入膜中。

在SEQ ID NO：2的氨基酸序列的整个长度上，基于氨基酸同一性，变体将优选与该序列至少50％同源。更优选地，基于氨基酸同一性，所述变体可以是至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，且更优选至少95％，97％或99％在整个序列上与SEQ ID NO：2的氨基酸序列同源。在100个或更多个，例如125，150，175或200个或更多个连续氨基酸的片段(stretch)上，可以具有至少80％，例如至少85％，90％或95％的氨基酸同一性(“严格同源性(hard homology)”)。

可用本领域的标准方法测定同源性。例如，UWGCG包提供了用于计算同源性的BESTFIT程序，例如使用其默认设置(Devereux等人(1984)Nucleic Acids Research 12，p387-395)。可用PILEUP和BLAST算法计算同源性或比对(line up)序列(例如鉴定等效残基或相应序列(通常基于其默认设置))，例如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36：290-300；Altschul，S.F等人(1990)J Mol Biol 215：403-10中所述。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。

SEQ ID NO：2是MspA单体的MS-(B1)8突变体。与MspA相比，该变体可以包含MspB、C或D单体中的任何突变。MspB、C和D的成熟形式示于SEQ ID NO：5至7中。特别地，所述变体可以包含存在于MspB：A138P中的以下取代。所述变体可以包含存在于MspC中的一个或多个下列取代：A96G，N102E和A138P。所述变体可包含存在于MspD中的一个或多个以下突变：G1，L2V，E5Q，L8V，D13G，W21A，D22E，K47T，I49H，I68V，D91G，A96Q，N102D，S103T，V104I，S136K和G141A的缺失。所述变体可以包含来自Msp B、C和D中的一个或多个突变和取代的组合。变体优选包含突变L88N。SEQ ID NO：2的变体除了MS-B1的所有突变之外还具有突变L88N，并称为MS-(B2)8。本发明中使用的孔优选为MS-(B2)8。除了MS-B1的所有突变之外，SEQ ID NO：2的变体具有突变G75S/G77S/L88N/Q126R，并称为MS-B2C。本发明中使用的孔优选为MS-(B2)8或MS-(B2C)8。

除了上文论述的那些之外，可以对SEQ ID NO：2的氨基酸序列进行氨基酸取代，例如高达1，2，3，4，5，10，20或30个取代。保守取代用具有相似化学结构、相似化学性质或相似侧链体积的其他氨基酸替换氨基酸。引入的氨基酸可以具有与它们替代的氨基酸相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。或者，保守取代可以引入另一个芳香族或脂肪族氨基酸代替之前存在的芳香族或脂肪族氨基酸。

SEQ ID NO：2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基可以另外从上述多肽中缺失。可以缺失多至1，2，3，4，5，10，20或30个残基或更多个残基。

变体可以包括SEQ ID NO：2的片段。这类片段保留成孔活性。片段的长度可以为至少50，100，150或200个氨基酸。这样的片段可以用于产生孔。片段优选包含SEQ ID NO：2的孔形成结构域。片段必须包括SEQ ID NO：2的残基88，90，91，105，118和134中的一个。通常，片段包括SEQ ID NO：2的所有残基88，90，91，105，118和134。

一个或多个氨基酸可以替代地或另外地添加到上述多肽。可以在SEQ ID NO：2或其多肽变体或其片段的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端提供延伸。延伸可以非常短，例如1至10个氨基酸长度。或者，延伸可以较长，例如高达50或100个氨基酸。载体蛋白可以与本发明的氨基酸序列融合。其它融合蛋白在下面更详细地论述。

如上所述，变体是具有下述氨基酸序列的多肽：从SEQ ID NO：2的氨基酸序列变化而来并且保留其形成孔的能力。变体通常包含负责形成孔的SEQ ID NO：2的区域。含有β桶状体的Msp的孔形成能力由每个亚基中的β片体提供。SEQ ID NO：2的变体通常包含SEQ IDNO：2中形成β片体的区域。可以对SEQ ID NO：2的形成β片体的区域进行一个或多个修饰，只要所得变体保留其形成孔的能力即可。SEQ ID NO：2的变体优选包括在其α螺旋和/或环区域内的一个或多个修饰，例如取代、添加或缺失。

衍生自Msp的单体含有一个或多个特异性修饰以便于对核苷酸的鉴别。衍生自Msp的单体也可以含有其它非特异性修饰，只要它们不干扰孔形成即可。许多非特异性侧链修饰是本领域已知的，并且可以对衍生自Msp的单体的侧链进行。这样的修饰包括例如通过与醛反应、然后用NaBH4还原而进行的氨基酸的还原性烷基化，用甲基乙酰亚胺酯(methylacetimidate)进行的脒基化，或用乙酸酐进行的酰化。

衍生自Msp的单体可以使用本领域中已知的标准方法来制备。衍生自Msp的单体可以通过合成或重组方式制成。例如，所述孔可通过体外翻译和转录(IVTT)合成。制造孔的合适的方法在国际申请No.PCT/GB09/001690(公开号为WO 2010/004273)，PCT/GB09/001679(公开号为WO 2010/004265)或PCT/GB10/000133(公开号为WO 2010/086603)中有论述。论述了将孔插入膜的方法。

跨膜蛋白孔也优选衍生自α-溶血素(α-HL)。野生型α-HL孔由七个相同的单体或亚基形成(即它是七聚体)。α-溶血素-NN的一个单体或亚基的序列显示在SEQ ID NO：4中。

在一些实施方案中，跨膜蛋白孔是经化学修饰的。所述孔可以任何方式在任何位点进行化学修饰。所述跨膜蛋白孔优选通过下述进行化学修饰：将分子连接到一个或多个半胱氨酸(半胱氨酸连接)，将分子连接到一个或多个赖氨酸，将分子连接到一个或多个非天然氨基酸，表位的酶修饰或末端的修饰。适用于进行这些修饰的方法是本领域已知的。所述跨膜蛋白孔可通过连接任何分子被化学修饰。例如，所述孔可以通过连接染料或荧光团被化学修饰。

孔中的任何数量的单体可以是化学修饰的。一个或多个，例如2，3，4，5，6，7，8，9或10个单体优选如上所述进行化学修饰。

半胱氨酸残基的反应性可以通过修饰相邻残基来增强。例如，侧翼精氨酸、组氨酸或赖氨酸残基的碱基将半胱氨酸硫醇基团的pKa变为更具反应性的S-基团的pKa。半胱氨酸残基的反应性可以用硫醇保护基团如dTNB保护。所述保护基团可以在接头连接之前与孔的一个或多个半胱氨酸残基反应。

所述分子(使用其对孔进行化学修饰)可以直接连接到所述孔或如国际申请No.PCT/GB09/001690(公开号WO 2010/004273)，PCT/GB09/001679(公开号WO 2010/004265)或PCT/GB10/000133(公开号WO 2010/086603)中所公开通过接头连接到所述孔。

本文所述的任何蛋白质，例如跨膜蛋白孔可以使用本领域已知的标准方法制备。编码孔或构建体的多核苷酸序列可以使用本领域的标准方法衍生和复制。编码孔或构建体的多核苷酸序列可以使用本领域标准技术在细菌宿主细胞中表达。孔可以通过在细胞中由重组表达载体的多肽的原位表达而制备。表达载体任选地携带诱导型启动子以控制多肽的表达。这些方法在Sambrook，J.和Russell，D.(2001).Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY中有描述。

孔可以从产生蛋白质的生物体通过任何蛋白质液相色谱系统纯化后，或在重组表达后大规模生产。典型的蛋白质液相色谱系统包括FPLC系统、AKTA系统、Bio-Cad系统、Bio-Rad BioLogic系统和Gilson HPLC系统。。

多核苷酸表征

本发明的方法包括测量目标双链多核苷酸的一个或多个特征。

可以研究任意数量的多核苷酸。例如，本发明的方法可以涉及表征2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、100个或更多个多核苷酸。

所述多核苷酸可以是天然存在的或人工的。例如，该方法可以被用于检验所制造的两个或更多个寡核苷酸的序列。该方法一般在体外进行。

该方法可以包括测量多核苷酸的两个、三个、四个或五个或更多个特征。所述一个或多个特征优选选自(i)所述多核苷酸的长度，(ii)所述多核昔酸的同一性，(iii)所述多核苷酸的序列，(iv)所述多核苷酸的二级结构，和(v)所述多核苷酸是否被修饰。根据本发明可以测量(i)至(v)的任意组合，例如{i}，{ii}，{iii}，{iv}，{v}，{i，ii}，{i，iii}，{i，iv}，{i，v}，{ii，iii}，{ii，iv}，{ii，v}，{iii，iv}，{iii，v}，{iv，v}，{i，ii，iii}，{i，ii，iv}，{i，ii，v}，{i，iii，iv}，{i，iii，v}，{i，iv，v}，{ii，iii，iv}，{ii，iii，v}，{ii，iv，v}，{iii，iv，v}，{i，ii，iii，iv}，{i，ii，iii，v}，{i，ii，iv，v}，{i，iii，iv，v}，{ii，iii，iv，v}或{i，ii，iii，iv，v}。可以测量第一多核苷酸的与第二多核苷酸相比不同的(i)到(v)的组合，包括上面所列的任意组合。

对于(i)，多核苷酸的长度例如可以通过确定所述多核昔酸和所述孔之间的相互作用次数，或所述多核苷酸与所述孔之间相互作用的持续时间来测定。

对于(ii)，对多核苷酸的鉴别可以通过多种方式进行测定。对多核苷酸的识别可以联合多核苷酸序列的测定或不联合多核苷酸序列的测定而进行测定。前者是直接测定；对所述多核苷酸进行测序，并由此进行识别。后者可以多种方式完成。例如，可以测定多核苷酸中特定模序的存在(不需要测定多核苷酸的其余序列)。替代地，在所述方法中特定电和/或光信号的测定可以鉴别来自特定来源的多核苷酸。

对于(iii)，多核苷酸的序列可以如前文所述进行测定。适合的测序方法，特别是那些使用电测量的方法，在Stoddart D等人，Proc Natl Acad Sci，12；106(19)：7702-7，Lieberman KR等人，J Am Chem Soc.2010；132(50)：17961-72，以及国际申请WO 2000/28312中有描述。

对于(iv)，二级结构可以多种方式测定。例如，如果所述方法涉及电测量，则二级结构可以利用流经孔的停留时间的变化或电流的变化进行测定。这使得能够对单链和双链多核苷酸区域进行辨别。

对于(v)，可以测定任何修饰的存在与否。所述方法优选包括确定所述多核苷酸是否通过甲基化、氧化、损伤、用一个或多个蛋白质或一个或多个标记物、标签或间隔区进行了修饰。特定的修饰将导致与孔的特定的相互作用，这可使用下述方法测定。例如，可以基于孔与每个核苷酸的相互作用过程中流经所述孔的电流，来区分甲基胞嘧啶和胞嘧啶。

所述方法可以使用适于研究膜/孔系统——其中孔存在于膜中——的任何设备进行。该方法可以使用适合于跨膜孔传感的任何设备进行。例如，所述设备包括含水溶液的腔室，以及将所述腔室分成两个区段的屏障。所述屏障典型地具有开孔，含所述孔的膜形成于所述开孔中。替代地，所述屏障形成其中存在孔的膜。

所述方法可使用国际申请No.PCT/GB08/000562(WO 2008/102120)中描述的设备进行。

所述方法可以包括测量所述多核苷酸相对于所述孔移动时穿过所述孔的电流。因此，所述设备也可以包括能够施加电位并测量穿过所述膜和孔的电信号的电路。所述方法可以使用膜片钳或电压钳进行。所述方法优选涉及使用电压钳。

本发明方法可包括，当多核苷酸相对于孔移动时，测量穿过该孔的电流。用于测量穿过跨膜蛋白孔的离子电流的适宜条件是本领域已知的并在实施例中公开。所述方法通常通过跨膜和孔施加电压来实施。使用的电压通常为+5V到-5V，例如+4V到-4V，+3V到-3V或+2V到-2V。使用的电压通常为-600mV到+600mV或-400mV到+400mV。使用的电压优选在具有以下下限和上限的范围内，所述下限选自-400mV，-300mV，-200mV，-150mV，-100mV，-50mV，-20mV和0mV，所述上限独立地选自+10mV，+20mV，+50mV，+100mV，+150mV，+200mV，+300mV和+400mV。使用的电压更优选在100mV到240mV范围内，最优选在120mV到220mV范围内。可通过对孔施加提高的电位来提高对不同核苷酸的鉴别力。

所述方法通常在任何载荷子诸如金属盐(如碱金属盐)、卤盐(如氯化物盐(如碱金属氯化物盐))的存在下实施。载荷子可包括离子液体或有机盐，例如四甲基氯化铵、三甲基苯基氯化铵、苯基三甲基氯化铵或1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓。在上述示例性设备中，所述盐以水溶液存在于室中。通常使用氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、氯化铯(CsCl)，或亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。优选KCI、NaCl，和亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。载荷子可以是跨所述膜不对称的。所述载荷子的类型和/或浓度在膜的每一侧上可以不同。

所述盐浓度可以是饱和的。所述盐浓度可以是3M或更低并且通常为0.1-2.5M，0.3-1.9M，0.5-1.8M，0.7-1.7M，0.9-1.6M或1M-1.4M。所述盐浓度优选为150mM-1M。所述方法优选使用至少0.3M，例如至少0.4M，至少0.5M，至少0.6M，至少0.8M，至少1.0M，至少1.5M，至少2.0M，至少2.5M或至少3.0M的盐浓度而实施。高的盐浓度提供高的信噪比并使得电流能在正常电流波动的背景下识别代表核苷酸存在。

所述方法通常在缓冲剂的存在下实施。在上述示例性设备中，所述缓冲剂以水溶液存在于所述室中。任何缓冲剂均可用在本发明方法中。通常，所述缓冲剂为磷酸盐缓冲液。另一个适宜的缓冲剂为HEPES和三羟甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)缓冲液。所述方法通常在4.0-12.0，4.5-10.0，5.0-9.0，5.5-8.8，6.0-8.7或7.0-8.8或7.5-8.5的pH下实施。所用pH优选约为7.5。

所述方法可在0℃-100℃、15℃-95℃、16℃-90℃、17℃-85℃、18℃-80℃、19℃-70℃或20℃-60℃实施。所述方法通常在室温实施。所述方法可选地在能支持酶功能的温度下，例如约37℃实施。

步骤(b)优选包含将在步骤a)中提供的多核苷酸与多核苷酸结合蛋白接触，使得蛋白控制所述多核昔酸的至少一条链穿过所述孔的移动。

更优选地，所述方法包括b)将在步骤a)中提供的多核苷酸与跨膜孔和多核苷酸结合蛋白接触，使得所述多核苷酸的至少一条链移动穿过所述孔，且蛋白质控制所述多核苷酸的至少一条链穿过所述孔的移动；以及c)随着所述多核苷酸的至少一条链相对于所述孔的移动，测量穿过所述孔的电流，其中所述电流代表所述多核苷酸的至少一条链的一个或多个特征，且由此表征目标双链多核苷酸。

所述多核昔酸结合蛋白可以是能够结合到多核苷酸且控制其移动穿过所述孔的任何蛋白。现有技术中可直接确定所述蛋白质是否结合到多核苷酸。所述蛋白质通常与多核苷酸相互作用并修饰多核苷酸的至少一个特性。所述蛋白质可通过裂解多核昔酸以形成各单个核苷酸或较短链的核苷酸，如二核苷酸或三核苷酸，来修饰所述多核苷酸。所述部分可以通过定向多核苷酸或移动多核昔酸到特定的位置即控制其移动来修饰该多核苷酸。

所述多核苷酸结合蛋白优选衍生自多核苷酸处理酶。所述多核苷酸处理酶是能够与多核苷酸相互作用并修饰多核苷酸的至少一个特性的多肽。所述酶可以通过裂解多核苷酸形成各单个核苷酸或较短链的核苷酸，如二核苷酸或三核苷酸，来修饰该多核苷酸。所述酶可以通过定向多核苷酸或将多核苷酸移动到特定的位置而修饰该多核苷酸。所述多核苷酸处理酶不需要显示酶活性，只要其能够结合多核苷酸并控制其移动穿过所述孔即可。例如，所述酶可被修饰以去除其酶活性或者可在防止其作为酶的条件下使用。这样的条件将在下文更详细的论述。

所述多核苷酸处理酶优选衍生自溶核酶。所使用的多核苷酸处理酶更优选衍生自酶分类(EC)组3.1.11，3.1.13，3.1.14，3.1.15，3.1.16，3.1.21，3.1.22，3.1.25，3.1.26，3.1.27，3.1.30和3.1.31中任何组的成员。所述酶可为在国际申请No.PCT/GB10/000133(公开为WO 2010/086603)中公开的任何酶。

优选的酶为聚合酶、核酸外切酶、解旋酶和拓扑异构酶，例如促旋酶。合适的酶包括，但不限于，来自大肠杆菌的核酸外切酶I(SEQ ID NO：11)、来自大肠杆菌的核酸外切酶III(SEQ ID NO：13)、来自嗜热栖热菌的RecJ(SEQ ID NO：15)，和噬菌体λ核酸外切酶(SEQIDNO：17)及其变体。包含SEQ ID NO：15或其变体所示序列的三个亚基相互作用形成三聚体核酸外切酶。所述酶优选是Phi29DNA聚合酶(SEQ ID NO：9)或其变体。拓扑异构酶优选是部分分类(EC)组5.99.1.2和5.99.1.3中的任意成员。

酶最优选衍生自解旋酶，例如Hel308Mbu(SEQ ID NO：18)，Hel308Csy(SEQ ID NO：19)，Hel308Mhu(SEQ ID NO：21)，TRAI Eco(SEQ ID NO：22)，XPD Mbu(SEQ ID NO：23)或其变体。本发明可以使用任何解旋酶。所述解旋酶可以是或者衍生自He1308解旋酶、RecD解旋酶，例如TraI解旋酶或TrwC解旋酶、XPD解旋酶或Dda解旋酶。所述解旋酶可以是国际申请No.PCT/GB2012/052579(公开号WO 2013/057495)；PCT/GB2012/053274(公开号WO 2013/098562)；PCT/GB2012/053273(公开号WO2013098561)；PCT/GB2013/051925(公开号WO2014/013260)；PCT/GB2013/051924(公开号WO 2014/013259)；PCT/GB2013/051928(公开号WO 2014/013262)；以及PCT/GB2014/052736中公开的解旋酶、经修饰的解旋酶或解旋酶构建体中的任意成员。

所述解旋酶优选包含SEQ ID NO：25(Trwc Cba)或其变体中所示序列，SEQ ID NO：18(Hel308 Mbu)或其变体中所示序列，或者SEQ ID NO：24(Dda)或其变体中所示序列。各变体可以以下文针对跨膜孔所述任意方式不同于天然序列。SEQ ID NO：24的优选变体包含E94C/A360C和之后的(ΔM1)G1G2(即M1缺失，然后添加G1和G2)或E94C/A360C/C109A/C136A和之后的(ΔM1)G1G2。

本发明可以使用任何数目的解旋酶。例如，可以使用1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个解旋酶。在一些实施方案中，可使用其他数目的解旋酶。

本发明的方法优选包括使目标双链多核苷酸与两个或更多个解旋酶接触。所述两个或更多个解旋酶通常是相同的解旋酶。所述两个或更多个解旋酶可以是不同的解旋酶。

所述两个或更多个解旋酶可以是上文提及的解旋酶的任意组合。所述两个或更多个解旋酶可以是两个或更多个Dda解旋酶。所述两个或更多个解旋酶可以是一个或多个Dda解旋酶和一个或多个TrwC解旋酶。所述两个或更多个解旋酶可以是相同解旋酶的不同变体。

所述两个或更多个解旋酶优选彼此连接。所述两个或更多个解旋酶更优选彼此共价连接。所述解旋酶可以以任何顺序使用任何方法连接。用于本发明的优选的解旋酶构建体在国际申请PCT/GB2013/051925(公开号WO 2014/013260)；PCT/GB2013/051924(公开号WO 2014/013259)；PCT/GB2013/051928(公开号WO 2014/013262)；以及PCT/GB2014/052736中有描述。__________________________________________________________________

SEQ ID NO：9，11，13，15，17，18，19，20，21，22，23，24或25的变体是具有下述氨基酸序列的酶：所述氨基酸序列从SEQ ID NO：9，11，13，15，17，18，19，20，21，22，23，24或25变化而来并保留多核昔酸结合能力。这可以使用本领域已知的任何方法测定。例如，使所述变体与多核苷酸接触，然后测量其结合到多核苷酸并沿多核苷酸移动的能力。所述变体可以包括能促进对多核苷酸的结合和/或促进其在高盐浓度和/或室温下活性的修饰。各变体可以被修饰为，使其结合多核苷酸(即保留多核苷酸结合能力)，但不具有解旋酶功能(即当提供了有助于移动的所有必要组分例如ATP和Mg²⁺时仍不能沿多核苷酸移动)。这种修饰是本领域公知的。例如，对解旋酶中Mg²⁺结合结构域的修饰通常导致不具有解旋酶功能的变体。这些类型的变体可用作分子制动器。

基于氨基酸同一性，在SEQ ID NO：9，11，13，15，17，18，19，20，21，22，23，24或25的氨基酸序列的整个长度上，变体将优选与该序列至少50％同源。更优选，基于氨基酸同一性，所述变体多肽在整个长度上可以与SEQ ID NO：9，11，13，15，17，18，19，20，21，22，23，24或25的氨基酸序列，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％且更优选至少95％，97％或99％同源。在200或更多，例如230，250，270，280，300，400，500，600，700，800，900或1000或更多个连续氨基酸片段上，可以具有至少为80％，例如至少85％，90％或95％的氨基酸同源性(“严格同源性”)。同源性可如上文所述进行确定。所述变体可以上文针对SEQ ID NO：2和4论述的任意方式不同于野生型序列。所述酶可以共价连接到孔。可使用任何方法将所述酶共价连接到孔。

优选的分子制动器是TrwC Cba-Q594A(SEQ ID NO：25，具有突变Q594A)。该变异不具有解旋酶的功能(即能结合多核苷酸，但当提供了有助于移动的所有必要组分例如ATP和Mg²⁺时仍不能沿多核苷酸移动)。

在链测序中，所述多核苷酸顺着或逆着所施加电位移位穿过所述孔。逐渐地或进行性地作用于双链多核苷酸上的核酸外切酶可用于在施加的电位下在所述孔的顺侧上使剩余的单链穿过，或者在反向电位下在所述孔的反侧上使剩余的单链穿过。同样地，解开双链DNA的解旋酶也可以类似的方式使用。也可以使用聚合酶。还有可能有这样的测序应用：其需要使链逆着施加电位移位，但是DNA必须在反向电位或没有电位的情况下首先被所述酶“捕获”。然后随着在结合之后电位被翻转，所述链将从顺侧到反侧而穿过所述孔并通过电流保持延伸的构造。单链DNA核酸外切酶或单链DNA依赖性聚合酶可用作分子马达，用于以受控且逐步的方式将最近移位的单链逆着施加的电位从反侧到顺侧穿过所述孔而拉回。

解旋酶(一个或多个)和分子制动器(一个或多个)

在优选的实施方案中，本发明提供一种控制双链多核昔酸穿过跨膜孔移动的方法，包括：

(a)提供在一端具有Y适配体和在另一端具有发夹环适配体的双链多核苷酸，其中所述Y适配体包括一个或多个解旋酶和用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚，其中所述发夹环适配体包括一个或多个分子制动器和用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚，且其中将所述发夹环适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大；

(b)将在步骤a)中提供的目标多核苷酸与所述孔接触；和

(c)跨所述孔施加电势，使得所述一个或多个解旋酶和所述一个或多个分子制动器聚集到一起，且二者一起控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。

这类方法在国际申请PCT/GB2014/052737中有详细论述。

所述一个或多个分子制动器优选为一个或多个多核苷酸结合蛋白。所述多核苷酸结合蛋白可以是能够结合到所述多核苷酸并控制其穿过所述孔的移动的任何蛋白。在本领域中可以直接确定蛋白质是否结合到多核苷酸。所述蛋白通常与多核苷酸相互作用且修饰所述多核苷酸的至少一个特性。该蛋白可通过使多核苷酸裂解形成各单个核苷酸或短链核苷酸，例如二核苷酸或三核苷酸，而修饰所述多核苷酸。所述部分可以通过将多核苷酸定向或移动到特定位置，即控制其移动，而修饰所述多核苷酸。

所述多核苷酸结合蛋白优选衍生自多核苷酸处理酶。所述一个或多个分子制动器可衍生自上面论述的任何多核苷酸处理酶。充当分子制动器的phi29聚合酶的经修饰的变体(SEQ ID NO：8)在美国专利No.5576204中公开。所述一个或多个分子制动器优选衍生自解旋酶。

Y适配体中的间隔区

如在国际申请No.PCT/GB2014/050175(公开为WO 2014/135838)中所论述的，连接到Y适配体的所述一个或多个解旋酶可以在一个或多个间隔区处停滞。在该国际申请中公开的一个或多个解旋酶和一个或多个间隔区的任何结构可以在本发明中使用。

RTC测序

在优选的实施方案中，步骤b)包括，将在步骤a)中提供的多核苷酸与跨膜孔接触，使得所述多核苷酸的两条链移动穿过所述孔，且步骤c)包括，随着所述多核昔酸的两条链相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值表示所述多核昔酸链的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸。上面论述的任何实施方式也同样适用于本实施方式。

解耦合

本发明的方法可以包括表征多个目标双链多核苷酸和将第一目标双链多核昔酸解耦合。

在优选的实施方案中，本发明涉及表征两个或更多个目标双链多核苷酸。所述方法优选包括：

(a)在第一样品中提供第一目标双链多核苷酸，其一端具有第一Y适配体且另一端具有第一发夹环适配体，其中所述第一Y适配体包含用于将所述多核苷酸耦合至膜的一个或多个第一锚，其中所述第一发夹环适配体包含用于将所述多核苷酸耦合至所述膜的一个或多个第二锚，并且其中所述第一发夹环适配体耦合到所述膜的强度大于所述第一Y适配体耦合到所述膜的强度；

(b)在第二样品中提供第二目标双链多核苷酸，其一端具有第二Y适配体且另一端具有第二发夹环适配体，其中所述第二Y适配体包含用于将所述多核苷酸耦合至膜的一个或多个第三锚，其中所述第二发夹环适配体包含用于将所述多核苷酸耦合至所述膜的一个或多个第四锚，并且其中所述第二发夹环适配体耦合到所述膜的强度大于所述第二Y适配体耦合到所述膜的强度；

(c)将步骤a)中提供的所述第一多核苷酸耦合到膜；

(d)将步骤(c)中耦合的所述第一多核苷酸与跨膜孔接触，使得所述第一多核苷酸的至少一条链移动穿过所述孔；

(e)随着所述第一多核苷酸的至少一条链相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值表示所述第一多核苷酸的至少一条链的一个或多个特征，且由此表征所述第一多核苷酸；

(f)将所述第一多核苷酸从所述膜解耦合；

(g)将在步骤(b)中提供的所述第二多核苷酸耦合到所述膜；

(h)将步骤(g)中耦合的所述第二多核苷酸与跨膜孔接触，使得所述第二多核苷酸的至少一条链移动穿过所述孔；和

(i)随着所述第二多核苷酸的至少一条链相对于所述孔的移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值表示所述第二多核苷酸的至少一条链的一个或多个特征，并由此表征所述第一多核苷酸。

这类方法在英国申请1406155.0中和与本申请同时申请的国际申请(ONT IP 055)中有详细论述。其中论述的任何实施方式均适用于本方法。

步骤(f)(即第一多核苷酸的解耦合)可以在步骤(g)之前(即在将所述第二多核苷酸耦合到膜之前)进行。步骤(g)可以在步骤(f)之前进行。如果所述第二多核苷酸在所述第一多核苷酸解耦合之前被耦合到所述膜，则步骤(f)优选包括选择性地将所述第一多核苷酸从所述膜解耦合(即将所述第一多核苷酸从所述膜解耦合，而不是将所述第二多核苷酸从所述膜解耦合)。本领域技术人员可以设计能实现选择性解耦合的系统。步骤(f)和步骤(g)可以同时进行。这在下面更详细地论述。

去除或洗涤

尽管在步骤(f)中所述第一多核苷酸从所述膜解耦合，但是不需要将所述第一多核苷酸去除或洗去。如果所述第二多核苷酸可以容易地与所述第一多核苷酸区分开，则没有必要去除所述第一多核昔酸。

步骤(f)和步骤(g)之间，所述方法优选进一步包括从所述膜去除至少一些所述第一样品。至少10％的所述第一样品可以被去除，例如至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％的所述第一样品可以被去除。

所述方法更优选进一步包括，从所述膜去除所有的第一样品。这可以用任何方式来完成。例如，可以在所述第一多核苷酸已经解耦合之后，用缓冲液洗涤所述膜。合适的缓冲液在下面论述。

经修饰的目标双链多核苷酸

在步骤a)之前，可以在使用目标双链多核苷酸作为模板使所述聚合酶形成经修饰的目标双链多核苷酸的条件下，将目标双链多核苷酸与聚合酶和一组游离核昔酸接触，其中当形成经修饰的多核苷酸时，所述聚合酶用不同的核苷酸物质来代替所述目标多核昔酸中的一个或多个核苷酸物质。然后，所述经修饰的目标双链多核苷酸可以像在步骤a)中一样进行提供。这种类型的修饰在国际申请No.PCT/GB2015/050483中有描述。可以使用任何上述的聚合酶。所述聚合酶优选为Klenow或9o North。

在聚合酶使用该模板多核苷酸作为模板形成经修饰的多核苷酸的条件下，使模板多核苷酸与聚合酶接触。这种条件在本领域中是已知的。例如，多核苷酸通常与可商购的聚合酶缓冲液中的聚合酶接触，例如来自New England的缓冲液。对于Klenow，温度优选为20至37℃，或者，对于9o North，温度优选为60至75℃。引物或3′发夹通常用作聚合酶延伸时的成核点。

使用跨膜孔对多核苷酸的表征，如测序，通常包括，分析由k个核苷酸组成的聚合物单元(即‘k聚体’)，其中k是正整数。这在国际申请No.PCT/GB2012/052343(公开为WO2013/041878)中有论述。虽然期望在不同k聚体的电流测量值之间具有清楚的分离，但是通常这些测量中的一些存在重叠。特别是k聚体中具有很高数量的聚合物单元时，即具有非常高的k值时，变得难以分辨由不同的k聚体产生的用于确定关于多核苷酸的导出信息的测量值，所述导出信息例如对多核苷酸基本序列(underlying sequence)的估计。

通过用经修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物质代替目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸物质，所述经修饰的多核苷酸含有的k聚体不同于所述目标多核苷酸中的k聚体。所述经修饰的多核苷酸中的不同k聚体能够产生与来自所述目标多核苷酸中的k聚体不同的电流测量值，所以所述经修饰的多核苷酸提供了与所述目标多核苷酸不同的信息。来自所述经修饰的多核苷酸的额外信息使得可以更容易表征所述目标多核苷酸。在一些情况下，所述经修饰的多核苷酸其自身可以更容易表征。例如，所述经修饰的多核苷酸可以被设计为包括，电流测量值之间具有增强的分离或清楚的分离的k聚体，或具有降低的噪声的k聚体。

其他表征方法

在另一个实施方案中，所述多核苷酸通过检测当聚合酶将核苷酸结合到多核苷酸中时所释放的标记物质进行表征。所述聚合酶使用所述多核苷酸为目标。每个标记物质对于每个核苷酸具有特异性。在步骤a)中，目标双链多核苷酸如以上所述而提供。在步骤b)中，将步骤a)中提供的多核苷酸与所述跨膜孔、聚合酶和标记的核苷酸接触，使得当核苷酸通过聚合酶被添加到多核苷酸时，磷酸盐标记的物质被依次释放，其中所述磷酸盐物质含有对每个核苷酸具有特异性的标记。所述聚合酶可以是任何上述论述的聚合酶。在步骤c)中，使用所述孔检测磷酸盐标记的物质，并由此表征所述目标双链多核苷酸。步骤b)和c)在欧洲专利申请No.13187149.3(公开为EP 2682460)中公开。上面论述的任何实施例同样适用于本方法。

本发明的修饰方法

本发明还提供了制备在表征方法的步骤a)中提供的经修饰的目标多核昔酸的方法。

本发明提供了用于修饰目标双链多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征的方法。所述方法包括，将Y适配体接合到所述多核苷酸的一端，并将发夹环适配体接合到所述多核苷酸的另一端。如上所述，所述Y适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚，所述发夹环适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚，且将所述发夹环适配体耦合到膜的强度比将所述Y适配体耦合到膜的强度大。

本发明提供了另一种替代方法，其中在所述适配体已接合到目标双链多核苷酸后，将所述锚连接到所述适配体。所述方法包括，将Y适配体接合到所述多核苷酸的一端，且将发夹环适配体接合到所述多核苷酸的另一端。然后将一个或多个第一锚连接到所述Y适配体，且将一个或多个第二锚连接到所述发夹环适配体。如上所述，发夹环适配体耦合到膜的强度比Y适配体耦合到膜的强度大。所述的一个或多个锚可以任何方式连接到适配体，包括上文所述的那些方式。所述的一个或多个锚优选通过杂交连接到所述适配体。

可以使用任何接合方法。合适的方法在上文已公开。

Y适配体和发夹环适配体可以是任何上述论述的那些。

基于MuA的方法

本发明还提供了用于修饰目标双链多核昔酸以使用膜中的跨膜孔进行表征的方法，包括将所述目标多核苷酸与MuA转座酶和一组双链MuA底物接触，其中所述组中底物的一部分是Y适配体，所述Y适配体包括将所述多核苷酸耦合到膜的一个或多个第一锚，其中所述组中底物的一部分是发夹环适配体，所述发夹环适配体包括将所述多核苷酸连接到所述膜的一个或多个第二锚，且其中所述发夹环适配体耦合到所述膜的强度比所述Y适配体耦合到所述膜的强度大，且由此产生多个经修饰的双链多核苷酸。

本发明提供了另一种替代方法，其中在目标双链多核苷酸已被MuA转座酶片段化且所述底物已被接合到所述片段之后，所述锚被连接到所述底物。所述方法包括将所述目标多核苷酸与MuA转座酶和一组双链MuA底物接触，其中所述组中底物的一部分为Y适配体且其中所述组中底物的一部分是发夹环适配体。所述转座酶将目标多核苷酸片段化且将底物接合到该双链片段的一端或两端，并由此产生多个片段/底物构建体。转座酶优选将目标多核苷酸片段化且将底物接合到该双链片段的两端，并由此产生多个片段/底物构建体。转座酶优选产生多个片段/底物构建体，其各自包括位于一端的Y适配体和位于另一端的发夹环适配体。所述方法还包括向多个片段/底物构建体中的Y适配体连接一个或多个第一锚，和向多个片段/底物构建体中的发夹环适配体连接一个或多个第二锚，并由此产生多个经修饰的双链多核苷酸。每个发夹环适配体耦合到膜的强度比每个Y适配体耦合到膜的强度大。

所述Y适配体和发夹环适配体可以是任何上述论述的那些。

基于MuA使目标双链多核苷酸片段化在国际申请No.PCT/GB2014/052505(公开为WO2015/022544)中公开。

所述目标多核苷酸与MuA转座酶接触。这种接触发生在下述条件下：使转座酶能够发挥功能，即将目标多核苷酸片段化且将MuA底物接合到所述片段的一端或两端。MuA转座酶是可商购的，例如从Thermo Scientific商购(目录号F-750℃，20μL(1.1μg/μL))。MuA转座酶起作用的条件在本领域中是已知的。

使所述目标多核昔酸与一组双链MuA底物接触。所述双链底物是多核昔酸底物且可以由任何上文论述的核苷酸、多核苷酸或核酸形成。

每个底物通常包括，能提供其作为MuA转座酶的底物的活性的双链部分。所述双链部分通常在每个底物中都是相同的。底物组可以包括不同的双链部分。每个底物优选包含双链部分，所述双链部分包含SEQ ID NO：26中示出的序列，所述序列杂交到与SEQ ID NO：26中示出的序列互补的序列。至少一个突出端优选位于与SEQ ID NO：26中所示的序列互补的序列的5′端。

在一个优选的实施方案中，底物组中的每个底物包括通用核苷酸的至少一个突出端，使得所述转座酶将所述目标多核苷酸片段化且将底物接合到该双链片段的一端或两端，优选两端，且由此产生多个片段/底物构建体，且其中所述方法进一步包括将所述突出端接合到所述构建体中的片段并由此产生多个经修饰的双链多核昔酸。转座酶优选产生多个片段/底物构建体，其中每一个包括在一端的Y适配体和在另一端的发夹环适配体。

每个底物优选包括仅一个突出端。所述仅一个突出端是优选位于所述双链部分中的一条链的5′端。

所述突出端可以是至少3个，至少4个，至少5个，至少6个或至少7个核苷酸长度。所述突出端优选为5个核苷酸长度。

通用核苷酸是以某种程度杂交到目标多核昔酸中的所有核苷酸的核苷酸。合适的通用核苷酸在国际申请No.PCT/GB2014/052505(公开为WO 2015/022544)中描述。

通用核苷酸的突出端(一个或多个)可以进一步包括反应性基团，其优选位于5′端。所述反应性基团可用于将所述突出端接合到构建体中的片段，如下所述。所述反应性基团可以使用点击化学(click chemistry)将所述片段接合到所述突出端。合适的反应性基团在国际申请No.PCT/GB2014/052505(公开为WO 2015/022544)中公开。

在进一步的实施方案中，所述修饰方法使用MuA转座酶和一组MuA底物，其各自包括具有反应性基团的至少一个突出端。所述突出端(一个或多个)可以是任何长度并且可以包括任意个核苷酸(一个或多个)的任何组合。合适的长度和核苷酸在上面有公开。合适的反应性基团在上文有描述。

在另一个实施方案中，所述方法包括将目标多核苷酸与一组双链MuA底物接触，其各自包含(i)至少一个突出端，和(ii)与所述至少一个突出端在相同的链中的至少一个核苷酸，其包括在目标多核苷酸中不存在的核苷，以使得所述转座酶将所述目标多核苷酸片段化且将底物接合到该双链片段的一端或两端，且由此产生多个片段/底物构建体。本领域技术人员可以如国际申请No.PCT/GB2014/052505(公开为WO 2015/022544)中所述来识别所述目标多核苷酸中不存在的核苷酸。转座酶优选将目标多核苷酸片段化且将底物接合到该双链片段的两端，并由此产生多个片段/底物构建体。所述转座酶优选产生多个片段/底物构建体，其各自包括在一端的Y适配体和在另一端的发夹环适配体。所述突出端可以从所述构建体通过选择性地去除所述至少一个核苷酸而去除，以产生包括单链空位(gap)的多个双链构建体。构建体中的单链空位可以被修复以产生多个经修饰的双链多核苷酸。

双链部分的一条链优选包含SEQ ID NO：26中所示的序列，且所述双链部分的另一条链优选包含这样的序列：其与SEQ ID NO：26中所示的序列互补，且其被修饰为，包括至少一个在目标多核苷酸中不存在的核苷酸。这种“另一条链”还包括突出端。在一个更优选的实施方案中，所述双链部分的一条链包含SEQ ID NO：26中示出的序列，且所述双链部分的另一条链包含SEQ ID NO：27中示出的序列(见下文)。在SEQ ID NO：27中，dC中的dA和在3′端的dA二核苷酸已经被dU取代。当目标多核昔酸包含脱氧腺苷(dA)，胸苷(dT)，脱氧鸟昔(dG)和脱氧胞苷(dC)而不包含脱氧尿苷(dU)时，可以使用该双链部分(如下所示)。

5’-GTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCTTTCGCGTTTTTCGTGCGCCGCTTCA-3’(SEQ 26)

3’-CAAAAGCGTAAATAGCACTTTGCGAAAGCGCAAAAAGCACGCGGCGAAGU-5’(SEQ>

在最优选的实施方案中，所述底物中的一条链包含SEQ ID NO：26中示出的序列，所述底物中的另一条链包含SEQ ID NO：28中所示的序列(见下文)。当目标多核苷酸包含脱氧腺苷(dA)，胸苷(dT)，脱氧鸟苷(dG)和脱氧胞苷(dC)而不包含脱氧尿苷(dU)时，可以使用该底物(下文示出)。

5’-GTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCTTTCGCGTTTTTCGTGCGCCGCTTCA-3’(SEQ 26)

3’-CAAAAGCGTAAATAGCACTTTGCGAAAGCGCAAAAAGCACGCGGCGAAGUCTA>

在所有上述实施方式中，一种类型的底物的比例可以是任意比例，例如至少约5％，至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％或至少约95％。底物组中底物的剩余比例通常是另一类型的底物的。例如，所述组可以包括40％的包含发夹环的底物和包括约60％的Y底物。这两种类型的底物的比例优选约为50％。

用于将所述突出端接合到所述片段、将核苷酸(一个或多个)——其包含在目标多核苷酸中不存在的核苷酸——选择性地从接合的构建体中去除，和用于修复在双链构建体中的单链空位的方法在国际申请No.PCT/GB2014/052505(公开为WO2015/022544)中公开。

本发明的产品

本发明还提供使用本发明的方法修饰的目标双链多核苷酸。经修饰的多核苷酸包括连接在多核苷酸一端的Y适配体和连接在另一端的发夹环适配体，其中所述Y适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到膜的一个或多个第一锚，其中所述发夹环适配体包括用于将多核苷酸连接到膜的一个或多个第二膜，并且其中所述发夹环适配体耦合到所述膜的强度比所述Y适配体耦合到所述膜的强度大，且由此提供经修饰的目标双链多核苷酸。

本发明还提供使用本发明的基于MuA的方法修饰的多个多核苷酸。这些经修饰的多核苷酸优选包括连接在一端的Y适配体和连接在另一端的发夹环适配体，其中所述Y适配体包括用于将多核苷酸耦合到膜的一个或多个第一锚，其中所述发夹环适配体包括用于将多核苷酸耦合到膜的一个或多个第二锚，且其中所述发夹环适配体耦合到膜的强度比所述Y适配体耦合到膜的强度大，且由此提供经修饰的目标双链多核苷酸。一些多核苷酸可以如上所述在两端具有Y适配体或如上所述在两端具有发夹环适配体。

本发明还提供了一对适配体，用于修饰目标双链多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征，其中，一个适配体是Y适配体，该Y适配体包括用于将多核苷酸耦合到隔膜的一个或多个第一锚，其中另一个适配体是发夹环适配体，该夹环适配体包括用于将多核苷酸耦合到膜的一个或多个第二锚，并且其中发夹环适配体耦合到膜的强度比Y适配体耦合到膜的强度大。

本发明还提供了适配体组，用于修饰目标多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征，其中一部分适配体是Y适配体，其包含用于将多核苷酸耦合到膜的一个或多个第一锚，其中一部分适配体是发夹环适配体，其包含将多核苷酸耦合到膜的一个或多个第二锚，且其中所述发夹环适配体耦合到所述膜的强度比所述Y适配体耦合到所述膜的强度大。

本发明适配体对或组中的每个适配体优选包括双链MuA底物。所述底物可以是任何上文描述的底物。所述底物优选包含如上文所述的双链部分。所述双链部分优选包括如上所述的SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27。所述双链部分更优选包括如上所述的SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28。

上文本发明方法中给出的比例值同样适用于本发明的所述组。

上文参照本发明的方法所述的任何实施方式同样适用于本发明的多核苷酸、对和组。

所述组或多个可以被分离、基本上分离、纯化或基本上纯化。组或多个可以被分离或纯化，如果它完全不含任何其它组分，例如目标多核苷酸、脂质或孔。组或多个被基本上分离，如果它与不干扰其预期用途的载体或稀释剂混合。例如，组或多个被基本上分离或基本上纯化，如果它以包含小于10％，小于5％，小于2％或小于1％的其它组分如脂质或孔的形式存在。

试剂盒

本发明还提供了修饰目标多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包括(a)本发明的一对适配体或本发明的一组适配体，和(b)MuA转座酶。所述对或组中的每个适配体优选包括双链MuA底物。

上文参照本发明的方法和产品所述的任何实施方式同样适用于所述试剂盒。

所述试剂盒可以进一步包括膜的组件，如两亲性层或三嵌段共聚物膜的组件。所述试剂盒可以进一步包括跨膜孔或跨膜孔的组件。所述试剂盒可以进一步包括多核苷酸结合蛋白。合适的膜、孔和多核苷酸结合蛋白质在上文已述。

本发明的试剂盒可以额外包括一个或多个能实施上述任何实施方案的其它试剂或仪器。这类试剂或仪器包括以下中的一个或多个：合适的缓冲液(水性溶液)，从受试者获得样品的工具(例如包含针的容器或仪器)，扩增和/或表达多核苷酸的工具，上文定义的膜，或电压或膜片钳装置。试剂可以干燥状态存在于试剂盒中，使得流体样品能重悬所述试剂。所述试剂盒还可以任选地包括能使试剂盒用于本发明方法的介绍，或关于本发明方法可用于哪种患者的详细说明。所述试剂盒可以可选地包括核苷酸。

下列实施例用于说明本发明。

实施例1

本实施例描述了在图1和图2中示出的且在实施例2和3中使用的DNA构建体1-6的样品制备过程。

材料和方法

在这项研究中使用的链来自λ基因组的45042bp和48487bp之间的区域。分析物通过聚合酶PCR法制备以按需要在模板和互补模板中每一个的限定端包括杂交位点。PCR从λ基因组DNA实施。

本模板(SEQ ID NO：29，杂交到SEQ ID NO：30)使用KAPA HiFi 2x主混合物、λDNA(NEB)和引物SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32制备。使反应循环20次，将正确尺寸的产品通过在Sephacryl S1000柱上凝胶过滤而纯化，并使用Millipore Ultracel 1550kDa浓缩器浓缩至0.25mg/ml。

用于电生理学实验的DNA构建体(1，2，3，4，5和6)均是根据相同的反应混合物制备：2×LongAmp Taq主混合物，300nM的引物1和2或3和4(在图1和图2中标记为a1的链使用引物1和引物2制备，其中引物1＝SEQ ID NO：33，其3′端连接到4个iSpC3间隔区，所述间隔区在相对端连接到SEQ ID NO：34的5′端，SEQ ID NO：34的3′端连接到4个iSpC3间隔区，所述间隔区连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚在相对端连接到SEQ ID NO：36的5′端，引物2＝SEQ ID NO：37，其3′端连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚在相对端连接到SEQ ID NO：38的5′端；图1和图2中标记为a2的链使用引物3和引物4制备，其中引物3＝SEQ ID NO：33，其3′端连接到4个iSpC3间隔区，所述间隔区在相对端连接到SEQ ID NO：37的5′端，SEQ IDNO：37的3′端连接到4个iSpC3间隔区，所述间隔区连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚在相对端连接到SEQ ID NO：38的5′端，引物4＝SEQ ID NO：34，其3′端连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚在相对端连接到SEQ ID NO：36的5′端)和1.2ng ul^-1>12和65℃5分钟。DNA构建体全部根据制造商的说明(Qiagen凝胶提取试剂盒)从0.8％琼脂糖凝胶中纯化，然后根据制造商的说明进行SPRI纯化(AgencourtAMPure小珠)。

最后，所产生的DNA链被杂交到DNA的互补链，其中一些含有锚例如胆固醇或棕榈酸酯。将互补链SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40(与锚连接和不与锚连接)在25mM磷酸钾缓冲液、151mM氯化钾、pH 8.0中在超过室温5倍的温度下退火十分钟。

如1(A)中所示，DNA构建体1是由4个不同链杂交在一起构成的——a1＝SEQ IDNO：33，其3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到SEQ ID NO：34的5′端；SEQ ID NO：34在3′端连接到4个iSpC3间隔区的3′端，该iSpC3间隔区在相对端连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚连接到SEQ ID NO：35的5′端，a3＝SEQ ID NO：40，其3′端连接到6个iSp18间隔区，该iSp18间隔区的相对端连接到2个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶的相对端连接到3′胆固醇TEG，a4＝SEQ ID NO：39，a5＝与a3互补且与a1的一部分互补的序列。

如图1(A)和(B)中所示，DNA构建体2是由4个不同链杂交在一起构成的——a2＝SEQ ID NO：33，其3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区相对端连接到SEQ ID NO：37的5′端；SEQ ID NO：37的3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区相对端连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚连接到SEQ ID NO：41的5′端，a6＝SEQ ID NO：39，其3′端连接到6个iSp18间隔区，iSp18间隔区在相对端连接到2个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶相对端连接到3′胆固醇TEG，a7＝SEQ ID NO：40，a8＝与a6互补且与a2的一部分互补的序列。

如图1(B)和2(B)中所示，DNA构建体3是由4个不同链杂交在一起构成的——a1＝SEQ ID NO：33，其3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到SEQ ID NO：34的5′端；SEQ ID NO：34的3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区的相对端连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚连接到SEQ ID NO：35的5′端，a3＝SEQ ID NO：40，其3′端连接到6个iSp18间隔区，iSp18间隔区在相对端连接到2个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶相对端连接到3′胆固醇TEG，a9＝SEQ ID NO：39，其3′端连接到6个iSp18间隔区，iSp18间隔区相对端连接到2个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶相对端连接到3′棕榈酸酯，a5＝与a3互补且与a1的一部分互补的序列。

如图2(A)中所示，DNA构建体4是由4个不同链杂交在一起构成的——a1＝SEQ IDNO：33，其3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到SEQ ID NO：34的5′端；SEQ ID NO：34的3′连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区相对端连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚连接到SEQ ID NO：35的5′端，a3＝SEQ ID NO：40，其3′端连接有6个iSp18间隔区，iSp18间隔区在相对端连接到2个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶相对端连接到3′胆固醇TEG，a6＝SEQID NO：39，其3′端连接到6个iSp18间隔区，iSp18间隔区相对端连接到2个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶相对端连接到3′胆固醇TEG，a5＝与a3互补且与a1的一部分互补的序列。

如图2(A)中所示，DNA构建体5是由4个不同链杂交在一起构成的——a1＝SEQ IDNO：33，其3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到SEQ ID NO：34的5′端；SEQ ID NO：34在3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚连接到SEQ ID NO：35的5′端，a3＝SEQ ID NO：40，其3′端连接到6个iSp18间隔区，iSp18间隔区在相对端连接到2个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶在相对端连接到3′胆固醇TEG，a2＝SEQ ID NO：33，其3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到SEQ IDNO：37的5′端；SEQ ID NO：37在3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚连接到SEQ ID NO：41的5′端，a6＝SEQ ID NO：39，其3′端连接到6个iSp18间隔区，iSp18间隔区在相对端连接到2个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶在相对端连接到3′胆固醇TEG。

如图2(B)中所示，DNA构建体6是由4个不同链杂交在一起构成的——a1＝SEQ IDNO：33，其3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到SEQ ID NO：34的5′端；SEQ ID NO：34在3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚连接到SEQ ID NO：35的5′端，a10＝SEQ ID NO：40，其3′端连接到6个iSp18间隔区，iSp18间隔区在相对端连接到2个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶在相对端连接到3′棕榈酸酯，a2＝SEQ ID NO：33，其3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到SEQ IDNO：37的5′端；SEQ ID NO：37在3′端连接到4个iSpC3间隔区，SpC3间隔区在相对端连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚连接到SEQ ID NO：41的5′端，a9＝SEQ ID NO：39，其3′端连接到6个iSp18间隔区，iSp18间隔区在相对端连接到2个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶在相对端连接到3’胆固醇TEG。

实施例2

本实施例将使用单个锚将构建体耦合到膜和使用不同强度的两个锚将构建体耦合到膜进行比较。为了使解旋酶控制的DNA(通过纳米孔系统检测)移动偏向双耦合到膜的构建体，使用了两个锚。

材料和方法

在设置实验之前，将DNA构建体1和2或构建体2和3(原料浓度为20nM，加入到纳米孔系统中的最终浓度0.1nM)分别用在缓冲液(151mM KCl，25mM磷酸，2mM EDTA，pH8.0)中的T4 Dda-E94C/A360C(原料浓度250nM，加入到纳米孔系统中的最终浓度1nM，具有突变E94C/A360C的SEQ ID NO：24)在室温下预培育5分钟。五分钟后，将TMAD(500μM)加入到预混合物中且再培育混合物5分钟。最后，将MgCl2(10mM最终浓度)，ATP(2.5mM最终浓度)和缓冲液(150mM的亚铁氰化钾(II)，150mM铁氰化钾和25mM磷酸钾pH 8.0)加入到预混合物中。

从在缓冲液(25mM磷酸钾，150mM亚铁氰化钾(II)，150mM铁氰化钾(III)，pH 8.0)中插入嵌段共聚物中的单个MspA纳米孔(MspA-B2C)获得电测量值。在实现将单个孔插入嵌段共聚物中之后，使缓冲液(2mL，25mM磷酸钾pH 8.0，150mM的亚铁氰化钾(II)和150mM铁氰化钾(III))流经系统以去除任何多余的MspA纳米孔。然后将酶(T4 Dda-E94C/A360C，1nM的最终浓度)、DNA构建体1和2或2和3中(0.1nM的最终浓度)、燃料(MgCl2 10mM最终浓度，ATP2.5mM最终浓度)的预混合物(总计150μL)加入到单个纳米孔实验系统，并在120mV的保持电势下进行实验2小时，且监测解旋酶控制的DNA移动。

结果与讨论

对于对照实验，监测构建体1和构建体2的解旋酶控制的DNA移动。图3上部的卡通显示，其中解旋酶可以结合到构建体1和构建体2。对应于每个构建体的解旋酶控制的DNA移动被识别，且将对应于链a1(构建体1)和链a2(构建体2)的移动的比例进行比较(见图3的下半部分)。当使用相同的锚(胆固醇锚)将每个构建体耦合到膜，然后观察解旋酶控制的DNA移动时，大约50％对应于链a1和50％对应于链a2。这表明，使用相同的单个锚时，不存在相比于一个构建体，偏向于另一个构建体的解旋酶控制的移位运动。

实验还对使用单个锚(胆固醇)将构建体2耦合到膜与使用两个不同的锚(不同强度——胆固醇和棕榈酸酯)将构建体3耦合到所述膜进行了比较。图4上部的卡通表明了其中解旋酶可以结合到链a1(构建体3)和链a2(构建体2)。识别对应于每个构建体的解旋酶控制的DNA的移动，并将对应于a1和a2(分别为构建体3和构建体2)的移动的比例进行了比较(参见图4的下半部分)。在这种情况下，检测到，多于95％的解旋酶控制的DNA移动对应于使用胆固醇和棕榈酸酯耦合到膜的链a1(构建体3)。小于5％的解旋酶控制的DNA移动对应于链a2(构建体2)。该实验表明，由纳米孔系统检测到，使用两个不同的锚时，与单一耦合的构建体相比，解旋酶控制的DNA移动强烈的偏向双重耦合的构建体。

实施例3

本实施例比较了使用相等强度的两个锚(双胆固醇构建体4和构建体5或双棕榈酸酯构建体6)与使用不同强度的两个锚(棕榈酸酯和胆固醇构建体3)。

材料和方法

将DNA构建体4和5或构建体3和6如上文实施例2中所述使用T4 Dda-E94C/A360C解旋酶预培育。

如实施例2中所述从在缓冲液中插入嵌段共聚物中的单个MspA纳米孔(MspA-B2C)，获得电测量值，并监测对于构建体4和构5或构建体3和6的解旋酶控制的DNA移动。

结果与讨论

对于对照实验，监测构建体4和构建体5的解旋酶控制DNA的移动。图5上部的卡通显示，其中解旋酶可以结合到构建体4(仅在a1上)和构建体5(在a1和a2上)。构建体4的链a1能够被纳米孔捕获，而构建体5的链a1或链a2能够被纳米孔捕获。对应于每个构建体的解旋酶控制的DNA移动被识别，且将对应于链a1(构建体4和5)和链a2(仅构建体5)的移动的比例进行比较(见图5的下半部分)。当使用相同的锚(两个胆固醇锚)将每个构建体耦合到膜，然后观察解旋酶控制的DNA移动时，大约66％对应于链a1(构建体4和5)，33％对应于链a2(仅构建体5)。可以预期到，2∶1偏向于对a1解旋酶控制的DNA移动的检测，因为a2移动仅在构建体4被纳米孔捕获时被检测到，而a1移动能从构建体4和构建体5的捕获中被检测到，因此，可以预期到两倍的a1移动(在当量浓度的构建体4和5被加入到纳米孔实验系统中时)。

该实验还比较了使用不同强度的两种耦合剂(胆固醇和棕榈酸酯)将构建体3耦合到膜上，与使用两种相同的耦合剂(均为棕榈酸酯)将构建体6耦合到膜上。图6上部的卡通表明，其中解旋酶可以结合到链a1(构建体3和6)和链a2(仅构建体6)。构建体3的链a1能够被纳米孔捕获，而构建体6的链a1或a2能够被纳米孔捕获。对应于每个构建体的解旋酶控制的DNA移动被识别，且将对应于链a1(构建体2和3)和链a2(仅构建体2)的移动的比例进行比较(见图6的下半部分)。在这种情况下检测到，多于95％的解旋酶控制的DNA移动对应于使用胆固醇和棕榈酸酯或两个棕榈酸酯耦合到所述膜的链a1(构建体3和6)。小于5％的解旋酶控制的DNA移动对应于链a2(仅构建体6)。该实验说明，可以由纳米孔系统检测到，通过使用两种不同的耦合剂，有可能使解旋酶控制的DNA移动强烈偏向由不同强度的耦合剂耦合的构建体而不是由相同强度的两种相同耦合剂耦合的构建体。这也表明，在仅一端被纳米孔捕获的构建体上使用较强和较弱锚的组合时，可能偏向于该构建体，而不是偏向于在两端被纳米孔捕获的构建体上具有两个较弱锚的构建体。

实施例4

本实施例说明了如何比较大量耦合剂的相对强度。这使得能选择合适强度的耦合剂将构建体耦合到膜上。

材料和方法

使用实施例1中所述的方法制备DNA构建体1、构建体2和构建体7(a-c)。构建体1和构建体2在上文有详细描述，构建体7(a-c)在下文进行描述。

如图7(B)中所示，DNA构建体7a是由4个不同链杂交在一起构成的——a2＝SEQ IDNO：33，其3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到SEQ ID NO：37的5′端；SEQ ID NO：37在3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚连接到SEQ ID NO：41的5′端，a10(a)＝SEQ ID NO：42，其5′端连接到6个iSp18间隔区，iSp18间隔区在相对端连接到2个胸腺嘧啶和5′胆固醇TEG，SEQ ID NO：42具有连接到其3′端的另外6个iSp18间隔区，iSp18间隔区在相对端连接到2个胸腺嘧啶和3′胆固醇TEG，a7＝SEQ ID NO：40，a8＝与a2的一部分和A10a互补的序列。

如图7(B)中所示，DNA构建体7b是由4个不同链杂交在一起构成的——a2＝SEQ IDNO：33，其3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到SEQ ID NO：37的5′端；SEQ ID NO：37在3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区在相对端连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚连接到SEQ ID NO：41的5′端，a10(b)＝SEQ ID NO：39，其3′端连接到6个iSp18间隔区，iSp18间隔区相对端连接到2个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶相对端连接到3′生育酚，a7＝SEQ ID NO：40，a8＝与a2的一部分和A10b互补的序列。

如图7(B)中所示，DNA构建体7c是由4个不同链杂交在一起构成的——a2＝SEQ IDNO：33，其3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区相对端连接到SEQ ID NO：37的5′端；SEQ ID NO：37的3′端连接到4个iSpC3间隔区，iSpC3间隔区相对端连接到4个5-硝基吲哚，5-硝基吲哚连接到SEQ ID NO：41的5′端，a10(c)＝SEQ ID NO：39，其3′端连接到6个iSp18间隔区，iSp18间隔区相对端连接到2个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶相对端连接到3′棕榈酸酯，a7＝SEQ ID NO：40，a8＝与a2的一部分和A10c互补的序列。

DNA构建体1、构建体2和构建体7(a-c)如上文实施例2中所述使用T4 Dda-E94C/A360C解旋酶预培育。

如实施例2中所述从在缓冲液中插入嵌段共聚物中的单个MspA纳米孔(MspA-B2C)获取电测量值，且检测对于构建体1、2和7(a-c)的解旋酶控制的DNA移动。

结果与讨论

对于对照实验，监测构建体1和构建体2的解旋酶控制的DNA的移动。图8上部的卡通显示，其中解旋酶可以结合到构建体1和构建体2。对应于每个构建体的解旋酶控制的DNA移动被识别，且将对应于链a1(构建体1)和链a2(构建体2)的移动的比例进行比较(见图8的下半部分)。当使用相同的耦合剂(胆固醇)将每个构建体耦合到膜时，观察到，解旋酶控制的DNA移动中，大约50％对应于链a1，50％对应于链a2。这表明，使用相同的单个耦合剂时，不存在相对于一个构建体，偏向另一个构建体的解旋酶控制的移位运动。

该实验还对使用多种不同耦合剂将构建体7(a-c)耦合到膜与使用胆固醇将构建体1耦合到膜进行了比较。图9-11上部的卡通显示，其中解旋酶可以结合到链a1(构建体1)和链a2(构建体7(a-c))。对应于每个构建体的解旋酶控制DNA的移动被识别，并将对应于a1和a2(分别为构建体1和构建体7(a-c))的移动的比例进行比较(参见图9-11的下半部分)。在相同的DNA链(A10a)中使用两个胆固醇时观察到，其具有与使用单个胆固醇时相同的耦合强度(见图9)。而使用生育酚时观察到，所述生育酚是比胆固醇强的耦合剂(见图10)，因为通过生育酚锚定构建体时比通过胆固醇锚定构建体时观察到较大量的DNA控制的解旋酶移动。此外，观察到棕榈酸酯是比胆固醇弱的耦合剂，因为通过棕榈酸酯锚定构建体时比通过胆固醇锚定构建体时观察到较少的解旋酶控制的DNA移动(见图11)。因此，通过使用本方法比较各种耦合剂的耦合强度，可以选择两种不同强度的耦合剂和使系统偏向于选择所希望的构建体(进一步详细内容见实施例6)。

实施例5

本实施例描述了图12中所示的和实施例6中所用的DNA构建体8和构建体9的样品制备过程。

材料和方法

将λDNA(1μg，SEQ ID NO：43)用5U的SnaBI和20U的BamHI-HF在1×NEBuffer 4在37℃下进行限制性酶消化1小时。消化以后，根据制造商的使用说明，使用1.5x AgeneourtAMPure小珠将DNA纯化。然后将样品在50uL无核酸酶的水中洗脱。然后遵循制造商的使用说明，使用NEB的NEBNext端部修复系统对DNA进行末端修复。将样品使用1.5x AgencourtAMPure小珠再次进行纯化，然后在42uL无核酸酶的水中进行DNA洗脱。末端修复步骤以后，根据制造商的使用说明，将纯化的DNA使用NEB的NEBNext dA-拖尾系统进行dA拖尾(dA-tailed)。将DNA使用1.5x Agencourt AMPure小珠再次纯化，在20uL无核酸酶的水中洗脱。遵循制造商的使用说明，使用NEB的NEBNext快速连接酶模块，将所述DNA在A260nm进行定量然后以对每个5′端过量25倍实施适配体接合。构建体8通过将以下适配体接合到DNA的片段(图12中标记为a12)而制备(适配体1(图12中标记为a11)＝25个iSpC3间隔区，其连接到SEQID NO：44的5′端，SEQ ID NO：44的3′端连接4个iSp18间隔区，所述间隔区相对端连接到SEQID NO 45的5′端，SEQ ID NO 45的3′端连接到序列AACCT(其通过硫代磷酸酯(phosphorothioate)键连接在一起)，其中所述序列中的最后的T被连接到另外的未修饰的T；适配体2(图12中标记为a14)＝在序列GGTT(其通过硫代磷酸酯键连接在一起)的5′端具有磷酸基团，该序列3′端被连接到SEQ ID NO：46的5′端，SEQ ID NO：46的3′端连接到6个iSp18间隔区，iSp18间隔区相对端连接到两个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶相对端连接到3′胆固醇TEG，适配体3(图12中标记为a13)＝SEQ ID NO：47的5′端具有磷酸基团，且其具有内部胆固醇TEG连接到SEQ ID NO：47的3′端，所述内部胆固醇还连接到SEQ ID NO：48的5′端，SEQ IDNO：48的3′端用硫代磷酸酯键连接到G和未修饰的T)。构建体9通过将以下适配体接合到DNA的片段(图12中标记为a12)而制备(适配体1(图12中标记为a11)＝25 iSpC3间隔区，其5′端连接到SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：44的3′端连接到4个iSp18间隔区，iSp18间隔区相对端连接到SEQID NO：45的5′端，SEQ ID NO：45的3′端连接到序列AACCT(其通过硫代磷酸酯键连接在一起)，其中，所述序列中的最后的T被连接到另一个未修饰的T；适配体4(图12中标记为a15)＝在序列GGTT(其通过硫代磷酸酯键连接在一起)的5′端具有磷酸基团，该序列的3′端连接到SEQ ID NO：46的5′端，SEQ ID NO：46的3′端连接到6个iSp18间隔区，所述间隔区相对端连接到两个胸腺嘧啶，胸腺嘧啶相对端连接到3′棕榈酸酯，适配体3(图12中标记为a13)＝SEQ ID NO：47的5′端具有磷酸基团，且其具有内部胆固醇TEG连接到SEQ ID NO：47的3′端，所述内部胆固醇也连接到SEQ ID NO：48的5′端，SEQ ID NO：48的3′端用硫代磷酸酯键连接到G和未修饰的T)。消化以后，将接合的DNA使用0.4x Agencourt AMPure小珠纯化，在16uL无核酸酶的水中洗脱。所述DNA在A260nm下进行定量然后添加757.5mM KCl，125mM磷酸钾缓冲液(pH 7)和5mM EDTA。

实施例6

本实施例比较了针对构建体8和构建体9检测到的解旋酶控制的DNA移动。将构建体8使用两个胆固醇(二者为强耦合剂)耦合到膜。将构建体9使用发夹环中的胆固醇和Y适配体中的棕榈酸酯耦合到膜。所述构建体均含有由上文所述的方法片段化的λDNA。

材料和方法

将DNA构建体8和9分别用T4 Dda-E94C/A360C/C109A/C136A解旋酶按与上述实施例2中所述类似的方法预温育。

如实施例2中所述从在缓冲液中插入嵌段共聚物中的单个MspA纳米孔(MspA-B2C)获取电测量值，且监测对于构建体8和构建体9的解旋酶控制的DNA移动。

结果与讨论

在片段化和适配体连接过程中(实施例5中所述)，制备图12中所示的所需构建体。然而，连接两个Y适配体(构建体11和构建体12)或连接两个发夹环适配体(构建体10)的过程中，还制备了其它构建体(见图13和图14)。为了使纳米孔能够捕获DNA，所述DNA必须具有至少一个Y适配体，使得有游离的末端被纳米孔捕获。因此，连接有两个发夹环的DNA构建体(构建体10)在纳米孔实验中不能被观察到。在λDNA片段的两端上具有Y适配体的构建体能够被纳米孔通过DNA(构建体11和构建体12)的两端而捕获。但是，因为没有发夹环连接到所述DNA，因此仅链x或链y移位穿过纳米孔。然而，如果构建体8或构建体9被纳米孔(经Y适配体端)捕获，则链X和链Y两者由于连接至相对端的发夹环而移位穿过纳米孔。因此，希望的是，含有Y适配体和发夹的构建体优选被纳米孔捕获。为了仅分离所需的构建体8和构建体9而分离出各个构建体(10、8和11，或10、9和12)，这是不可能。

对含有Y适配体和发夹适配体的构建体是否可以通过使用耦合剂的不同组合被纳米孔优先选择和捕获进行了研究。在本实施例中，比较了两个胆固醇的耦合(构建体8)与胆固醇和棕榈酸酯的耦合(构建体9)。测试的这两种构建体展现出发夹/Y适配体构建体(8和9)或双Y适配体构建体(11和12)的大数量的解旋酶控制的DNA移动。当在Y适配体和发夹二者(构建体8)中使用相同的耦合剂(胆固醇)时，检测到25％的解旋酶控制的DNA移动对应于构建体8且75％的解旋酶控制的DNA移动对应于构建体11。因此，检测到，只有四分之一的移动对应于所希望的构建体。当在发夹中使用强耦合剂(在这种情况下为胆固醇)且在Y适配体中使用较弱的耦合剂(在这种情况下为棕榈酸酯)时，检测到，46％的解旋酶控制的DNA移动对应于构建体9且56％的解旋酶控制的DNA移动对应于构建体12。这是对选择所需构建体9的显著改进。在检测所需构建体中的这一改进是由于使用了两种不同强度的耦合剂。将使用两种较弱耦合剂耦合双Y适配体构建体12到膜与使用一个弱锚和一个强锚耦合Y适配体/发夹构建体9到膜进行比较。由于所需构建体采用了一个比双Y适配体构建体中使用的那些锚强的锚，因此其优先耦合到膜上，且因此检测到，更大比例的解旋酶控制的DNA移动对应于所需的构建体9。

实施例7

本实施例比较了通过若干手段耦合到膜的许多不同DNA构建体13、14、15和16的耦合效率。构建体13使用发夹区域中的胆固醇和Y适配体区域中的由刚性DNA连接体杂交的棕榈酸酯耦合到膜。构建体14使用发夹区域中的胆固醇和Y适配体区域中的由柔性DNA连接体杂交的棕榈酸酯耦合到膜。构建体15使用发夹区域中的胆固醇和Y适配体区域中的由刚性DNA连接体杂交的胆固醇耦合到膜。构建体16使用发夹区域中的胆固醇和Y适配体区域中的由柔性DNA连接体杂交的胆固醇耦合到所述膜。

材料和方法

所有构建体包含已通过上文实施例5中所述的方法片段化的λDNA片段(图15和图16中标记为a12)，然而，不同的适配体然后被接合到各DNA构建体。所述适配体接合而形成DNA构建体13-16(在图15和16中示出)将在下面详细描述。

构建体13、14、15和16通过将下列各适配体接合到λDNA的片段(在图15和图16中标记为a12)而制备(适配体1(图15中标记为a16)＝30个iSpC3间隔区，其连接到SEQ ID NO：51的5′端，SEQ ID NO：51的3′端连接到4个iSp18间隔区，所述iSp18间隔区的相对端连接到SEQ ID NO：52的5′端；适配体2(图15中标记为a17)＝在SEQ ID NO：49的5′端具有磷酸基团，该序列的3′端连接到4个iSpC3间隔区，所述iSpC3间隔区的相对端连接到SEQ ID NO：50的5′端，所述SEQ ID NO：50的3′端经硫代磷酸酯键连接到胸腺嘧啶；适配体3(图15中标记为a18)＝SEQ ID NO：53的5′端具有磷酸基团。

在按实施例5中所述纯化以上构建体后，将5′端连接有棕榈酸酯或胆固醇的刚性或柔性DNA连接体在以下条件下杂交到所述构建体——将0.2ul的每个DNA连接体(10uM)加入到13ul接合的DNA(原液浓度约为20-30nM)中，并在室温下培养10分钟。

构建体13杂交到适配体4(在图15中标记为a20)和适配体5(在图15中标记为a19)，其中适配体4＝SEQ ID NO：40，其5′端连接到6个iSp18间隔区，所述iSp18间隔区的相对端连接到两个胸腺嘧啶和5′胆固醇TEG，适配体5＝SEQ ID NO：54，其5′端连接到棕榈酸酯。

构建体14杂交到适配体4(在图15中标记为a20)和适配体6(在图15中标记为a21)，其中适配体4＝SEQ ID NO：40，其5′端连接到6个iSp18间隔区，所述iSp18间隔区的相对端连接到两个胸腺嘧啶和5′胆固醇TEG，适配体6＝SEQ ID NO：54，其5′端连接到6个iSp18间隔区，所述iSp18间隔区的相对端连接两个胸腺嘧啶和棕榈酸酯。

构建体15杂交到适配体4(图15中标记为a20)和适配体5(在图15中标记为a22)，其中适配体4＝SEQ ID NO：40，其5′端连接到6个iSp18间隔区，所述iSp18间隔区的相对端连接到两个胸腺嘧啶和5′胆固醇TEG，适配体5＝SEQ ID NO：54，其5′端连接到胆固醇TEG。

构建体16杂交到适配体4(在图15中标记为a20)和适配体6(在图15中标记为a23)，其中适配体4＝SEQ ID NO：40，其5′端连接到6个iSp18间隔区，所述iSp18间隔区的相对端连接到两个胸腺嘧啶和5′胆固醇TEG，适配体6＝SEQ ID NO：54，其5′端连接到6个iSp18间隔区，所述iSp18间隔区的相对端连接两个胸腺嘧啶和胆固醇TEG。

在设置该实验之前，将DNA构建体13-16(加入到纳米孔系统的最终浓度0.1nM)使用在缓冲液(151mM KCl，25mM磷酸盐，5％甘油，pH7.0)中的T4Dda-E94C/A360C/C109A/C136A(加入到纳米孔系统的最终浓度为10nM)在室温下独立地预培育5分钟。五分钟后，将TMAD(500μM)加入到预混合物中，且再培育混合物5分钟。最后，MgCl2(2mM最终浓度)，ATP(2.5mM最终浓度)和缓冲液(500mM KCl和25mM磷酸钾pH 8.0)加入到预混合物中。

如实施例2中所述从在缓冲液中插入嵌段共聚物中的单个MspA纳米孔(MspA-B2C)获取电测量值，并监测构建体13-16的解旋酶控制的DNA移动。

结果与讨论

本实施例通过下述比较了多个不同DNA构建体13、14、15和16的耦合效率：观察研究在试验过程中每个纳米孔的解旋酶控制的DNA移动的数目，以及与检测到的所有其他解旋酶控制的DNA移动相比时，这些解旋酶控制的移动——对应于区域R1和R2的移位——的百分比。

观测了对于所测试的所有这四个不同构建体的解旋酶控制的DNA移动。在这个实验中，我们比较了两种不同类型的锚——棕榈酸酯和胆固醇的强度。还可以比较，两种不同类型的双链多核苷酸连接体的柔性是如何影响耦合的强度的。在所有4个构建体中，在发夹a20中的耦合剂(柔性胆固醇系链)保持不变，Y适配体中使用的耦合剂在棕榈酸酯/胆固醇和柔性/刚性连接体之间变化。

本实验中使用的构建体是通过如实施例5中所述的相同的片段化和适配体连接方法制备的。这制得在图15和16中示出的所需构建体以及在图13和14中所示构建体的构建体类似物，它们具有两个连接的Y适配体或两个连接的发夹适配体。如在上文实施例6详细描述的，为了使纳米孔能够捕获DNA，DNA必须已具有至少一个Y适配体以使其具有游离端能够被所述孔捕获。因此，在纳米孔实验中观察不到连接有两个发夹的DNA构建体。在DNA片段的两端上具有Y适配体的构建体通过所述DNA的两端被纳米孔捕获。但是，当没有发夹连接到DNA时，仅R1或R2被移位穿过纳米孔。然而，如果所需的构建体13-16被纳米孔捕获(通过Y适配体端)，则区域R1和R2将都移位通过纳米孔。因此，所需的是含有Y适配体和发夹的构建体优先地被纳米孔捕获。

图17所示的数据说明，所检测到的解旋酶控制的DNA移动总数的％，其对应于R1和R2区域穿过纳米孔的移位(从含有Y适配体和发夹适配体的所需构建体制备的)。观察到，其他解旋酶控制的DNA移动对应于下述构建体的移位：其具有两个Y适配体而不是Y适配体和发夹环适配体，连接到λDNA的片段。当棕榈酸酯与刚性或柔性连接体(构建体13和构建体14)一起使用时，R1和R2区域的解旋酶控制DNA移动穿过纳米孔(并对应于所需构建体)的最高百分比被观察到。具有刚性系链的胆固醇比具有柔性系链的胆固醇具有更高的解旋酶控制的DNA移动的百分比，其对应于R1和R2穿过纳米孔的移位。

从图18所示数据也可清楚，对于棕榈酸酯(构建体13和构建体14)和胆固醇(构建体15和构建体16)，刚性排列是比柔性排列较弱的耦合结构，因为构建体13和构建体15导致对每个纳米孔检测到较少的解旋酶控制的DNA移动。测试到的最弱的耦合排列是在其中使用刚性连接体连接到棕榈酸酯的构建体15中。

优选的耦合系统是这样的耦合系统：其引起每个纳米孔具有较高数量的解旋酶控制的DNA移动，其也具有最高百分比的解旋酶控制的DNA移动——对应于区域R1和区域R2的移位。实验表明，对于R1和R2的最高％的解旋酶控制的DNA移动导致每个纳米孔的最低数量的解旋酶控制的DNA移动，反之亦然。因此，对于所需的解旋酶控制的DNA移动的最佳整体吞吐量，优选的构建体设计是这样的构建体15：其每个纳米孔具有大量的解旋酶控制的DNA移动，其中解旋酶控制的DNA移动——对应于R1和R2的移位——的百分比刚好在50％以下。

序列表

<110> 牛津纳米孔技术公司

<120> 方法

<130> N402116WO

<150> GB1406147.7

<151> 2014-04-04

<150> GB1407815.8

<151> 2014-05-02

<150> PCT/GB2014/052737

<151> 2014-09-10

<160> 54

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）孔蛋白A突变体

(D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E193K)

<400> 1

atgggtctgg ataatgaact gagcctggtg gacggtcaag atcgtaccct gacggtgcaa 60

caatgggata cctttctgaa tggcgttttt ccgctggatc gtaatcgcct gacccgtgaa 120

tggtttcatt ccggtcgcgc aaaatatatc gtcgcaggcc cgggtgctga cgaattcgaa 180

ggcacgctgg aactgggtta tcagattggc tttccgtggt cactgggcgt tggtatcaac 240

ttctcgtaca ccacgccgaa tattctgatc aacaatggta acattaccgc accgccgttt 300

ggcctgaaca gcgtgattac gccgaacctg tttccgggtg ttagcatctc tgcccgtctg 360

ggcaatggtc cgggcattca agaagtggca acctttagtg tgcgcgtttc cggcgctaaa 420

ggcggtgtcg cggtgtctaa cgcccacggt accgttacgg gcgcggccgg cggtgtcctg 480

ctgcgtccgt tcgcgcgcct gattgcctct accggcgaca gcgttacgac ctatggcgaa 540

ccgtggaata tgaactaa 558

<210> 2

<211> 184

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 耻垢分枝杆菌孔蛋白A突变体

(D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K)

<400> 2

Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu

1 5 1015

Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp

202530

Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr

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Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu

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Gly Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe

65707580

Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asn Asn Gly Asn Ile Thr Ala

859095

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100 105 110

Val Ser Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val

115 120 125

Ala Thr Phe Ser Val Arg Val Ser Gly Ala Lys Gly Gly Val Ala Val

130 135 140

Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu

145 150 155 160

Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr

165 170 175

Tyr Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn

180

<210> 3

<211> 885

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α-溶血素突变体 (E111N/K147N)

<400> 3

atggcagatt ctgatattaa tattaaaacc ggtactacag atattggaag caatactaca 60

gtaaaaacag gtgatttagt cacttatgat aaagaaaatg gcatgcacaa aaaagtattt 120

tatagtttta tcgatgataa aaatcacaat aaaaaactgc tagttattag aacaaaaggt 180

accattgctg gtcaatatag agtttatagc gaagaaggtg ctaacaaaag tggtttagcc 240

tggccttcag cctttaaggt acagttgcaa ctacctgata atgaagtagc tcaaatatct 300

gattactatc caagaaattc gattgataca aaaaactata tgagtacttt aacttatgga 360

ttcaacggta atgttactgg tgatgataca ggaaaaattg gcggccttat tggtgcaaat 420

gtttcgattg gtcatacact gaactatgtt caacctgatt tcaaaacaat tttagagagc 480

ccaactgata aaaaagtagg ctggaaagtg atatttaaca atatggtgaa tcaaaattgg 540

ggaccatacg atcgagattc ttggaacccg gtatatggca atcaactttt catgaaaact 600

agaaatggtt ctatgaaagc agcagataac ttccttgatc ctaacaaagc aagttctcta 660

ttatcttcag ggttttcacc agacttcgct acagttatta ctatggatag aaaagcatcc 720

aaacaacaaa caaatataga tgtaatatac gaacgagttc gtgatgatta ccaattgcat 780

tggacttcaa caaattggaa aggtaccaat actaaagata aatggacaga tcgttcttca 840

gaaagatata aaatcgattg ggaaaaagaa gaaatgacaa attaa 885

<210> 4

<211> 293

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α-溶血素突变体 (E111N/K147N)

<400> 4

Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser

1 5 1015

Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn

202530

Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His

354045

Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln

505560

Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp

65707580

Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala

859095

Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Asn Tyr

100 105 110

Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp

115 120 125

Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His

130 135 140

Thr Leu Asn Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro

145 150 155 160

Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn

165 170 175

Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp

195 200 205

Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe

210 215 220

Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys

225 230 235 240

Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr

245 250 255

Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp

260 265 270

Lys Trp Thr Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys

275 280 285

Glu Glu Met Thr Asn

290

<210> 5

<211> 184

<212> PRT

<213> 耻垢分枝杆菌

<400> 5

Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu

1 5 1015

Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp

202530

Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr

354045

Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu

505560

Gly Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe

65707580

Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Ala

859095

Pro Pro Phe Gly Leu Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly

100 105 110

Val Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val

115 120 125

Ala Thr Phe Ser Val Asp Val Ser Gly Pro Ala Gly Gly Val Ala Val

130 135 140

Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu

145 150 155 160

Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr

165 170 175

Tyr Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn

180

<210> 6

<211> 184

<212> PRT

<213> 耻垢分枝杆菌

<400> 6

Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu

1 5 1015

Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp

202530

Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr

354045

Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu

505560

Gly Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe

65707580

Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Gly

859095

Pro Pro Phe Gly Leu Glu Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly

100 105 110

Val Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val

115 120 125

Ala Thr Phe Ser Val Asp Val Ser Gly Pro Ala Gly Gly Val Ala Val

130 135 140

Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu

145 150 155 160

Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr

165 170 175

Tyr Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn

180

<210> 7

<211> 183

<212> PRT

<213> 耻垢分枝杆菌

<400> 7

Val Asp Asn Gln Leu Ser Val Val Asp Gly Gln Gly Arg Thr Leu Thr

1 5 1015

Val Gln Gln Ala Glu Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp Arg

202530

Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Thr Tyr His

354045

Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu Gly

505560

Tyr Gln Val Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe Ser

65707580

Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Gly Gly Asp Ile Thr Gln Pro

859095

Pro Phe Gly Leu Asp Thr Ile Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly Val

100 105 110

Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val Ala

115 120 125

Thr Phe Ser Val Asp Val Lys Gly Ala Lys Gly Ala Val Ala Val Ser

130 135 140

Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu Arg

145 150 155 160

Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr Tyr

165 170 175

Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn

180

<210> 8

<211> 1830

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）噬菌体phi29

<400> 8

atgaaacaca tgccgcgtaa aatgtatagc tgcgcgtttg aaaccacgac caaagtggaa 60

gattgtcgcg tttgggccta tggctacatg aacatcgaag atcattctga atacaaaatc 120

ggtaacagtc tggatgaatt tatggcatgg gtgctgaaag ttcaggcgga tctgtacttc 180

cacaacctga aatttgatgg cgcattcatt atcaactggc tggaacgtaa tggctttaaa 240

tggagcgcgg atggtctgcc gaacacgtat aataccatta tctctcgtat gggccagtgg 300

tatatgattg atatctgcct gggctacaaa ggtaaacgca aaattcatac cgtgatctat 360

gatagcctga aaaaactgcc gtttccggtg aagaaaattg cgaaagattt caaactgacg 420

gttctgaaag gcgatattga ttatcacaaa gaacgtccgg ttggttacaa aatcaccccg 480

gaagaatacg catacatcaa aaacgatatc cagatcatcg cagaagcgct gctgattcag 540

tttaaacagg gcctggatcg catgaccgcg ggcagtgata gcctgaaagg tttcaaagat 600

atcatcacga ccaaaaaatt caaaaaagtg ttcccgacgc tgagcctggg tctggataaa 660

gaagttcgtt atgcctaccg cggcggtttt acctggctga acgatcgttt caaagaaaaa 720

gaaattggcg agggtatggt gtttgatgtt aatagtctgt atccggcaca gatgtacagc 780

cgcctgctgc cgtatggcga accgatcgtg ttcgagggta aatatgtttg ggatgaagat 840

tacccgctgc atattcagca catccgttgt gaatttgaac tgaaagaagg ctatattccg 900

accattcaga tcaaacgtag tcgcttctat aagggtaacg aatacctgaa aagctctggc 960

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gatctgtaca acgttgaata catcagcggc ctgaaattta aagccacgac cggtctgttc 1080

aaagatttca tcgataaatg gacctacatc aaaacgacct ctgaaggcgc gattaaacag 1140

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ggtaaagttc cgtacctgaa agaaaatggc gcactgggtt ttcgcctggg cgaagaagaa 1260

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accatcaccg cggcccaggc atgctatgat cgcattatct actgtgatac cgattctatt 1380

catctgacgg gcaccgaaat cccggatgtg attaaagata tcgttgatcc gaaaaaactg 1440

ggttattggg cccacgaaag tacgtttaaa cgtgcaaaat acctgcgcca gaaaacctac 1500

atccaggata tctacatgaa agaagtggat ggcaaactgg ttgaaggttc tccggatgat 1560

tacaccgata tcaaattcag tgtgaaatgc gccggcatga cggataaaat caaaaaagaa 1620

gtgaccttcg aaaacttcaa agttggtttc agccgcaaaa tgaaaccgaa accggtgcag 1680

gttccgggcg gtgtggttct ggtggatgat acgtttacca ttaaatctgg cggtagtgcg 1740

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<210> 9

<211> 608

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌噬菌体 phi29

<400> 9

Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Ala Phe Glu Thr Thr

1 5 1015

Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile

202530

Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met

354045

Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys

505560

Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys

65707580

Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg

859095

Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys

100 105 110

Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe

115 120 125

Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly

130135 140

Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro

145 150 155 160

Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala

165 170 175

Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser

180 185 190

Asp Ser Leu Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys

195 200 205

Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr

210 215 220

Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys

225 230 235 240

Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala

245 250 255

Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu

260 265 270

Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile

275 280 285

Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile

290 295 300

Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly

305 310 315 320

Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met

325 330 335

Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys

340 345 350

Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr

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Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu

370 375 380

Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr

385 390 395 400

Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu

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Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe

420 425 430

Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys

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Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly

450 455 460

Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu

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Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg

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Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys

500 505 510

Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val

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Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln

545 550 555 560

Val Pro Gly Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys Ser

565 570 575

Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser

580 585 590

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

595 600 605

<210> 10

<211> 1390

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 10

atgatgaacg atggcaaaca gcagagcacc ttcctgtttc atgattatga aaccttcggt 60

acccatccgg ccctggatcg tccggcgcag tttgcggcca ttcgcaccga tagcgaattc 120

aatgtgattg gcgaaccgga agtgttttat tgcaaaccgg ccgatgatta tctgccgcag 180

ccgggtgcgg tgctgattac cggtattacc ccgcaggaag cgcgcgcgaa aggtgaaaac 240

gaagcggcgt ttgccgcgcg cattcatagc ctgtttaccg tgccgaaaac ctgcattctg 300

ggctataaca atgtgcgctt cgatgatgaa gttacccgta atatctttta tcgtaacttt 360

tatgatccgt atgcgtggag ctggcagcat gataacagcc gttgggatct gctggatgtg 420

atgcgcgcgt gctatgcgct gcgcccggaa ggcattaatt ggccggaaaa cgatgatggc 480

ctgccgagct ttcgtctgga acatctgacc aaagccaacg gcattgaaca tagcaatgcc 540

catgatgcga tggccgatgt ttatgcgacc attgcgatgg cgaaactggt taaaacccgt 600

cagccgcgcc tgtttgatta tctgtttacc caccgtaaca aacacaaact gatggcgctg 660

attgatgttc cgcagatgaa accgctggtg catgtgagcg gcatgtttgg cgcctggcgc 720

ggcaacacca gctgggtggc cccgctggcc tggcacccgg aaaatcgtaa cgccgtgatt 780

atggttgatc tggccggtga tattagcccg ctgctggaac tggatagcga taccctgcgt 840

gaacgcctgt ataccgccaa aaccgatctg ggcgataatg ccgccgtgcc ggtgaaactg 900

gttcacatta acaaatgccc ggtgctggcc caggcgaaca ccctgcgccc ggaagatgcg 960

gatcgtctgg gtattaatcg ccagcattgt ctggataatc tgaaaatcct gcgtgaaaac 1020

ccgcaggtgc gtgaaaaagt ggtggcgatc ttcgcggaag cggaaccgtt caccccgagc 1080

gataacgtgg atgcgcagct gtataacggc ttctttagcg atgccgatcg cgcggcgatg 1140

aaaatcgttc tggaaaccga accgcgcaat ctgccggcgc tggatattac ctttgttgat 1200

aaacgtattg aaaaactgct gtttaattat cgtgcgcgca attttccggg taccctggat 1260

tatgccgaac agcagcgttg gctggaacat cgtcgtcagg ttttcacccc ggaatttctg 1320

cagggttatg cggatgaact gcagatgctg gttcagcagt atgccgatga taaagaaaaa 1380

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<210> 11

<211> 485

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 11

Met Met Asn Asp Gly Lys Gln Gln Ser Thr Phe Leu Phe His Asp Tyr

1 5 1015

Glu Thr Phe Gly Thr His Pro Ala Leu Asp Arg Pro Ala Gln Phe Ala

202530

Ala Ile Arg Thr Asp Ser Glu Phe Asn Val Ile Gly Glu Pro Glu Val

354045

Phe Tyr Cys Lys Pro Ala Asp Asp Tyr Leu Pro Gln Pro Gly Ala Val

505560

Leu Ile Thr Gly Ile Thr Pro Gln Glu Ala Arg Ala Lys Gly Glu Asn

65707580

Glu Ala Ala Phe Ala Ala Arg Ile His Ser Leu Phe Thr Val Pro Lys

859095

Thr Cys Ile Leu Gly Tyr Asn Asn Val Arg Phe Asp Asp Glu Val Thr

100 105 110

Arg Asn Ile Phe Tyr Arg Asn Phe Tyr Asp Pro Tyr Ala Trp Ser Trp

115 120 125

Gln His Asp Asn Ser Arg Trp Asp Leu Leu Asp Val Met Arg Ala Cys

130 135 140

Tyr Ala Leu Arg Pro Glu Gly Ile Asn Trp Pro Glu Asn Asp Asp Gly

145 150 155 160

Leu Pro Ser Phe Arg Leu Glu His Leu Thr Lys Ala Asn Gly Ile Glu

165 170 175

His Ser Asn Ala His Asp Ala Met Ala Asp Val Tyr Ala Thr Ile Ala

180 185 190

Met Ala Lys Leu Val Lys Thr Arg Gln Pro Arg Leu Phe Asp Tyr Leu

195 200 205

Phe Thr His Arg Asn Lys His Lys Leu Met Ala Leu Ile Asp Val Pro

210 215 220

Gln Met Lys Pro Leu Val His Val Ser Gly Met Phe Gly Ala Trp Arg

225 230 235 240

Gly Asn Thr Ser Trp Val Ala Pro Leu Ala Trp His Pro Glu Asn Arg

245 250 255

Asn Ala Val Ile Met Val Asp Leu Ala Gly Asp Ile Ser Pro Leu Leu

260 265 270

Glu Leu Asp Ser Asp Thr Leu Arg Glu Arg Leu Tyr Thr Ala Lys Thr

275 280 285

Asp Leu Gly Asp Asn Ala Ala Val Pro Val Lys Leu Val His Ile Asn

290 295 300

Lys Cys Pro Val Leu Ala Gln Ala Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ala

305 310 315 320

Asp Arg Leu Gly Ile Asn Arg Gln His Cys Leu Asp Asn Leu Lys Ile

325 330 335

Leu Arg Glu Asn Pro Gln Val Arg Glu Lys Val Val Ala Ile Phe Ala

340 345 350

Glu Ala Glu Pro Phe Thr Pro Ser Asp Asn Val Asp Ala Gln Leu Tyr

355 360 365

Asn Gly Phe Phe Ser Asp Ala Asp Arg Ala Ala Met Lys Ile Val Leu

370 375 380

Glu Thr Glu Pro Arg Asn Leu Pro Ala Leu Asp Ile Thr Phe Val Asp

385 390 395 400

Lys Arg Ile Glu Lys Leu Leu Phe Asn Tyr Arg Ala Arg Asn Phe Pro

405 410 415

Gly Thr Leu Asp Tyr Ala Glu Gln Gln Arg Trp Leu Glu His Arg Arg

420 425 430

Gln Val Phe Thr Pro Glu Phe Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Glu Leu Gln

435440 445

Met Leu Val Gln Gln Tyr Ala Asp Asp Lys Glu Lys Val Ala Leu Leu

450 455 460

Lys Ala Leu Trp Gln Tyr Ala Glu Glu Ile Val Ser Gly Ser Gly His

465 470 475 480

His His His His His

485

<210> 12

<211> 804

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 12

atgaaatttg tctcttttaa tatcaacggc ctgcgcgcca gacctcacca gcttgaagcc 60

atcgtcgaaa agcaccaacc ggatgtgatt ggcctgcagg agacaaaagt tcatgacgat 120

atgtttccgc tcgaagaggt ggcgaagctc ggctacaacg tgttttatca cgggcagaaa 180

ggccattatg gcgtggcgct gctgaccaaa gagacgccga ttgccgtgcg tcgcggcttt 240

cccggtgacg acgaagaggc gcagcggcgg attattatgg cggaaatccc ctcactgctg 300

ggtaatgtca ccgtgatcaa cggttacttc ccgcagggtg aaagccgcga ccatccgata 360

aaattcccgg caaaagcgca gttttatcag aatctgcaaa actacctgga aaccgaactc 420

aaacgtgata atccggtact gattatgggc gatatgaata tcagccctac agatctggat 480

atcggcattg gcgaagaaaa ccgtaagcgc tggctgcgta ccggtaaatg ctctttcctg 540

ccggaagagc gcgaatggat ggacaggctg atgagctggg ggttggtcga taccttccgc 600

catgcgaatc cgcaaacagc agatcgtttc tcatggtttg attaccgctc aaaaggtttt 660

gacgataacc gtggtctgcg catcgacctg ctgctcgcca gccaaccgct ggcagaatgt 720

tgcgtagaaa ccggcatcga ctatgaaatc cgcagcatgg aaaaaccgtc cgatcacgcc 780

cccgtctggg cgaccttccg ccgc804

<210> 13

<211> 268

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 13

Met Lys Phe Val Ser Phe Asn Ile Asn Gly Leu Arg Ala Arg Pro His

1 5 1015

Gln Leu Glu Ala Ile Val Glu Lys His Gln Pro Asp Val Ile Gly Leu

202530

Gln Glu Thr Lys Val His Asp Asp Met Phe Pro Leu Glu Glu Val Ala

354045

Lys Leu Gly Tyr Asn Val Phe Tyr His Gly Gln Lys Gly His Tyr Gly

505560

Val Ala Leu Leu Thr Lys Glu Thr Pro Ile Ala Val Arg Arg Gly Phe

65707580

Pro Gly Asp Asp Glu Glu Ala Gln Arg Arg Ile Ile Met Ala Glu Ile

859095

Pro Ser Leu Leu Gly Asn Val Thr Val Ile Asn Gly Tyr Phe Pro Gln

100105 110

Gly Glu Ser Arg Asp His Pro Ile Lys Phe Pro Ala Lys Ala Gln Phe

115 120 125

Tyr Gln Asn Leu Gln Asn Tyr Leu Glu Thr Glu Leu Lys Arg Asp Asn

130 135 140

Pro Val Leu Ile Met Gly Asp Met Asn Ile Ser Pro Thr Asp Leu Asp

145 150 155 160

Ile Gly Ile Gly Glu Glu Asn Arg Lys Arg Trp Leu Arg Thr Gly Lys

165 170 175

Cys Ser Phe Leu Pro Glu Glu Arg Glu Trp Met Asp Arg Leu Met Ser

180 185 190

Trp Gly Leu Val Asp Thr Phe Arg His Ala Asn Pro Gln Thr Ala Asp

195 200 205

Arg Phe Ser Trp Phe Asp Tyr Arg Ser Lys Gly Phe Asp Asp Asn Arg

210 215 220

Gly Leu Arg Ile Asp Leu Leu Leu Ala Ser Gln Pro Leu Ala Glu Cys

225 230 235 240

Cys Val Glu Thr Gly Ile Asp Tyr Glu Ile Arg Ser Met Glu Lys Pro

245 250 255

Ser Asp His Ala Pro Val Trp Ala Thr Phe Arg Arg

260 265

<210> 14

<211> 1275

<212> DNA

<213> 嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）

<400> 14

atgtttcgtc gtaaagaaga tctggatccg ccgctggcac tgctgccgct gaaaggcctg 60

cgcgaagccg ccgcactgct ggaagaagcg ctgcgtcaag gtaaacgcat tcgtgttcac 120

ggcgactatg atgcggatgg cctgaccggc accgcgatcc tggttcgtgg tctggccgcc 180

ctgggtgcgg atgttcatcc gtttatcccg caccgcctgg aagaaggcta tggtgtcctg 240

atggaacgcg tcccggaaca tctggaagcc tcggacctgt ttctgaccgt tgactgcggc 300

attaccaacc atgcggaact gcgcgaactg ctggaaaatg gcgtggaagt cattgttacc 360

gatcatcata cgccgggcaa aacgccgccg ccgggtctgg tcgtgcatcc ggcgctgacg 420

ccggatctga aagaaaaacc gaccggcgca ggcgtggcgt ttctgctgct gtgggcactg 480

catgaacgcc tgggcctgcc gccgccgctg gaatacgcgg acctggcagc cgttggcacc 540

attgccgacg ttgccccgct gtggggttgg aatcgtgcac tggtgaaaga aggtctggca 600

cgcatcccgg cttcatcttg ggtgggcctg cgtctgctgg ctgaagccgt gggctatacc 660

ggcaaagcgg tcgaagtcgc tttccgcatc gcgccgcgca tcaatgcggc ttcccgcctg 720

ggcgaagcgg aaaaagccct gcgcctgctg ctgacggatg atgcggcaga agctcaggcg 780

ctggtcggcg aactgcaccg tctgaacgcc cgtcgtcaga ccctggaaga agcgatgctg 840

cgcaaactgc tgccgcaggc cgacccggaa gcgaaagcca tcgttctgct ggacccggaa 900

ggccatccgg gtgttatggg tattgtggcc tctcgcatcc tggaagcgac cctgcgcccg 960

gtctttctgg tggcccaggg caaaggcacc gtgcgttcgc tggctccgat ttccgccgtc 1020

gaagcactgc gcagcgcgga agatctgctg ctgcgttatg gtggtcataa agaagcggcg 1080

ggtttcgcaa tggatgaagc gctgtttccg gcgttcaaag cacgcgttga agcgtatgcc 1140

gcacgtttcc cggatccggt tcgtgaagtg gcactgctgg atctgctgcc ggaaccgggc 1200

ctgctgccgc aggtgttccg tgaactggca ctgctggaac cgtatggtga aggtaacccg 1260

gaaccgctgt tcctg1275

<210> 15

<211> 425

<212> PRT

<213> 嗜热栖热菌

<400> 15

Met Phe Arg Arg Lys Glu Asp Leu Asp Pro Pro Leu Ala Leu Leu Pro

1 510 15

Leu Lys Gly Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg

202530

Gln Gly Lys Arg Ile Arg Val His Gly Asp Tyr Asp Ala Asp Gly Leu

354045

Thr Gly Thr Ala Ile Leu Val Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ala Asp

505560

Val His Pro Phe Ile Pro His Arg Leu Glu Glu Gly Tyr Gly Val Leu

65707580

Met Glu Arg Val Pro Glu His Leu Glu Ala Ser Asp Leu Phe Leu Thr

859095

Val Asp Cys Gly Ile Thr Asn His Ala Glu Leu Arg Glu Leu Leu Glu

100 105 110

Asn Gly Val Glu Val Ile Val Thr Asp His His Thr Pro Gly Lys Thr

115 120 125

Pro Pro Pro Gly Leu Val Val His Pro Ala Leu Thr Pro Asp Leu Lys

130 135 140

Glu Lys Pro Thr Gly Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu Leu Trp Ala Leu

145 150 155 160

His Glu Arg Leu Gly Leu Pro Pro Pro Leu Glu Tyr Ala Asp Leu Ala

165 170 175

Ala Val Gly Thr Ile Ala Asp Val Ala Pro Leu Trp Gly Trp Asn Arg

180 185 190

Ala Leu Val Lys Glu Gly Leu Ala Arg Ile Pro Ala Ser Ser Trp Val

195 200 205

Gly Leu Arg Leu Leu Ala Glu Ala Val Gly Tyr Thr Gly Lys Ala Val

210 215 220

Glu Val Ala Phe Arg Ile Ala Pro Arg Ile Asn Ala Ala Ser Arg Leu

225 230 235 240

Gly Glu Ala Glu Lys Ala Leu Arg Leu Leu Leu Thr Asp Asp Ala Ala

245 250 255

Glu Ala Gln Ala Leu Val Gly Glu Leu His Arg Leu Asn Ala Arg Arg

260 265 270

Gln Thr Leu Glu Glu Ala Met Leu Arg Lys Leu Leu Pro Gln Ala Asp

275 280 285

Pro Glu Ala Lys Ala Ile Val Leu Leu Asp Pro Glu Gly His Pro Gly

290 295 300

Val Met Gly Ile Val Ala Ser Arg Ile Leu Glu Ala Thr Leu Arg Pro

305 310 315 320

Val Phe Leu Val Ala Gln Gly Lys Gly Thr Val Arg Ser Leu Ala Pro

325 330 335

Ile Ser Ala Val Glu Ala Leu Arg Ser Ala Glu Asp Leu Leu Leu Arg

340 345 350

Tyr Gly Gly His Lys Glu Ala Ala Gly Phe Ala Met Asp Glu Ala Leu

355 360 365

Phe Pro Ala Phe Lys Ala Arg Val Glu Ala Tyr Ala Ala Arg Phe Pro

370 375 380

Asp Pro Val Arg Glu Val Ala Leu Leu Asp Leu Leu Pro Glu Pro Gly

385 390 395 400

Leu Leu Pro Gln Val Phe Arg Glu Leu Ala Leu Leu Glu Pro Tyr Gly

405 410 415

Glu Gly Asn Pro Glu Pro Leu Phe Leu

420 425

<210> 16

<211> 738

<212> DNA

<213> 细菌噬菌体λ

<400> 16

tccggaagcg gctctggtag tggttctggc atgacaccgg acattatcct gcagcgtacc 60

gggatcgatg tgagagctgt cgaacagggg gatgatgcgt ggcacaaatt acggctcggc 120

gtcatcaccg cttcagaagt tcacaacgtg atagcaaaac cccgctccgg aaagaagtgg 180

cctgacatga aaatgtccta cttccacacc ctgcttgctg aggtttgcac cggtgtggct 240

ccggaagtta acgctaaagc actggcctgg ggaaaacagt acgagaacga cgccagaacc 300

ctgtttgaat tcacttccgg cgtgaatgtt actgaatccc cgatcatcta tcgcgacgaa 360

agtatgcgta ccgcctgctc tcccgatggt ttatgcagtg acggcaacgg ccttgaactg 420

aaatgcccgt ttacctcccg ggatttcatg aagttccggc tcggtggttt cgaggccata 480

aagtcagctt acatggccca ggtgcagtac agcatgtggg tgacgcgaaa aaatgcctgg 540

tactttgcca actatgaccc gcgtatgaag cgtgaaggcc tgcattatgt cgtgattgag 600

cgggatgaaa agtacatggc gagttttgac gagatcgtgc cggagttcat cgaaaaaatg 660

gacgaggcac tggctgaaat tggttttgta tttggggagc aatggcgatc tggctctggt 720

tccggcagcg gttccgga 738

<210> 17

<211> 226

<212> PRT

<213> 细菌噬菌体λ

<400> 17

Met Thr Pro Asp Ile Ile Leu Gln Arg Thr Gly Ile Asp Val Arg Ala

1 5 1015

Val Glu Gln Gly Asp Asp Ala Trp His Lys Leu Arg Leu Gly Val Ile

202530

Thr Ala Ser Glu Val His Asn Val Ile Ala Lys Pro Arg Ser Gly Lys

354045

Lys Trp Pro Asp Met Lys Met Ser Tyr Phe His Thr Leu Leu Ala Glu

505560

Val Cys Thr Gly Val Ala Pro Glu Val Asn Ala Lys Ala Leu Ala Trp

65707580

Gly Lys Gln Tyr Glu Asn Asp Ala Arg Thr Leu Phe Glu Phe Thr Ser

859095

Gly Val Asn Val Thr Glu Ser Pro Ile Ile Tyr Arg Asp Glu Ser Met

100 105 110

Arg Thr Ala Cys Ser Pro Asp Gly Leu Cys Ser Asp Gly Asn Gly Leu

115 120 125

Glu Leu Lys Cys Pro Phe Thr Ser Arg Asp Phe Met Lys Phe Arg Leu

130 135 140

Gly Gly Phe Glu Ala Ile Lys Ser Ala Tyr Met Ala Gln Val Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Met Trp Val Thr Arg Lys Asn Ala Trp Tyr Phe Ala Asn Tyr Asp

165 170 175

Pro Arg Met Lys Arg Glu Gly Leu His Tyr Val Val Ile Glu Arg Asp

180 185 190

Glu Lys Tyr Met Ala Ser Phe Asp Glu Ile Val Pro Glu Phe Ile Glu

195 200 205

Lys Met Asp Glu Ala Leu Ala Glu Ile Gly Phe Val Phe Gly Glu Gln

210 215 220

Trp Arg

225

<210> 18

<211> 760

<212> PRT

<213> 伯顿拟甲烷球菌（Methanococcoides burtonii）

<400> 18

Met Met Ile Arg Glu Leu Asp Ile Pro Arg Asp Ile Ile Gly Phe Tyr

1 5 1015

Glu Asp Ser Gly Ile Lys Glu Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Glu Ala Ile

202530

Glu Met Gly Leu Leu Glu Lys Lys Asn Leu Leu Ala Ala Ile Pro Thr

354045

Ala Ser Gly Lys Thr Leu Leu Ala Glu Leu Ala Met Ile Lys Ala Ile

505560

Arg Glu Gly Gly Lys Ala Leu Tyr Ile Val Pro Leu Arg Ala Leu Ala

65707580

Ser Glu Lys Phe Glu Arg Phe Lys Glu Leu Ala Pro Phe Gly Ile Lys

859095

Val Gly Ile Ser Thr Gly Asp Leu Asp Ser Arg Ala Asp Trp Leu Gly

100 105 110

Val Asn Asp Ile Ile Val Ala Thr Ser Glu Lys Thr Asp Ser Leu Leu

115 120 125

Arg Asn Gly Thr Ser Trp Met Asp Glu Ile Thr Thr Val Val Val Asp

130 135 140

Glu Ile His Leu Leu Asp Ser Lys Asn Arg Gly Pro Thr Leu Glu Val

145 150 155 160

Thr Ile Thr Lys Leu Met Arg Leu Asn Pro Asp Val Gln Val Val Ala

165 170 175

Leu Ser Ala Thr Val Gly Asn Ala Arg Glu Met Ala Asp Trp Leu Gly

180 185 190

Ala Ala Leu Val Leu Ser Glu Trp Arg Pro Thr Asp Leu His Glu Gly

195 200 205

Val Leu Phe Gly Asp Ala Ile Asn Phe Pro Gly Ser Gln Lys Lys Ile

210 215 220

Asp Arg Leu Glu Lys Asp Asp Ala Val Asn Leu Val Leu Asp Thr Ile

225 230 235 240

Lys Ala Glu Gly Gln Cys Leu Val Phe Glu Ser Ser Arg Arg Asn Cys

245 250 255

Ala Gly Phe Ala Lys Thr Ala Ser Ser Lys Val Ala Lys Ile Leu Asp

260 265 270

Asn Asp Ile Met Ile Lys Leu Ala Gly Ile Ala Glu Glu Val Glu Ser

275 280 285

Thr Gly Glu Thr Asp Thr Ala Ile Val Leu Ala Asn Cys Ile Arg Lys

290 295 300

Gly Val Ala Phe His His Ala Gly Leu Asn Ser Asn His Arg Lys Leu

305 310 315 320

Val Glu Asn Gly Phe Arg Gln Asn Leu Ile Lys Val Ile Ser Ser Thr

325 330 335

Pro Thr Leu Ala Ala Gly Leu Asn Leu Pro Ala Arg Arg Val Ile Ile

340 345 350

Arg Ser Tyr Arg Arg Phe Asp Ser Asn Phe Gly Met Gln Pro Ile Pro

355 360 365

Val Leu Glu Tyr Lys Gln Met Ala Gly Arg Ala Gly Arg Pro His Leu

370 375 380

Asp Pro Tyr Gly Glu Ser Val Leu Leu Ala Lys Thr Tyr Asp Glu Phe

385 390 395 400

Ala Gln Leu Met Glu Asn Tyr Val Glu Ala Asp Ala Glu Asp Ile Trp

405 410 415

Ser Lys Leu Gly Thr Glu Asn Ala Leu Arg Thr His Val Leu Ser Thr

420 425 430

Ile Val Asn Gly Phe Ala Ser Thr Arg Gln Glu Leu Phe Asp Phe Phe

435 440 445

Gly Ala Thr Phe Phe Ala Tyr Gln Gln Asp Lys Trp Met Leu Glu Glu

450 455 460

Val Ile Asn Asp Cys Leu Glu Phe Leu Ile Asp Lys Ala Met Val Ser

465 470 475 480

Glu Thr Glu Asp Ile Glu Asp Ala Ser Lys Leu Phe Leu Arg Gly Thr

485 490 495

Arg Leu Gly Ser Leu Val Ser Met Leu Tyr Ile Asp Pro Leu Ser Gly

500 505 510

Ser Lys Ile Val Asp Gly Phe Lys Asp Ile Gly Lys Ser Thr Gly Gly

515 520 525

Asn Met Gly Ser Leu Glu Asp Asp Lys Gly Asp Asp Ile Thr Val Thr

530 535 540

Asp Met Thr Leu Leu His Leu Val Cys Ser Thr Pro Asp Met Arg Gln

545 550 555 560

Leu Tyr Leu Arg Asn Thr Asp Tyr Thr Ile Val Asn Glu Tyr Ile Val

565 570 575

Ala His Ser Asp Glu Phe His Glu Ile Pro Asp Lys Leu Lys Glu Thr

580 585 590

Asp Tyr Glu Trp Phe Met Gly Glu Val Lys Thr Ala Met Leu Leu Glu

595 600 605

Glu Trp Val Thr Glu Val Ser Ala Glu Asp Ile Thr Arg His Phe Asn

610 615 620

Val Gly Glu Gly Asp Ile His Ala Leu Ala Asp Thr Ser Glu Trp Leu

625 630 635 640

Met His Ala Ala Ala Lys Leu Ala Glu Leu Leu Gly Val Glu Tyr Ser

645 650 655

Ser His Ala Tyr Ser Leu Glu Lys Arg Ile Arg Tyr Gly Ser Gly Leu

660 665 670

Asp Leu Met Glu Leu Val Gly Ile Arg Gly Val Gly Arg Val Arg Ala

675 680 685

Arg Lys Leu Tyr Asn Ala Gly Phe Val Ser Val Ala Lys Leu Lys Gly

690 695 700

Ala Asp Ile Ser Val Leu Ser Lys Leu Val Gly Pro Lys Val Ala Tyr

705 710 715 720

Asn Ile Leu Ser Gly Ile Gly Val Arg Val Asn Asp Lys His Phe Asn

725 730 735

Ser Ala Pro Ile Ser Ser Asn Thr Leu Asp Thr Leu Leu Asp Lys Asn

740 745 750

Gln Lys Thr Phe Asn Asp Phe Gln

755 760

<210> 19

<211> 707

<212> PRT

<213> 共生餐古菌（Cenarchaeum symbiosum）

<400> 19

Met Arg Ile Ser Glu Leu Asp Ile Pro Arg Pro Ala Ile Glu Phe Leu

1 5 1015

Glu Gly Glu Gly Tyr Lys Lys Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Ala Ala Ala

202530

Lys Ala Gly Leu Thr Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Ser Ala Pro Thr

354045

Ala Ser Gly Lys Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala Met Ile Ser His Leu

505560

Ser Arg Asn Arg Gly Lys Ala Val Tyr Leu Ser Pro Leu Arg Ala Leu

65707580

Ala Ala Glu Lys Phe Ala Glu Phe Gly Lys Ile Gly Gly Ile Pro Leu

859095

Gly Arg Pro Val Arg Val Gly Val Ser Thr Gly Asp Phe Glu Lys Ala

100 105 110

Gly Arg Ser Leu Gly Asn Asn Asp Ile Leu Val Leu Thr Asn Glu Arg

115 120 125

Met Asp Ser Leu Ile Arg Arg Arg Pro Asp Trp Met Asp Glu Val Gly

130 135 140

Leu Val Ile Ala Asp Glu Ile His Leu Ile Gly Asp Arg Ser Arg Gly

145 150 155 160

Pro Thr Leu Glu Met Val Leu Thr Lys Leu Arg Gly Leu Arg Ser Ser

165 170 175

Pro Gln Val Val Ala Leu Ser Ala Thr Ile Ser Asn Ala Asp Glu Ile

180 185 190

Ala Gly Trp Leu Asp Cys Thr Leu Val His Ser Thr Trp Arg Pro Val

195 200 205

Pro Leu Ser Glu Gly Val Tyr Gln Asp Gly Glu Val Ala Met Gly Asp

210 215 220

Gly Ser Arg His Glu Val Ala Ala Thr Gly Gly Gly Pro Ala Val Asp

225 230 235 240

Leu Ala Ala Glu Ser Val Ala Glu Gly Gly Gln Ser Leu Ile Phe Ala

245 250 255

Asp Thr Arg Ala Arg Ser Ala Ser Leu Ala Ala Lys Ala Ser Ala Val

260 265 270

Ile Pro Glu Ala Lys Gly Ala Asp Ala Ala Lys Leu Ala Ala Ala Ala

275 280 285

Lys Lys Ile Ile Ser Ser Gly Gly Glu Thr Lys Leu Ala Lys Thr Leu

290 295 300

Ala Glu Leu Val Glu Lys Gly Ala Ala Phe His His Ala Gly Leu Asn

305 310 315 320

Gln Asp Cys Arg Ser Val Val Glu Glu Glu Phe Arg Ser Gly Arg Ile

325 330 335

Arg Leu Leu Ala Ser Thr Pro Thr Leu Ala Ala Gly Val Asn Leu Pro

340 345 350

Ala Arg Arg Val Val Ile Ser Ser Val Met Arg Tyr Asn Ser Ser Ser

355 360 365

Gly Met Ser Glu Pro Ile Ser Ile Leu Glu Tyr Lys Gln Leu Cys Gly

370 375 380

Arg Ala Gly Arg Pro Gln Tyr Asp Lys Ser Gly Glu Ala Ile Val Val

385 390 395 400

Gly Gly Val Asn Ala Asp Glu Ile Phe Asp Arg Tyr Ile Gly Gly Glu

405 410 415

Pro Glu Pro Ile Arg Ser Ala Met Val Asp Asp Arg Ala Leu Arg Ile

420 425 430

His Val Leu Ser Leu Val Thr Thr Ser Pro Gly Ile Lys Glu Asp Asp

435 440 445

Val Thr Glu Phe Phe Leu Gly Thr Leu Gly Gly Gln Gln Ser Gly Glu

450 455 460

Ser Thr Val Lys Phe Ser Val Ala Val Ala Leu Arg Phe Leu Gln Glu

465 470 475 480

Glu Gly Met Leu Gly Arg Arg Gly Gly Arg Leu Ala Ala Thr Lys Met

485 490 495

Gly Arg Leu Val Ser Arg Leu Tyr Met Asp Pro Met Thr Ala Val Thr

500 505 510

Leu Arg Asp Ala Val Gly Glu Ala Ser Pro Gly Arg Met His Thr Leu

515 520 525

Gly Phe Leu His Leu Val Ser Glu Cys Ser Glu Phe Met Pro Arg Phe

530 535 540

Ala Leu Arg Gln Lys Asp His Glu Val Ala Glu Met Met Leu Glu Ala

545 550 555 560

Gly Arg Gly Glu Leu Leu Arg Pro Val Tyr Ser Tyr Glu Cys Gly Arg

565 570 575

Gly Leu Leu Ala Leu His Arg Trp Ile Gly Glu Ser Pro Glu Ala Lys

580 585 590

Leu Ala Glu Asp Leu Lys Phe Glu Ser Gly Asp Val His Arg Met Val

595 600 605

Glu Ser Ser Gly Trp Leu Leu Arg Cys Ile Trp Glu Ile Ser Lys His

610 615 620

Gln Glu Arg Pro Asp Leu Leu Gly Glu Leu Asp Val Leu Arg Ser Arg

625 630 635 640

Val Ala Tyr Gly Ile Lys Ala Glu Leu Val Pro Leu Val Ser Ile Lys

645 650 655

Gly Ile Gly Arg Val Arg Ser Arg Arg Leu Phe Arg Gly Gly Ile Lys

660 665 670

Gly Pro Gly Asp Leu Ala Ala Val Pro Val Glu Arg Leu Ser Arg Val

675 680 685

Glu Gly Ile Gly Ala Thr Leu Ala Asn Asn Ile Lys Ser Gln Leu Arg

690 695 700

Lys Gly Gly

705

<210> 20

<211> 720

<212> PRT

<213> 抗辐射热球菌（Thermococcus gammatolerans）

<400> 20

Met Lys Val Asp Glu Leu Pro Val Asp Glu Arg Leu Lys Ala Val Leu

1 5 1015

Lys Glu Arg Gly Ile Glu Glu Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Glu Ala Leu

202530

Lys Ser Gly Ala Leu Glu Gly Arg Asn Leu Val Leu Ala Ile Pro Thr

354045

Ala Ser Gly Lys Thr Leu Val Ser Glu Ile Val Met Val Asn Lys Leu

505560

Ile Gln Glu Gly Gly Lys Ala Val Tyr Leu Val Pro Leu Lys Ala Leu

65707580

Ala Glu Glu Lys Tyr Arg Glu Phe Lys Glu Trp Glu Lys Leu Gly Leu

859095

Lys Val Ala Ala Thr Thr Gly Asp Tyr Asp Ser Thr Asp Asp Trp Leu

100 105 110

Gly Arg Tyr Asp Ile Ile Val Ala Thr Ala Glu Lys Phe Asp Ser Leu

115 120 125

Leu Arg His Gly Ala Arg Trp Ile Asn Asp Val Lys Leu Val Val Ala

130 135 140

Asp Glu Val His Leu Ile Gly Ser Tyr Asp Arg Gly Ala Thr Leu Glu

145 150 155 160

Met Ile Leu Thr His Met Leu Gly Arg Ala Gln Ile Leu Ala Leu Ser

165 170 175

Ala Thr Val Gly Asn Ala Glu Glu Leu Ala Glu Trp Leu Asp Ala Ser

180 185 190

Leu Val Val Ser Asp Trp Arg Pro Val Gln Leu Arg Arg Gly Val Phe

195 200 205

His Leu Gly Thr Leu Ile Trp Glu Asp Gly Lys Val Glu Ser Tyr Pro

210 215 220

Glu Asn Trp Tyr Ser Leu Val Val Asp Ala Val Lys Arg Gly Lys Gly

225 230 235 240

Ala Leu Val Phe Val Asn Thr Arg Arg Ser Ala Glu Lys Glu Ala Leu

245 250 255

Ala Leu Ser Lys Leu Val Ser Ser His Leu Thr Lys Pro Glu Lys Arg

260 265 270

Ala Leu Glu Ser Leu Ala Ser Gln Leu Glu Asp Asn Pro Thr Ser Glu

275 280 285

Lys Leu Lys Arg Ala Leu Arg Gly Gly Val Ala Phe His His Ala Gly

290 295 300

Leu Ser Arg Val Glu Arg Thr Leu Ile Glu Asp Ala Phe Arg Glu Gly

305 310 315 320

Leu Ile Lys Val Ile Thr Ala Thr Pro Thr Leu Ser Ala Gly Val Asn

325 330 335

Leu Pro Ser Phe Arg Val Ile Ile Arg Asp Thr Lys Arg Tyr Ala Gly

340 345 350

Phe Gly Trp Thr Asp Ile Pro Val Leu Glu Ile Gln Gln Met Met Gly

355 360 365

Arg Ala Gly Arg Pro Arg Tyr Asp Lys Tyr Gly Glu Ala Ile Ile Val

370 375 380

Ala Arg Thr Asp Glu Pro Gly Lys Leu Met Glu Arg Tyr Ile Arg Gly

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<211> 799

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<213> 亨氏甲烷螺旋菌（Methanospirillum hungatei）

<400> 21

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370 375 380

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405 410 415

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<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 22

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138513901395

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<210> 23

<211> 726

<212> PRT

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<400> 23

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275 280 285

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Ser Arg Phe Lys Phe Gly Glu Arg Glu Arg Val Arg Lys Asn Trp Tyr

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Lys Phe Leu Arg Gln Ala Lys Gly Asp Phe Gly Glu Lys Asp Asp Ile

355 360 365

Gln Ile Leu Leu Ser Glu Ala Ser Glu Leu Gly Ala Lys Leu Asp Glu

370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

Ser His Asn Leu Asn Tyr Tyr Pro Ile Leu Asn Val Arg Arg Asp Met

420 425 430

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435 440 445

Asn Val Thr Glu Pro Leu Phe Asn Ser Leu Phe Ser Val Ile Leu Met

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<210> 24

<211> 439

<212> PRT

<213> 肠杆菌（Enterobacteria）噬菌体T4

<400> 24

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Lys Arg Ser Asn Ala Pro Ile Ile Asp Val Ala Thr Asp Val Arg Asn

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Gly Lys Trp Ile Tyr Asp Lys Val Val Asp Gly His Gly Val Arg Gly

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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Glu Pro Leu Phe Lys Thr Tyr Lys Ile Asp Gly Lys Pro Val Ser Glu

275 280 285

Ile Ile Phe Asn Asn Gly Gln Leu Val Arg Ile Ile Glu Ala Glu Tyr

290 295 300

Thr Ser Thr Phe Val Lys Ala Arg Gly Val Pro Gly Glu Tyr Leu Ile

305 310 315 320

Arg His Trp Asp Leu Thr Val Glu Thr Tyr Gly Asp Asp Glu Tyr Tyr

325 330 335

Arg Glu Lys Ile Lys Ile Ile Ser Ser Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Phe

340 345 350

Asn Leu Phe Leu Gly Lys Thr Ala Glu Thr Tyr Lys Asn Trp Asn Lys

355 360 365

Gly Gly Lys Ala Pro Trp Ser Asp Phe Trp Asp Ala Lys Ser Gln Phe

370 375 380

Ser Lys Val Lys Ala Leu Pro Ala Ser Thr Phe His Lys Ala Gln Gly

385 390 395 400

Met Ser Val Asp Arg Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Cys Ile His Tyr Ala

405 410 415

Asp Val Glu Leu Ala Gln Gln Leu Leu Tyr Val Gly Val Thr Arg Gly

420 425 430

Arg Tyr Asp Val Phe Tyr Val

435

<210> 25

<211> 970

<212> PRT

<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）

<400> 25

Met Leu Ser Val Ala Asn Val Arg Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Tyr

1 5 1015

Phe Ala Ser Asp Asn Tyr Tyr Ala Ser Ala Asp Ala Asp Arg Ser Gly

202530

Gln Trp Ile Gly Asp Gly Ala Lys Arg Leu Gly Leu Glu Gly Lys Val

354045

Glu Ala Arg Ala Phe Asp Ala Leu Leu Arg Gly Glu Leu Pro Asp Gly

505560

Ser Ser Val Gly Asn Pro Gly Gln Ala His Arg Pro Gly Thr Asp Leu

65707580

Thr Phe Ser Val Pro Lys Ser Trp Ser Leu Leu Ala Leu Val Gly Lys

859095

Asp Glu Arg Ile Ile Ala Ala Tyr Arg Glu Ala Val Val Glu Ala Leu

100 105 110

His Trp Ala Glu Lys Asn Ala Ala Glu Thr Arg Val Val Glu Lys Gly

115 120 125

Met Val Val Thr Gln Ala Thr Gly Asn Leu Ala Ile Gly Leu Phe Gln

130 135 140

His Asp Thr Asn Arg Asn Gln Glu Pro Asn Leu His Phe His Ala Val

145 150 155 160

Ile Ala Asn Val Thr Gln Gly Lys Asp Gly Lys Trp Arg Thr Leu Lys

165 170 175

Asn Asp Arg Leu Trp Gln Leu Asn Thr Thr Leu Asn Ser Ile Ala Met

180 185 190

Ala Arg Phe Arg Val Ala Val Glu Lys Leu Gly Tyr Glu Pro Gly Pro

195 200 205

Val Leu Lys His Gly Asn Phe Glu Ala Arg Gly Ile Ser Arg Glu Gln

210 215 220

Val Met Ala Phe Ser Thr Arg Arg Lys Glu Val Leu Glu Ala Arg Arg

225 230 235 240

Gly Pro Gly Leu Asp Ala Gly Arg Ile Ala Ala Leu Asp Thr Arg Ala

245 250 255

Ser Lys Glu Gly Ile Glu Asp Arg Ala Thr Leu Ser Lys Gln Trp Ser

260 265 270

Glu Ala Ala Gln Ser Ile Gly Leu Asp Leu Lys Pro Leu Val Asp Arg

275 280 285

Ala Arg Thr Lys Ala Leu Gly Gln Gly Met Glu Ala Thr Arg Ile Gly

290 295 300

Ser Leu Val Glu Arg Gly Arg Ala Trp Leu Ser Arg Phe Ala Ala His

305 310 315 320

Val Arg Gly Asp Pro Ala Asp Pro Leu Val Pro Pro Ser Val Leu Lys

325 330 335

Gln Asp Arg Gln Thr Ile Ala Ala Ala Gln Ala Val Ala Ser Ala Val

340 345 350

Arg His Leu Ser Gln Arg Glu Ala Ala Phe Glu Arg Thr Ala Leu Tyr

355 360 365

Lys Ala Ala Leu Asp Phe Gly Leu Pro Thr Thr Ile Ala Asp Val Glu

370 375 380

Lys Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Ser Gly Asp Leu Ile Ala Gly Lys

385 390 395 400

Gly Glu His Lys Gly Trp Leu Ala Ser Arg Asp Ala Val Val Thr Glu

405 410 415

Gln Arg Ile Leu Ser Glu Val Ala Ala Gly Lys Gly Asp Ser Ser Pro

420 425 430

Ala Ile Thr Pro Gln Lys Ala Ala Ala Ser Val Gln Ala Ala Ala Leu

435 440 445

Thr Gly Gln Gly Phe Arg Leu Asn Glu Gly Gln Leu Ala Ala Ala Arg

450 455 460

Leu Ile Leu Ile Ser Lys Asp Arg Thr Ile Ala Val Gln Gly Ile Ala

465 470 475 480

Gly Ala Gly Lys Ser Ser Val Leu Lys Pro Val Ala Glu Val Leu Arg

485 490 495

Asp Glu Gly His Pro Val Ile Gly Leu Ala Ile Gln Asn Thr Leu Val

500 505 510

Gln Met Leu Glu Arg Asp Thr Gly Ile Gly Ser Gln Thr Leu Ala Arg

515 520 525

Phe Leu Gly Gly Trp Asn Lys Leu Leu Asp Asp Pro Gly Asn Val Ala

530 535 540

Leu Arg Ala Glu Ala Gln Ala Ser Leu Lys Asp His Val Leu Val Leu

545 550 555 560

Asp Glu Ala Ser Met Val Ser Asn Glu Asp Lys Glu Lys Leu Val Arg

565 570 575

Leu Ala Asn Leu Ala Gly Val His Arg Leu Val Leu Ile Gly Asp Arg

580 585 590

Lys Gln Leu Gly Ala Val Asp Ala Gly Lys Pro Phe Ala Leu Leu Gln

595 600 605

Arg Ala Gly Ile Ala Arg Ala Glu Met Ala Thr Asn Leu Arg Ala Arg

610 615 620

Asp Pro Val Val Arg Glu Ala Gln Ala Ala Ala Gln Ala Gly Asp Val

625 630 635 640

Arg Lys Ala Leu Arg His Leu Lys Ser His Thr Val Glu Ala Arg Gly

645 650 655

Asp Gly Ala Gln Val Ala Ala Glu Thr Trp Leu Ala Leu Asp Lys Glu

660 665 670

Thr Arg Ala Arg Thr Ser Ile Tyr Ala Ser Gly Arg Ala Ile Arg Ser

675 680 685

Ala Val Asn Ala Ala Val Gln Gln Gly Leu Leu Ala Ser Arg Glu Ile

690 695 700

Gly Pro Ala Lys Met Lys Leu Glu Val Leu Asp Arg Val Asn Thr Thr

705 710 715 720

Arg Glu Glu Leu Arg His Leu Pro Ala Tyr Arg Ala Gly Arg Val Leu

725 730 735

Glu Val Ser Arg Lys Gln Gln Ala Leu Gly Leu Phe Ile Gly Glu Tyr

740 745 750

Arg Val Ile Gly Gln Asp Arg Lys Gly Lys Leu Val Glu Val Glu Asp

755 760 765

Lys Arg Gly Lys Arg Phe Arg Phe Asp Pro Ala Arg Ile Arg Ala Gly

770 775 780

Lys Gly Asp Asp Asn Leu Thr Leu Leu Glu Pro Arg Lys Leu Glu Ile

785 790 795 800

His Glu Gly Asp Arg Ile Arg Trp Thr Arg Asn Asp His Arg Arg Gly

805 810 815

Leu Phe Asn Ala Asp Gln Ala Arg Val Val Glu Ile Ala Asn Gly Lys

820 825 830

Val Thr Phe Glu Thr Ser Lys Gly Asp Leu Val Glu Leu Lys Lys Asp

835 840 845

Asp Pro Met Leu Lys Arg Ile Asp Leu Ala Tyr Ala Leu Asn Val His

850 855 860

Met Ala Gln Gly Leu Thr Ser Asp Arg Gly Ile Ala Val Met Asp Ser

865 870 875 880

Arg Glu Arg Asn Leu Ser Asn Gln Lys Thr Phe Leu Val Thr Val Thr

885 890 895

Arg Leu Arg Asp His Leu Thr Leu Val Val Asp Ser Ala Asp Lys Leu

900 905 910

Gly Ala Ala Val Ala Arg Asn Lys Gly Glu Lys Ala Ser Ala Ile Glu

915 920 925

Val Thr Gly Ser Val Lys Pro Thr Ala Thr Lys Gly Ser Gly Val Asp

930 935 940

Gln Pro Lys Ser Val Glu Ala Asn Lys Ala Glu Lys Glu Leu Thr Arg

945 950 955 960

Ser Lys Ser Lys Thr Leu Asp Phe Gly Ile

965 970

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MuA底物的双链部分的多核苷酸序列

<400> 26

gttttcgcat ttatcgtgaa acgctttcgc gtttttcgtg cgccgcttca 50

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MuA底物的双链部分的多核苷酸序列

<400> 27

caaaagcgta aatagcactt tgcgaaagcg caaaaagcac gcggcgaagu 50

<210> 28

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 双链MuA底物的突出端的多核苷酸序列

<400> 28

caaaagcgta aatagcactt tgcgaaagcg caaaaagcac gcggcgaagu ctag 54

<210> 29

<211> 3560

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1中使用的序列

<400> 29

gccatcagat tgtgtttgtt agtcgctttt tttttttgga attttttttt tggaattttt 60

tttttgcgct aacaacctcc tgccgttttg cccgtgcata tcggtcacga acaaatctga 120

ttactaaaca cagtagcctg gatttgttct atcagtaatc gaccttattc ctaattaaat 180

agagcaaatc cccttattgg gggtaagaca tgaagatgcc agaaaaacat gacctgttgg 240

ccgccattct cgcggcaaag gaacaaggca tcggggcaat ccttgcgttt gcaatggcgt 300

accttcgcgg cagatataat ggcggtgcgt ttacaaaaac agtaatcgac gcaacgatgt 360

gcgccattat cgcctagttc attcgtgacc ttctcgactt cgccggacta agtagcaatc 420

tcgcttatat aacgagcgtg tttatcggct acatcggtac tgactcgatt ggttcgctta 480

tcaaacgctt cgctgctaaa aaagccggag tagaagatgg tagaaatcaa taatcaacgt 540

aaggcgttcc tcgatatgct ggcgtggtcg gagggaactg ataacggacg tcagaaaacc 600

agaaatcatg gttatgacgt cattgtaggc ggagagctat ttactgatta ctccgatcac 660

cctcgcaaac ttgtcacgct aaacccaaaa ctcaaatcaa caggcgccgg acgctaccag 720

cttctttccc gttggtggga tgcctaccgc aagcagcttg gcctgaaaga cttctctccg 780

aaaagtcagg acgctgtggc attgcagcag attaaggagc gtggcgcttt acctatgatt 840

gatcgtggtg atatccgtca ggcaatcgac cgttgcagca atatctgggc ttcactgccg 900

ggcgctggtt atggtcagtt cgagcataag gctgacagcc tgattgcaaa attcaaagaa 960

gcgggcggaa cggtcagaga gattgatgta tgagcagagt caccgcgatt atctccgctc 1020

tggttatctg catcatcgtc tgcctgtcat gggctgttaa tcattaccgt gataacgcca 1080

ttacctacaa agcccagcgc gacaaaaatg ccagagaact gaagctggcg aacgcggcaa 1140

ttactgacat gcagatgcgt cagcgtgatg ttgctgcgct cgatgcaaaa tacacgaagg 1200

agttagctga tgctaaagct gaaaatgatg ctctgcgtga tgatgttgcc gctggtcgtc 1260

gtcggttgca catcaaagca gtctgtcagt cagtgcgtga agccaccacc gcctccggcg 1320

tggataatgc agcctccccc cgactggcag acaccgctga acgggattat ttcaccctca 1380

gagagaggct gatcactatg caaaaacaac tggaaggaac ccagaagtat attaatgagc 1440

agtgcagata gagttgccca tatcgatggg caactcatgc aattattgtg agcaatacac 1500

acgcgcttcc agcggagtat aaatgcctaa agtaataaaa ccgagcaatc catttacgaa 1560

tgtttgctgg gtttctgttt taacaacatt ttctgcgccg ccacaaattt tggctgcatc 1620

gacagttttc ttctgcccaa ttccagaaac gaagaaatga tgggtgatgg tttcctttgg 1680

tgctactgct gccggtttgt tttgaacagt aaacgtctgt tgagcacatc ctgtaataag 1740

cagggccagc gcagtagcga gtagcatttt tttcatggtg ttattcccga tgctttttga 1800

agttcgcaga atcgtatgtg tagaaaatta aacaaaccct aaacaatgag ttgaaatttc 1860

atattgttaa tatttattaa tgtatgtcag gtgcgatgaa tcgtcattgt attcccggat 1920

taactatgtc cacagccctg acggggaact tctctgcggg agtgtccggg aataattaaa 1980

acgatgcaca cagggtttag cgcgtacacg tattgcatta tgccaacgcc ccggtgctga 2040

cacggaagaa accggacgtt atgatttagc gtggaaagat ttgtgtagtg ttctgaatgc 2100

tctcagtaaa tagtaatgaa ttatcaaagg tatagtaata tcttttatgt tcatggatat 2160

ttgtaaccca tcggaaaact cctgctttag caagattttc cctgtattgc tgaaatgtga 2220

tttctcttga tttcaaccta tcataggacg tttctataag atgcgtgttt cttgagaatt 2280

taacatttac aaccttttta agtcctttta ttaacacggt gttatcgttt tctaacacga 2340

tgtgaatatt atctgtggct agatagtaaa tataatgtga gacgttgtga cgttttagtt 2400

cagaataaaa caattcacag tctaaatctt ttcgcacttg atcgaatatt tctttaaaaa 2460

tggcaacctg agccattggt aaaaccttcc atgtgatacg agggcgcgta gtttgcatta 2520

tcgtttttat cgtttcaatc tggtctgacc tccttgtgtt ttgttgatga tttatgtcaa 2580

atattaggaa tgttttcact taatagtatt ggttgcgtaa caaagtgcgg tcctgctggc 2640

attctggagg gaaatacaac cgacagatgt atgtaaggcc aacgtgctca aatcttcata 2700

cagaaagatt tgaagtaata ttttaaccgc tagatgaaga gcaagcgcat ggagcgacaa 2760

aatgaataaa gaacaatctg ctgatgatcc ctccgtggat ctgattcgtg taaaaaatat 2820

gcttaatagc accatttcta tgagttaccc tgatgttgta attgcatgta tagaacataa 2880

ggtgtctctg gaagcattca gagcaattga ggcagcgttg gtgaagcacg ataataatat 2940

gaaggattat tccctggtgg ttgactgatc accataactg ctaatcattc aaactattta 3000

gtctgtgaca gagccaacac gcagtctgtc actgtcagga aagtggtaaa actgcaactc 3060

aattactgca atgccctcgt aattaagtga atttacaata tcgtcctgtt cggagggaag 3120

aacgcgggat gttcattctt catcactttt aattgatgta tatgctctct tttctgacgt 3180

tagtctccga cggcaggctt caatgaccca ggctgagaaa ttcccggacc ctttttgctc 3240

aagagcgatg ttaatttgtt caatcatttg gttaggaaag cggatgttgc gggttgttgt 3300

tctgcgggtt ctgttcttcg ttgacatgag gttgccccgt attcagtgtc gctgatttgt 3360

attgtctgaa gttgttttta cgttaagttg atgcagatca attaatacga tacctgcgtc 3420

ataattgatt atttgacgtg gtttgatggc ctccacgcac gttgtgatat gtagatgata 3480

atcattatca ctttacgggt cctttccggt gaaaaaaaag gtaccaaaaa aaacatcgtc 3540

gtgagtagtg aaccgtaagc 3560

<210> 30

<211> 3560

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1中使用的序列

<400> 30

gcttacggtt cactactcac gacgatgttt tttttggtac cttttttttc accggaaagg 60

acccgtaaag tgataatgat tatcatctac atatcacaac gtgcgtggag gccatcaaac 120

cacgtcaaat aatcaattat gacgcaggta tcgtattaat tgatctgcat caacttaacg 180

taaaaacaac ttcagacaat acaaatcagc gacactgaat acggggcaac ctcatgtcaa 240

cgaagaacag aacccgcaga acaacaaccc gcaacatccg ctttcctaac caaatgattg 300

aacaaattaa catcgctctt gagcaaaaag ggtccgggaa tttctcagcc tgggtcattg 360

aagcctgccg tcggagacta acgtcagaaa agagagcata tacatcaatt aaaagtgatg 420

aagaatgaac atcccgcgtt cttccctccg aacaggacga tattgtaaat tcacttaatt 480

acgagggcat tgcagtaatt gagttgcagt tttaccactt tcctgacagt gacagactgc 540

gtgttggctc tgtcacagac taaatagttt gaatgattag cagttatggt gatcagtcaa 600

ccaccaggga ataatccttc atattattat cgtgcttcac caacgctgcc tcaattgctc 660

tgaatgcttc cagagacacc ttatgttcta tacatgcaat tacaacatca gggtaactca 720

tagaaatggt gctattaagc atatttttta cacgaatcag atccacggag ggatcatcag 780

cagattgttc tttattcatt ttgtcgctcc atgcgcttgc tcttcatcta gcggttaaaa 840

tattacttca aatctttctg tatgaagatt tgagcacgtt ggccttacat acatctgtcg 900

gttgtatttc cctccagaat gccagcagga ccgcactttg ttacgcaacc aatactatta 960

agtgaaaaca ttcctaatat ttgacataaa tcatcaacaa aacacaagga ggtcagacca 1020

gattgaaacg ataaaaacga taatgcaaac tacgcgccct cgtatcacat ggaaggtttt 1080

accaatggct caggttgcca tttttaaaga aatattcgat caagtgcgaa aagatttaga 1140

ctgtgaattg ttttattctg aactaaaacg tcacaacgtc tcacattata tttactatct 1200

agccacagat aatattcaca tcgtgttaga aaacgataac accgtgttaa taaaaggact 1260

taaaaaggtt gtaaatgtta aattctcaag aaacacgcat cttatagaaa cgtcctatga 1320

taggttgaaa tcaagagaaa tcacatttca gcaatacagg gaaaatcttg ctaaagcagg 1380

agttttccga tgggttacaa atatccatga acataaaaga tattactata cctttgataa 1440

ttcattacta tttactgaga gcattcagaa cactacacaa atctttccac gctaaatcat 1500

aacgtccggt ttcttccgtg tcagcaccgg ggcgttggca taatgcaata cgtgtacgcg 1560

ctaaaccctg tgtgcatcgt tttaattatt cccggacact cccgcagaga agttccccgt 1620

cagggctgtg gacatagtta atccgggaat acaatgacga ttcatcgcac ctgacataca 1680

ttaataaata ttaacaatat gaaatttcaa ctcattgttt agggtttgtt taattttcta 1740

cacatacgat tctgcgaact tcaaaaagca tcgggaataa caccatgaaa aaaatgctac 1800

tcgctactgc gctggccctg cttattacag gatgtgctca acagacgttt actgttcaaa 1860

acaaaccggc agcagtagca ccaaaggaaa ccatcaccca tcatttcttc gtttctggaa 1920

ttgggcagaa gaaaactgtc gatgcagcca aaatttgtgg cggcgcagaa aatgttgtta 1980

aaacagaaac ccagcaaaca ttcgtaaatg gattgctcgg ttttattact ttaggcattt 2040

atactccgct ggaagcgcgt gtgtattgct cacaataatt gcatgagttg cccatcgata 2100

tgggcaactc tatctgcact gctcattaat atacttctgg gttccttcca gttgtttttg 2160

catagtgatc agcctctctc tgagggtgaa ataatcccgt tcagcggtgt ctgccagtcg 2220

gggggaggct gcattatcca cgccggaggc ggtggtggct tcacgcactg actgacagac 2280

tgctttgatg tgcaaccgac gacgaccagc ggcaacatca tcacgcagag catcattttc 2340

agctttagca tcagctaact ccttcgtgta ttttgcatcg agcgcagcaa catcacgctg 2400

acgcatctgc atgtcagtaa ttgccgcgtt cgccagcttc agttctctgg catttttgtc 2460

gcgctgggct ttgtaggtaa tggcgttatc acggtaatga ttaacagccc atgacaggca 2520

gacgatgatg cagataacca gagcggagat aatcgcggtg actctgctca tacatcaatc 2580

tctctgaccg ttccgcccgc ttctttgaat tttgcaatca ggctgtcagc cttatgctcg 2640

aactgaccat aaccagcgcc cggcagtgaa gcccagatat tgctgcaacg gtcgattgcc 2700

tgacggatat caccacgatc aatcataggt aaagcgccac gctccttaat ctgctgcaat 2760

gccacagcgt cctgactttt cggagagaag tctttcaggc caagctgctt gcggtaggca 2820

tcccaccaac gggaaagaag ctggtagcgt ccggcgcctg ttgatttgag ttttgggttt 2880

agcgtgacaa gtttgcgagg gtgatcggag taatcagtaa atagctctcc gcctacaatg 2940

acgtcataac catgatttct ggttttctga cgtccgttat cagttccctc cgaccacgcc 3000

agcatatcga ggaacgcctt acgttgatta ttgatttcta ccatcttcta ctccggcttt 3060

tttagcagcg aagcgtttga taagcgaacc aatcgagtca gtaccgatgt agccgataaa 3120

cacgctcgtt atataagcga gattgctact tagtccggcg aagtcgagaa ggtcacgaat 3180

gaactaggcg ataatggcgc acatcgttgc gtcgattact gtttttgtaa acgcaccgcc 3240

attatatctg ccgcgaaggt acgccattgc aaacgcaagg attgccccga tgccttgttc 3300

ctttgccgcg agaatggcgg ccaacaggtc atgtttttct ggcatcttca tgtcttaccc 3360

ccaataaggg gatttgctct atttaattag gaataaggtc gattactgat agaacaaatc 3420

caggctactg tgtttagtaa tcagatttgt tcgtgaccga tatgcacggg caaaacggca 3480

ggaggttgtt agcgcaaaaa aaaaattcca aaaaaaaaat tccaaaaaaa aaaagcgact 3540

aacaaacaca atctgatggc 3560

<210> 31

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1中使用的序列

<400> 31

gccatcagat tgtgtttgtt agtcgctttt tttttttgga attttttttt tggaattttt 60

tttttgcgct aacaacctcc tgccg 85

<210> 32

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1中使用的序列

<400> 32

gcttacggtt cactactcac gacgatgttt tttttggtac cttttttttc accggaaagg 60

acccgtaaag tg 72

<210> 33

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1、2和3中使用的序列

<400> 33

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttt 46

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1、2和3中使用的序列

<400> 34

ggttgtttct gttggtgctg atattgc 27

<210> 35

<211> 3587

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1、2和3中使用的序列

<400> 35

gccatcagat tgtgtttgtt agtcgctgcc atcagattgt gtttgttagt cgcttttttt 60

ttttggaatt ttttttttgg aatttttttt ttgcgctaac aacctcctgc cgttttgccc 120

gtgcatatcg gtcacgaaca aatctgatta ctaaacacag tagcctggat ttgttctatc 180

agtaatcgac cttattccta attaaataga gcaaatcccc ttattggggg taagacatga 240

agatgccaga aaaacatgac ctgttggccg ccattctcgc ggcaaaggaa caaggcatcg 300

gggcaatcct tgcgtttgca atggcgtacc ttcgcggcag atataatggc ggtgcgttta 360

caaaaacagt aatcgacgca acgatgtgcg ccattatcgc ctagttcatt cgtgaccttc 420

tcgacttcgc cggactaagt agcaatctcg cttatataac gagcgtgttt atcggctaca 480

tcggtactga ctcgattggt tcgcttatca aacgcttcgc tgctaaaaaa gccggagtag 540

aagatggtag aaatcaataa tcaacgtaag gcgttcctcg atatgctggc gtggtcggag 600

ggaactgata acggacgtca gaaaaccaga aatcatggtt atgacgtcat tgtaggcgga 660

gagctattta ctgattactc cgatcaccct cgcaaacttg tcacgctaaa cccaaaactc 720

aaatcaacag gcgccggacg ctaccagctt ctttcccgtt ggtgggatgc ctaccgcaag 780

cagcttggcc tgaaagactt ctctccgaaa agtcaggacg ctgtggcatt gcagcagatt 840

aaggagcgtg gcgctttacc tatgattgat cgtggtgata tccgtcaggc aatcgaccgt 900

tgcagcaata tctgggcttc actgccgggc gctggttatg gtcagttcga gcataaggct 960

gacagcctga ttgcaaaatt caaagaagcg ggcggaacgg tcagagagat tgatgtatga 1020

gcagagtcac cgcgattatc tccgctctgg ttatctgcat catcgtctgc ctgtcatggg 1080

ctgttaatca ttaccgtgat aacgccatta cctacaaagc ccagcgcgac aaaaatgcca 1140

gagaactgaa gctggcgaac gcggcaatta ctgacatgca gatgcgtcag cgtgatgttg 1200

ctgcgctcga tgcaaaatac acgaaggagt tagctgatgc taaagctgaa aatgatgctc 1260

tgcgtgatga tgttgccgct ggtcgtcgtc ggttgcacat caaagcagtc tgtcagtcag 1320

tgcgtgaagc caccaccgcc tccggcgtgg ataatgcagc ctccccccga ctggcagaca 1380

ccgctgaacg ggattatttc accctcagag agaggctgat cactatgcaa aaacaactgg 1440

aaggaaccca gaagtatatt aatgagcagt gcagatagag ttgcccatat cgatgggcaa 1500

ctcatgcaat tattgtgagc aatacacacg cgcttccagc ggagtataaa tgcctaaagt 1560

aataaaaccg agcaatccat ttacgaatgt ttgctgggtt tctgttttaa caacattttc 1620

tgcgccgcca caaattttgg ctgcatcgac agttttcttc tgcccaattc cagaaacgaa 1680

gaaatgatgg gtgatggttt cctttggtgc tactgctgcc ggtttgtttt gaacagtaaa 1740

cgtctgttga gcacatcctg taataagcag ggccagcgca gtagcgagta gcattttttt 1800

catggtgtta ttcccgatgc tttttgaagt tcgcagaatc gtatgtgtag aaaattaaac 1860

aaaccctaaa caatgagttg aaatttcata ttgttaatat ttattaatgt atgtcaggtg 1920

cgatgaatcg tcattgtatt cccggattaa ctatgtccac agccctgacg gggaacttct 1980

ctgcgggagt gtccgggaat aattaaaacg atgcacacag ggtttagcgc gtacacgtat 2040

tgcattatgc caacgccccg gtgctgacac ggaagaaacc ggacgttatg atttagcgtg 2100

gaaagatttg tgtagtgttc tgaatgctct cagtaaatag taatgaatta tcaaaggtat 2160

agtaatatct tttatgttca tggatatttg taacccatcg gaaaactcct gctttagcaa 2220

gattttccct gtattgctga aatgtgattt ctcttgattt caacctatca taggacgttt 2280

ctataagatg cgtgtttctt gagaatttaa catttacaac ctttttaagt ccttttatta 2340

acacggtgtt atcgttttct aacacgatgt gaatattatc tgtggctaga tagtaaatat 2400

aatgtgagac gttgtgacgt tttagttcag aataaaacaa ttcacagtct aaatcttttc 2460

gcacttgatc gaatatttct ttaaaaatgg caacctgagc cattggtaaa accttccatg 2520

tgatacgagg gcgcgtagtt tgcattatcg tttttatcgt ttcaatctgg tctgacctcc 2580

ttgtgttttg ttgatgattt atgtcaaata ttaggaatgt tttcacttaa tagtattggt 2640

tgcgtaacaa agtgcggtcc tgctggcatt ctggagggaa atacaaccga cagatgtatg 2700

taaggccaac gtgctcaaat cttcatacag aaagatttga agtaatattt taaccgctag 2760

atgaagagca agcgcatgga gcgacaaaat gaataaagaa caatctgctg atgatccctc 2820

cgtggatctg attcgtgtaa aaaatatgct taatagcacc atttctatga gttaccctga 2880

tgttgtaatt gcatgtatag aacataaggt gtctctggaa gcattcagag caattgaggc 2940

agcgttggtg aagcacgata ataatatgaa ggattattcc ctggtggttg actgatcacc 3000

ataactgcta atcattcaaa ctatttagtc tgtgacagag ccaacacgca gtctgtcact 3060

gtcaggaaag tggtaaaact gcaactcaat tactgcaatg ccctcgtaat taagtgaatt 3120

tacaatatcg tcctgttcgg agggaagaac gcgggatgtt cattcttcat cacttttaat 3180

tgatgtatat gctctctttt ctgacgttag tctccgacgg caggcttcaa tgacccaggc 3240

tgagaaattc ccggaccctt tttgctcaag agcgatgtta atttgttcaa tcatttggtt 3300

aggaaagcgg atgttgcggg ttgttgttct gcgggttctg ttcttcgttg acatgaggtt 3360

gccccgtatt cagtgtcgct gatttgtatt gtctgaagtt gtttttacgt taagttgatg 3420

cagatcaatt aatacgatac ctgcgtcata attgattatt tgacgtggtt tgatggcctc 3480

cacgcacgtt gtgatatgta gatgataatc attatcactt tacgggtcct ttccggtgaa 3540

aaaaaaggta ccaaaaaaaa catcgtcgtg agtagtgaac cgtaagc 3587

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1、2和3中使用的序列

<400> 36

gccatcagat tgtgtttgtt agtcgct 27

<210> 37

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1、2和3中使用的序列

<400> 37

acactgattg acacggttta gtagaac 27

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1、2和3中使用的序列

<400> 38

gcttacggtt cactactcac gacgatg 27

<210> 39

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1、2和3中使用的序列

<400> 39

gcaatatcag caccaacaga aacaacctt 29

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1、2和3中使用的序列

<400> 40

gttctactaa accgtgtcaa tcagtgtc 28

<210> 41

<211> 3560

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1、2和3中使用的序列

<400> 41

gcttacggtt cactactcac gacgatgttt tttttggtac cttttttttc accggaaagg 60

acccgtaaag tgataatgat tatcatctac atatcacaac gtgcgtggag gccatcaaac 120

cacgtcaaat aatcaattat gacgcaggta tcgtattaat tgatctgcat caacttaacg 180

taaaaacaac ttcagacaat acaaatcagc gacactgaat acggggcaac ctcatgtcaa 240

cgaagaacag aacccgcaga acaacaaccc gcaacatccg ctttcctaac caaatgattg 300

aacaaattaa catcgctctt gagcaaaaag ggtccgggaa tttctcagcc tgggtcattg 360

aagcctgccg tcggagacta acgtcagaaa agagagcata tacatcaatt aaaagtgatg 420

aagaatgaac atcccgcgtt cttccctccg aacaggacga tattgtaaat tcacttaatt 480

acgagggcat tgcagtaatt gagttgcagt tttaccactt tcctgacagt gacagactgc 540

gtgttggctc tgtcacagac taaatagttt gaatgattag cagttatggt gatcagtcaa 600

ccaccaggga ataatccttc atattattat cgtgcttcac caacgctgcc tcaattgctc 660

tgaatgcttc cagagacacc ttatgttcta tacatgcaat tacaacatca gggtaactca 720

tagaaatggt gctattaagc atatttttta cacgaatcag atccacggag ggatcatcag 780

cagattgttc tttattcatt ttgtcgctcc atgcgcttgc tcttcatcta gcggttaaaa 840

tattacttca aatctttctg tatgaagatt tgagcacgtt ggccttacat acatctgtcg 900

gttgtatttc cctccagaat gccagcagga ccgcactttg ttacgcaacc aatactatta 960

agtgaaaaca ttcctaatat ttgacataaa tcatcaacaa aacacaagga ggtcagacca 1020

gattgaaacg ataaaaacga taatgcaaac tacgcgccct cgtatcacat ggaaggtttt 1080

accaatggct caggttgcca tttttaaaga aatattcgat caagtgcgaa aagatttaga 1140

ctgtgaattg ttttattctg aactaaaacg tcacaacgtc tcacattata tttactatct 1200

agccacagat aatattcaca tcgtgttaga aaacgataac accgtgttaa taaaaggact 1260

taaaaaggtt gtaaatgtta aattctcaag aaacacgcat cttatagaaa cgtcctatga 1320

taggttgaaa tcaagagaaa tcacatttca gcaatacagg gaaaatcttg ctaaagcagg 1380

agttttccga tgggttacaa atatccatga acataaaaga tattactata cctttgataa 1440

ttcattacta tttactgaga gcattcagaa cactacacaa atctttccac gctaaatcat 1500

aacgtccggt ttcttccgtg tcagcaccgg ggcgttggca taatgcaata cgtgtacgcg 1560

ctaaaccctg tgtgcatcgt tttaattatt cccggacact cccgcagaga agttccccgt 1620

cagggctgtg gacatagtta atccgggaat acaatgacga ttcatcgcac ctgacataca 1680

ttaataaata ttaacaatat gaaatttcaa ctcattgttt agggtttgtt taattttcta 1740

cacatacgat tctgcgaact tcaaaaagca tcgggaataa caccatgaaa aaaatgctac 1800

tcgctactgc gctggccctg cttattacag gatgtgctca acagacgttt actgttcaaa 1860

acaaaccggc agcagtagca ccaaaggaaa ccatcaccca tcatttcttc gtttctggaa 1920

ttgggcagaa gaaaactgtc gatgcagcca aaatttgtgg cggcgcagaa aatgttgtta 1980

aaacagaaac ccagcaaaca ttcgtaaatg gattgctcgg ttttattact ttaggcattt 2040

atactccgct ggaagcgcgt gtgtattgct cacaataatt gcatgagttg cccatcgata 2100

tgggcaactc tatctgcact gctcattaat atacttctgg gttccttcca gttgtttttg 2160

catagtgatc agcctctctc tgagggtgaa ataatcccgt tcagcggtgt ctgccagtcg 2220

gggggaggct gcattatcca cgccggaggc ggtggtggct tcacgcactg actgacagac 2280

tgctttgatg tgcaaccgac gacgaccagc ggcaacatca tcacgcagag catcattttc 2340

agctttagca tcagctaact ccttcgtgta ttttgcatcg agcgcagcaa catcacgctg 2400

acgcatctgc atgtcagtaa ttgccgcgtt cgccagcttc agttctctgg catttttgtc 2460

gcgctgggct ttgtaggtaa tggcgttatc acggtaatga ttaacagccc atgacaggca 2520

gacgatgatg cagataacca gagcggagat aatcgcggtg actctgctca tacatcaatc 2580

tctctgaccg ttccgcccgc ttctttgaat tttgcaatca ggctgtcagc cttatgctcg 2640

aactgaccat aaccagcgcc cggcagtgaa gcccagatat tgctgcaacg gtcgattgcc 2700

tgacggatat caccacgatc aatcataggt aaagcgccac gctccttaat ctgctgcaat 2760

gccacagcgt cctgactttt cggagagaag tctttcaggc caagctgctt gcggtaggca 2820

tcccaccaac gggaaagaag ctggtagcgt ccggcgcctg ttgatttgag ttttgggttt 2880

agcgtgacaa gtttgcgagg gtgatcggag taatcagtaa atagctctcc gcctacaatg 2940

acgtcataac catgatttct ggttttctga cgtccgttat cagttccctc cgaccacgcc 3000

agcatatcga ggaacgcctt acgttgatta ttgatttcta ccatcttcta ctccggcttt 3060

tttagcagcg aagcgtttga taagcgaacc aatcgagtca gtaccgatgt agccgataaa 3120

cacgctcgtt atataagcga gattgctact tagtccggcg aagtcgagaa ggtcacgaat 3180

gaactaggcg ataatggcgc acatcgttgc gtcgattact gtttttgtaa acgcaccgcc 3240

attatatctg ccgcgaaggt acgccattgc aaacgcaagg attgccccga tgccttgttc 3300

ctttgccgcg agaatggcgg ccaacaggtc atgtttttct ggcatcttca tgtcttaccc 3360

ccaataaggg gatttgctct atttaattag gaataaggtc gattactgat agaacaaatc 3420

caggctactg tgtttagtaa tcagatttgt tcgtgaccga tatgcacggg caaaacggca 3480

ggaggttgtt agcgcaaaaa aaaaattcca aaaaaaaaat tccaaaaaaa aaaagcgact 3540

aacaaacaca atctgatggc 3560

<210> 42

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例4中使用的序列

<400> 42

ttgcaatatc agcaccaaca gaaacaacct t 31

<210> 43

<211> 48502

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例5中使用的序列

<400> 43

gggcggcgac ctcgcgggtt ttcgctattt atgaaaattt tccggtttaa ggcgtttccg 60

ttcttcttcg tcataactta atgtttttat ttaaaatacc ctctgaaaag aaaggaaacg 120

acaggtgctg aaagcgaggc tttttggcct ctgtcgtttc ctttctctgt ttttgtccgt 180

ggaatgaaca atggaagtca acaaaaagca gctggctgac attttcggtg cgagtatccg 240

taccattcag aactggcagg aacagggaat gcccgttctg cgaggcggtg gcaagggtaa 300

tgaggtgctt tatgactctg ccgccgtcat aaaatggtat gccgaaaggg atgctgaaat 360

tgagaacgaa aagctgcgcc gggaggttga agaactgcgg caggccagcg aggcagatct 420

ccagccagga actattgagt acgaacgcca tcgacttacg cgtgcgcagg ccgacgcaca 480

ggaactgaag aatgccagag actccgctga agtggtggaa accgcattct gtactttcgt 540

gctgtcgcgg atcgcaggtg aaattgccag tattctcgac gggctccccc tgtcggtgca 600

gcggcgtttt ccggaactgg aaaaccgaca tgttgatttc ctgaaacggg atatcatcaa 660

agccatgaac aaagcagccg cgctggatga actgataccg gggttgctga gtgaatatat 720

cgaacagtca ggttaacagg ctgcggcatt ttgtccgcgc cgggcttcgc tcactgttca 780

ggccggagcc acagaccgcc gttgaatggg cggatgctaa ttactatctc ccgaaagaat 840

ccgcatacca ggaagggcgc tgggaaacac tgccctttca gcgggccatc atgaatgcga 900

tgggcagcga ctacatccgt gaggtgaatg tggtgaagtc tgcccgtgtc ggttattcca 960

aaatgctgct gggtgtttat gcctacttta tagagcataa gcagcgcaac acccttatct 1020

ggttgccgac ggatggtgat gccgagaact ttatgaaaac ccacgttgag ccgactattc 1080

gtgatattcc gtcgctgctg gcgctggccc cgtggtatgg caaaaagcac cgggataaca 1140

cgctcaccat gaagcgtttc actaatgggc gtggcttctg gtgcctgggc ggtaaagcgg 1200

caaaaaacta ccgtgaaaag tcggtggatg tggcgggtta tgatgaactt gctgcttttg 1260

atgatgatat tgaacaggaa ggctctccga cgttcctggg tgacaagcgt attgaaggct 1320

cggtctggcc aaagtccatc cgtggctcca cgccaaaagt gagaggcacc tgtcagattg 1380

agcgtgcagc cagtgaatcc ccgcatttta tgcgttttca tgttgcctgc ccgcattgcg 1440

gggaggagca gtatcttaaa tttggcgaca aagagacgcc gtttggcctc aaatggacgc 1500

cggatgaccc ctccagcgtg ttttatctct gcgagcataa tgcctgcgtc atccgccagc 1560

aggagctgga ctttactgat gcccgttata tctgcgaaaa gaccgggatc tggacccgtg 1620

atggcattct ctggttttcg tcatccggtg aagagattga gccacctgac agtgtgacct 1680

ttcacatctg gacagcgtac agcccgttca ccacctgggt gcagattgtc aaagactgga 1740

tgaaaacgaa aggggatacg ggaaaacgta aaaccttcgt aaacaccacg ctcggtgaga 1800

cgtgggaggc gaaaattggc gaacgtccgg atgctgaagt gatggcagag cggaaagagc 1860

attattcagc gcccgttcct gaccgtgtgg cttacctgac cgccggtatc gactcccagc 1920

tggaccgcta cgaaatgcgc gtatggggat gggggccggg tgaggaaagc tggctgattg 1980

accggcagat tattatgggc cgccacgacg atgaacagac gctgctgcgt gtggatgagg 2040

ccatcaataa aacctatacc cgccggaatg gtgcagaaat gtcgatatcc cgtatctgct 2100

gggatactgg cgggattgac ccgaccattg tgtatgaacg ctcgaaaaaa catgggctgt 2160

tccgggtgat ccccattaaa ggggcatccg tctacggaaa gccggtggcc agcatgccac 2220

gtaagcgaaa caaaaacggg gtttacctta ccgaaatcgg tacggatacc gcgaaagagc 2280

agatttataa ccgcttcaca ctgacgccgg aaggggatga accgcttccc ggtgccgttc 2340

acttcccgaa taacccggat atttttgatc tgaccgaagc gcagcagctg actgctgaag 2400

agcaggtcga aaaatgggtg gatggcagga aaaaaatact gtgggacagc aaaaagcgac 2460

gcaatgaggc actcgactgc ttcgtttatg cgctggcggc gctgcgcatc agtatttccc 2520

gctggcagct ggatctcagt gcgctgctgg cgagcctgca ggaagaggat ggtgcagcaa 2580

ccaacaagaa aacactggca gattacgccc gtgccttatc cggagaggat gaatgacgcg 2640

acaggaagaa cttgccgctg cccgtgcggc actgcatgac ctgatgacag gtaaacgggt 2700

ggcaacagta cagaaagacg gacgaagggt ggagtttacg gccacttccg tgtctgacct 2760

gaaaaaatat attgcagagc tggaagtgca gaccggcatg acacagcgac gcaggggacc 2820

tgcaggattt tatgtatgaa aacgcccacc attcccaccc ttctggggcc ggacggcatg 2880

acatcgctgc gcgaatatgc cggttatcac ggcggtggca gcggatttgg agggcagttg 2940

cggtcgtgga acccaccgag tgaaagtgtg gatgcagccc tgttgcccaa ctttacccgt 3000

ggcaatgccc gcgcagacga tctggtacgc aataacggct atgccgccaa cgccatccag 3060

ctgcatcagg atcatatcgt cgggtctttt ttccggctca gtcatcgccc aagctggcgc 3120

tatctgggca tcggggagga agaagcccgt gccttttccc gcgaggttga agcggcatgg 3180

aaagagtttg ccgaggatga ctgctgctgc attgacgttg agcgaaaacg cacgtttacc 3240

atgatgattc gggaaggtgt ggccatgcac gcctttaacg gtgaactgtt cgttcaggcc 3300

acctgggata ccagttcgtc gcggcttttc cggacacagt tccggatggt cagcccgaag 3360

cgcatcagca acccgaacaa taccggcgac agccggaact gccgtgccgg tgtgcagatt 3420

aatgacagcg gtgcggcgct gggatattac gtcagcgagg acgggtatcc tggctggatg 3480

ccgcagaaat ggacatggat accccgtgag ttacccggcg ggcgcgcctc gttcattcac 3540

gtttttgaac ccgtggagga cgggcagact cgcggtgcaa atgtgtttta cagcgtgatg 3600

gagcagatga agatgctcga cacgctgcag aacacgcagc tgcagagcgc cattgtgaag 3660

gcgatgtatg ccgccaccat tgagagtgag ctggatacgc agtcagcgat ggattttatt 3720

ctgggcgcga acagtcagga gcagcgggaa aggctgaccg gctggattgg tgaaattgcc 3780

gcgtattacg ccgcagcgcc ggtccggctg ggaggcgcaa aagtaccgca cctgatgccg 3840

ggtgactcac tgaacctgca gacggctcag gatacggata acggctactc cgtgtttgag 3900

cagtcactgc tgcggtatat cgctgccggg ctgggtgtct cgtatgagca gctttcccgg 3960

aattacgccc agatgagcta ctccacggca cgggccagtg cgaacgagtc gtgggcgtac 4020

tttatggggc ggcgaaaatt cgtcgcatcc cgtcaggcga gccagatgtt tctgtgctgg 4080

ctggaagagg ccatcgttcg ccgcgtggtg acgttacctt caaaagcgcg cttcagtttt 4140

caggaagccc gcagtgcctg ggggaactgc gactggatag gctccggtcg tatggccatc 4200

gatggtctga aagaagttca ggaagcggtg atgctgatag aagccggact gagtacctac 4260

gagaaagagt gcgcaaaacg cggtgacgac tatcaggaaa tttttgccca gcaggtccgt 4320

gaaacgatgg agcgccgtgc agccggtctt aaaccgcccg cctgggcggc tgcagcattt 4380

gaatccgggc tgcgacaatc aacagaggag gagaagagtg acagcagagc tgcgtaatct 4440

cccgcatatt gccagcatgg cctttaatga gccgctgatg cttgaacccg cctatgcgcg 4500

ggttttcttt tgtgcgcttg caggccagct tgggatcagc agcctgacgg atgcggtgtc 4560

cggcgacagc ctgactgccc aggaggcact cgcgacgctg gcattatccg gtgatgatga 4620

cggaccacga caggcccgca gttatcaggt catgaacggc atcgccgtgc tgccggtgtc 4680

cggcacgctg gtcagccgga cgcgggcgct gcagccgtac tcggggatga ccggttacaa 4740

cggcattatc gcccgtctgc aacaggctgc cagcgatccg atggtggacg gcattctgct 4800

cgatatggac acgcccggcg ggatggtggc gggggcattt gactgcgctg acatcatcgc 4860

ccgtgtgcgt gacataaaac cggtatgggc gcttgccaac gacatgaact gcagtgcagg 4920

tcagttgctt gccagtgccg cctcccggcg tctggtcacg cagaccgccc ggacaggctc 4980

catcggcgtc atgatggctc acagtaatta cggtgctgcg ctggagaaac agggtgtgga 5040

aatcacgctg atttacagcg gcagccataa ggtggatggc aacccctaca gccatcttcc 5100

ggatgacgtc cgggagacac tgcagtcccg gatggacgca acccgccaga tgtttgcgca 5160

gaaggtgtcg gcatataccg gcctgtccgt gcaggttgtg ctggataccg aggctgcagt 5220

gtacagcggt caggaggcca ttgatgccgg actggctgat gaacttgtta acagcaccga 5280

tgcgatcacc gtcatgcgtg atgcactgga tgcacgtaaa tcccgtctct caggagggcg 5340

aatgaccaaa gagactcaat caacaactgt ttcagccact gcttcgcagg ctgacgttac 5400

tgacgtggtg ccagcgacgg agggcgagaa cgccagcgcg gcgcagccgg acgtgaacgc 5460

gcagatcacc gcagcggttg cggcagaaaa cagccgcatt atggggatcc tcaactgtga 5520

ggaggctcac ggacgcgaag aacaggcacg cgtgctggca gaaacccccg gtatgaccgt 5580

gaaaacggcc cgccgcattc tggccgcagc accacagagt gcacaggcgc gcagtgacac 5640

tgcgctggat cgtctgatgc agggggcacc ggcaccgctg gctgcaggta acccggcatc 5700

tgatgccgtt aacgatttgc tgaacacacc agtgtaaggg atgtttatga cgagcaaaga 5760

aacctttacc cattaccagc cgcagggcaa cagtgacccg gctcataccg caaccgcgcc 5820

cggcggattg agtgcgaaag cgcctgcaat gaccccgctg atgctggaca cctccagccg 5880

taagctggtt gcgtgggatg gcaccaccga cggtgctgcc gttggcattc ttgcggttgc 5940

tgctgaccag accagcacca cgctgacgtt ctacaagtcc ggcacgttcc gttatgagga 6000

tgtgctctgg ccggaggctg ccagcgacga gacgaaaaaa cggaccgcgt ttgccggaac 6060

ggcaatcagc atcgtttaac tttacccttc atcactaaag gccgcctgtg cggctttttt 6120

tacgggattt ttttatgtcg atgtacacaa ccgcccaact gctggcggca aatgagcaga 6180

aatttaagtt tgatccgctg tttctgcgtc tctttttccg tgagagctat cccttcacca 6240

cggagaaagt ctatctctca caaattccgg gactggtaaa catggcgctg tacgtttcgc 6300

cgattgtttc cggtgaggtt atccgttccc gtggcggctc cacctctgaa tttacgccgg 6360

gatatgtcaa gccgaagcat gaagtgaatc cgcagatgac cctgcgtcgc ctgccggatg 6420

aagatccgca gaatctggcg gacccggctt accgccgccg tcgcatcatc atgcagaaca 6480

tgcgtgacga agagctggcc attgctcagg tcgaagagat gcaggcagtt tctgccgtgc 6540

ttaagggcaa atacaccatg accggtgaag ccttcgatcc ggttgaggtg gatatgggcc 6600

gcagtgagga gaataacatc acgcagtccg gcggcacgga gtggagcaag cgtgacaagt 6660

ccacgtatga cccgaccgac gatatcgaag cctacgcgct gaacgccagc ggtgtggtga 6720

atatcatcgt gttcgatccg aaaggctggg cgctgttccg ttccttcaaa gccgtcaagg 6780

agaagctgga tacccgtcgt ggctctaatt ccgagctgga gacagcggtg aaagacctgg 6840

gcaaagcggt gtcctataag gggatgtatg gcgatgtggc catcgtcgtg tattccggac 6900

agtacgtgga aaacggcgtc aaaaagaact tcctgccgga caacacgatg gtgctgggga 6960

acactcaggc acgcggtctg cgcacctatg gctgcattca ggatgcggac gcacagcgcg 7020

aaggcattaa cgcctctgcc cgttacccga aaaactgggt gaccaccggc gatccggcgc 7080

gtgagttcac catgattcag tcagcaccgc tgatgctgct ggctgaccct gatgagttcg 7140

tgtccgtaca actggcgtaa tcatggccct tcggggccat tgtttctctg tggaggagtc 7200

catgacgaaa gatgaactga ttgcccgtct ccgctcgctg ggtgaacaac tgaaccgtga 7260

tgtcagcctg acggggacga aagaagaact ggcgctccgt gtggcagagc tgaaagagga 7320

gcttgatgac acggatgaaa ctgccggtca ggacacccct ctcagccggg aaaatgtgct 7380

gaccggacat gaaaatgagg tgggatcagc gcagccggat accgtgattc tggatacgtc 7440

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ggaacgtcag ccaccattac atccggtgag cagtcaggtg cggtgatacg tggtgttttt 7740

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tccctgtttg tccggactga tgaggtgcgg cagctgcggc gtggagacac gctgaccatc 7860

ggtgaggaaa atttctgggt agatcgggtt tcgccggatg atggcggaag ttgtcatctc 7920

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aaagggccac ggtcaaaaat ccgcaggcca gaatcaaagt taaccggggg gatttgcccg 8220

taatcaagct gggtaatgcg cgggttgtcc tttcgcgccg caggcgtcgt aaaaaggggc 8280

agcgttcatc cctgaaaggt ggcggcagcg tgcttgtggt gggtaaccgt cgtattcccg 8340

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tcaggtgccg gattcagagc tggatgcgtg gatggagtcc cggatttatc cggtgatgag 8820

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aatgtgagga cgctatgcct gtaccaaatc ctacaatgcc ggtgaaaggt gccgggacca 9000

ccctgtgggt ttataagggg agcggtgacc cttacgcgaa tccgctttca gacgttgact 9060

ggtcgcgtct ggcaaaagtt aaagacctga cgcccggcga actgaccgct gagtcctatg 9120

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tgctggcgtg gtttaatgaa ggcgataccc gtgcctataa aatccgcttc ccgaacggca 9300

cggtcgatgt gttccgtggc tgggtcagca gtatcggtaa ggcggtgacg gcgaaggaag 9360

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gcacggtaac agcggcaacc ggcatgaccg tgacgcctgc cagcacctcg gtggtgaaag 9480

ggcagagcac cacgctgacc gtggccttcc agccggaggg cgtaaccgac aagagctttc 9540

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agcgcattga gcatctcgcc ctgatgaaac ggcaggcaga acaggcggag tcagacagca 9840

accggaagtt tactgtggaa gacgccatca gaaccggcgc gtttctggtg gcgatgtccc 9900

tgtggcataa ccatccgcag aagacgcaga tgccgtccat gaatgaagcc gttaaacaga 9960

ttgagcagga agtgcttacc acctggccca cggaggcaat ttctcatgct gaaaacgtgg 10020

tgtaccggct gtctggtatg tatgagtttg tggtgaataa tgcccctgaa cagacagagg 10080

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ccgccatgcg tatgctgcct gcacagttca ccgacgtggc cacgcagctt gcaggcgggc 10800

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tgatccccat gttcaggggg cttgccggtg cgatcaccct gccgatggtg ggggccacct 10920

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tgctggtcct gtccagagcc gggcaggcgg cagggctgac gtttaaccag accagcgagt 11100

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ttgttaacga tgaagcgcgg gcgcgttact gggatgatcg tgaaaaggcc cgtcttgcgc 11640

ttgaagccgc ccgaaagaag gctgagcagc agactcaaca ggacaaaaat gcgcagcagc 11700

agagcgatac cgaagcgtca cggctgaaat ataccgaaga ggcgcagaag gcttacgaac 11760

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cggcgatgct gaccggcagt gagcagaact ggcgcagctt cacccgttcc gtgctgtcca 12600

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ctgcggcgaa attccatttt gcaaccggag gatttacggg aaccggcggc aaatatgagc 12780

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tggtgattaa caacgacggc acgaacgggc agataggtcc ggctgctctg aaggcggtgt 13020

atgacatggc ccgcaagggt gcccgtgatg aaattcagac acagatgcgt gatggtggcc 13080

tgttctccgg aggtggacga tgaagacctt ccgctggaaa gtgaaacccg gtatggatgt 13140

ggcttcggtc ccttctgtaa gaaaggtgcg ctttggtgat ggctattctc agcgagcgcc 13200

tgccgggctg aatgccaacc tgaaaacgta cagcgtgacg ctttctgtcc cccgtgagga 13260

ggccacggta ctggagtcgt ttctggaaga gcacgggggc tggaaatcct ttctgtggac 13320

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tatgctgcgt gttgagttca gcgcagagtt tgaacaggtg gtgaactgat gcaggatatc 13440

cggcaggaaa cactgaatga atgcacccgt gcggagcagt cggccagcgt ggtgctctgg 13500

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ggttttgaac tgaatggcaa aggcaccagt acgcgcccca cgctgacggt ttctaacctg 13680

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cagttacatg agactctgcc tgatggcgct gtaattcata ttgttcccag agtcgccggg 15060

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tcctcactgg ataacatggt tgcccagggc aatgttctgc ctgttctgta cggggaaatg 15360

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tttgtcattt atggagcgtg aggaatgggt aaaggaagca gtaaggggca taccccgcgc 15540

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aatgcggcat acctcagtgg cgtggagtgc aggtatacag attaatccgg cagcgtccgt 19500

cgttgttgat attgcttatg aaggctccgg cagtggcgac tggcgtactg acggattcat 19560

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cgaaggcgac agaggctgcg ggaagtgcgg tatcagcatc gcagagcaaa agtgcggcag 20640

aagcggcggc aatacgtgca aaaaattcgg caaaacgtgc agaagatata gcttcagctg 20700

tcgcgcttga ggatgcggac acaacgagaa aggggatagt gcagctcagc agtgcaacca 20760

acagcacgtc tgaaacgctt gctgcaacgc caaaggcggt taaggtggta atggatgaaa 20820

cgaacagaaa agcccactgg acagtccggc actgaccgga acgccaacag caccaaccgc 20880

gctcagggga acaaacaata cccagattgc gaacaccgct tttgtactgg ccgcgattgc 20940

agatgttatc gacgcgtcac ctgacgcact gaatacgctg aatgaactgg ccgcagcgct 21000

cgggaatgat ccagattttg ctaccaccat gactaacgcg cttgcgggta aacaaccgaa 21060

gaatgcgaca ctgacggcgc tggcagggct ttccacggcg aaaaataaat taccgtattt 21120

tgcggaaaat gatgccgcca gcctgactga actgactcag gttggcaggg atattctggc 21180

aaaaaattcc gttgcagatg ttcttgaata ccttggggcc ggtgagaatt cggcctttcc 21240

ggcaggtgcg ccgatcccgt ggccatcaga tatcgttccg tctggctacg tcctgatgca 21300

ggggcaggcg tttgacaaat cagcctaccc aaaacttgct gtcgcgtatc catcgggtgt 21360

gcttcctgat atgcgaggct ggacaatcaa ggggaaaccc gccagcggtc gtgctgtatt 21420

gtctcaggaa caggatggaa ttaagtcgca cacccacagt gccagtgcat ccggtacgga 21480

tttggggacg aaaaccacat cgtcgtttga ttacgggacg aaaacaacag gcagtttcga 21540

ttacggcacc aaatcgacga ataacacggg ggctcatgct cacagtctga gcggttcaac 21600

aggggccgcg ggtgctcatg cccacacaag tggtttaagg atgaacagtt ctggctggag 21660

tcagtatgga acagcaacca ttacaggaag tttatccaca gttaaaggaa ccagcacaca 21720

gggtattgct tatttatcga aaacggacag tcagggcagc cacagtcact cattgtccgg 21780

tacagccgtg agtgccggtg cacatgcgca tacagttggt attggtgcgc accagcatcc 21840

ggttgttatc ggtgctcatg cccattcttt cagtattggt tcacacggac acaccatcac 21900

cgttaacgct gcgggtaacg cggaaaacac cgtcaaaaac attgcattta actatattgt 21960

gaggcttgca taatggcatt cagaatgagt gaacaaccac ggaccataaa aatttataat 22020

ctgctggccg gaactaatga atttattggt gaaggtgacg catatattcc gcctcatacc 22080

ggtctgcctg caaacagtac cgatattgca ccgccagata ttccggctgg ctttgtggct 22140

gttttcaaca gtgatgaggc atcgtggcat ctcgttgaag accatcgggg taaaaccgtc 22200

tatgacgtgg cttccggcga cgcgttattt atttctgaac tcggtccgtt accggaaaat 22260

tttacctggt tatcgccggg aggggaatat cagaagtgga acggcacagc ctgggtgaag 22320

gatacggaag cagaaaaact gttccggatc cgggaggcgg aagaaacaaa aaaaagcctg 22380

atgcaggtag ccagtgagca tattgcgccg cttcaggatg ctgcagatct ggaaattgca 22440

acgaaggaag aaacctcgtt gctggaagcc tggaagaagt atcgggtgtt gctgaaccgt 22500

gttgatacat caactgcacc tgatattgag tggcctgctg tccctgttat ggagtaatcg 22560

ttttgtgata tgccgcagaa acgttgtatg aaataacgtt ctgcggttag ttagtatatt 22620

gtaaagctga gtattggttt atttggcgat tattatcttc aggagaataa tggaagttct 22680

atgactcaat tgttcatagt gtttacatca ccgccaattg cttttaagac tgaacgcatg 22740

aaatatggtt tttcgtcatg ttttgagtct gctgttgata tttctaaagt cggttttttt 22800

tcttcgtttt ctctaactat tttccatgaa atacattttt gattattatt tgaatcaatt 22860

ccaattacct gaagtctttc atctataatt ggcattgtat gtattggttt attggagtag 22920

atgcttgctt ttctgagcca tagctctgat atccaaatga agccataggc atttgttatt 22980

ttggctctgt cagctgcata acgccaaaaa atatatttat ctgcttgatc ttcaaatgtt 23040

gtattgatta aatcaattgg atggaattgt ttatcataaa aaattaatgt ttgaatgtga 23100

taaccgtcct ttaaaaaagt cgtttctgca agcttggctg tatagtcaac taactcttct 23160

gtcgaagtga tatttttagg cttatctacc agttttagac gctctttaat atcttcagga 23220

attattttat tgtcatattg tatcatgcta aatgacaatt tgcttatgga gtaatctttt 23280

aattttaaat aagttattct cctggcttca tcaaataaag agtcgaatga tgttggcgaa 23340

atcacatcgt cacccattgg attgtttatt tgtatgccaa gagagttaca gcagttatac 23400

attctgccat agattatagc taaggcatgt aataattcgt aatcttttag cgtattagcg 23460

acccatcgtc tttctgattt aataatagat gattcagtta aatatgaagg taatttcttt 23520

tgtgcaagtc tgactaactt ttttatacca atgtttaaca tactttcatt tgtaataaac 23580

tcaatgtcat tttcttcaat gtaagatgaa ataagagtag cctttgcctc gctatacatt 23640

tctaaatcgc cttgtttttc tatcgtattg cgagaatttt tagcccaagc cattaatgga 23700

tcatttttcc atttttcaat aacattattg ttataccaaa tgtcatatcc tataatctgg 23760

tttttgtttt tttgaataat aaatgttact gttcttgcgg tttggaggaa ttgattcaaa 23820

ttcaagcgaa ataattcagg gtcaaaatat gtatcaatgc agcatttgag caagtgcgat 23880

aaatctttaa gtcttctttc ccatggtttt ttagtcataa aactctccat tttgataggt 23940

tgcatgctag atgctgatat attttagagg tgataaaatt aactgcttaa ctgtcaatgt 24000

aatacaagtt gtttgatctt tgcaatgatt cttatcagaa accatatagt aaattagtta 24060

cacaggaaat ttttaatatt attattatca ttcattatgt attaaaatta gagttgtggc 24120

ttggctctgc taacacgttg ctcataggag atatggtaga gccgcagaca cgtcgtatgc 24180

aggaacgtgc tgcggctggc tggtgaactt ccgatagtgc gggtgttgaa tgatttccag 24240

ttgctaccga ttttacatat tttttgcatg agagaatttg taccacctcc caccgaccat 24300

ctatgactgt acgccactgt ccctaggact gctatgtgcc ggagcggaca ttacaaacgt 24360

ccttctcggt gcatgccact gttgccaatg acctgcctag gaattggtta gcaagttact 24420

accggatttt gtaaaaacag ccctcctcat ataaaaagta ttcgttcact tccgataagc 24480

gtcgtaattt tctatctttc atcatattct agatccctct gaaaaaatct tccgagtttg 24540

ctaggcactg atacataact cttttccaat aattggggaa gtcattcaaa tctataatag 24600

gtttcagatt tgcttcaata aattctgact gtagctgctg aaacgttgcg gttgaactat 24660

atttccttat aacttttacg aaagagtttc tttgagtaat cacttcactc aagtgcttcc 24720

ctgcctccaa acgatacctg ttagcaatat ttaatagctt gaaatgatga agagctctgt 24780

gtttgtcttc ctgcctccag ttcgccgggc attcaacata aaaactgata gcacccggag 24840

ttccggaaac gaaatttgca tatacccatt gctcacgaaa aaaaatgtcc ttgtcgatat 24900

agggatgaat cgcttggtgt acctcatcta ctgcgaaaac ttgacctttc tctcccatat 24960

tgcagtcgcg gcacgatgga actaaattaa taggcatcac cgaaaattca ggataatgtg 25020

caataggaag aaaatgatct atattttttg tctgtcctat atcaccacaa aatggacatt 25080

tttcacctga tgaaacaagc atgtcatcgt aatatgttct agcgggtttg tttttatctc 25140

ggagattatt ttcataaagc ttttctaatt taacctttgt caggttacca actactaagg 25200

ttgtaggctc aagagggtgt gtcctgtcgt aggtaaataa ctgacctgtc gagcttaata 25260

ttctatattg ttgttctttc tgcaaaaaag tggggaagtg agtaatgaaa ttatttctaa 25320

catttatctg catcatacct tccgagcatt tattaagcat ttcgctataa gttctcgctg 25380

gaagaggtag ttttttcatt gtactttacc ttcatctctg ttcattatca tcgcttttaa 25440

aacggttcga ccttctaatc ctatctgacc attataattt tttagaatgg tttcataaga 25500

aagctctgaa tcaacggact gcgataataa gtggtggtat ccagaatttg tcacttcaag 25560

taaaaacacc tcacgagtta aaacacctaa gttctcaccg aatgtctcaa tatccggacg 25620

gataatattt attgcttctc ttgaccgtag gactttccac atgcaggatt ttggaacctc 25680

ttgcagtact actggggaat gagttgcaat tattgctaca ccattgcgtg catcgagtaa 25740

gtcgcttaat gttcgtaaaa aagcagagag caaaggtgga tgcagatgaa cctctggttc 25800

atcgaataaa actaatgact tttcgccaac gacatctact aatcttgtga tagtaaataa 25860

aacaattgca tgtccagagc tcattcgaag cagatatttc tggatattgt cataaaacaa 25920

tttagtgaat ttatcatcgt ccacttgaat ctgtggttca ttacgtctta actcttcata 25980

tttagaaatg aggctgatga gttccatatt tgaaaagttt tcatcactac ttagtttttt 26040

gatagcttca agccagagtt gtctttttct atctactctc atacaaccaa taaatgctga 26100

aatgaattct aagcggagat cgcctagtga ttttaaacta ttgctggcag cattcttgag 26160

tccaatataa aagtattgtg taccttttgc tgggtcaggt tgttctttag gaggagtaaa 26220

aggatcaaat gcactaaacg aaactgaaac aagcgatcga aaatatccct ttgggattct 26280

tgactcgata agtctattat tttcagagaa aaaatattca ttgttttctg ggttggtgat 26340

tgcaccaatc attccattca aaattgttgt tttaccacac ccattccgcc cgataaaagc 26400

atgaatgttc gtgctgggca tagaattaac cgtcacctca aaaggtatag ttaaatcact 26460

gaatccggga gcactttttc tattaaatga aaagtggaaa tctgacaatt ctggcaaacc 26520

atttaacaca cgtgcgaact gtccatgaat ttctgaaaga gttacccctc taagtaatga 26580

ggtgttaagg acgctttcat tttcaatgtc ggctaatcga tttggccata ctactaaatc 26640

ctgaatagct ttaagaaggt tatgtttaaa accatcgctt aatttgctga gattaacata 26700

gtagtcaatg ctttcaccta aggaaaaaaa catttcaggg agttgactga attttttatc 26760

tattaatgaa taagtgctta cttcttcttt ttgacctaca aaaccaattt taacatttcc 26820

gatatcgcat ttttcaccat gctcatcaaa gacagtaaga taaaacattg taacaaagga 26880

atagtcattc caaccatctg ctcgtaggaa tgccttattt ttttctactg caggaatata 26940

cccgcctctt tcaataacac taaactccaa catatagtaa cccttaattt tattaaaata 27000

accgcaattt atttggcggc aacacaggat ctctctttta agttactctc tattacatac 27060

gttttccatc taaaaattag tagtattgaa cttaacgggg catcgtattg tagttttcca 27120

tatttagctt tctgcttcct tttggataac ccactgttat tcatgttgca tggtgcactg 27180

tttataccaa cgatatagtc tattaatgca tatatagtat cgccgaacga ttagctcttc 27240

aggcttctga agaagcgttt caagtactaa taagccgata gatagccacg gacttcgtag 27300

ccatttttca taagtgttaa cttccgctcc tcgctcataa cagacattca ctacagttat 27360

ggcggaaagg tatgcatgct gggtgtgggg aagtcgtgaa agaaaagaag tcagctgcgt 27420

cgtttgacat cactgctatc ttcttactgg ttatgcaggt cgtagtgggt ggcacacaaa 27480

gctttgcact ggattgcgag gctttgtgct tctctggagt gcgacaggtt tgatgacaaa 27540

aaattagcgc aagaagacaa aaatcacctt gcgctaatgc tctgttacag gtcactaata 27600

ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatgttgtg ttttacagta ttatgtagtc 27660

tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta tatcatttta cgtttctcgt 27720

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gaacaggtca ctatcagtca aaataaaatc attatttgat ttcaattttg tcccactccc 27840

tgcctctgtc atcacgatac tgtgatgcca tggtgtccga cttatgcccg agaagatgtt 27900

gagcaaactt atcgcttatc tgcttctcat agagtcttgc agacaaactg cgcaactcgt 27960

gaaaggtagg cggatcccct tcgaaggaaa gacctgatgc ttttcgtgcg cgcataaaat 28020

accttgatac tgtgccggat gaaagcggtt cgcgacgagt agatgcaatt atggtttctc 28080

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tatgcaatgc tgttgggatg gcaattttta cgcctgtttt gctttgctcg acataaagat 28200

atccatctac gatatcagac cacttcattt cgcataaatc accaactcgt tgcccggtaa 28260

caacagccag ttccattgca agtctgagcc aacatggtga tgattctgct gcttgataaa 28320

ttttcaggta ttcgtcagcc gtaagtcttg atctccttac ctctgatttt gctgcgcgag 28380

tggcagcgac atggtttgtt gttatatggc cttcagctat tgcctctcgg aatgcatcgc 28440

tcagtgttga tctgattaac ttggctgacg ccgccttgcc ctcgtctatg tatccattga 28500

gcattgccgc aatttctttt gtggtgatgt cttcaagtgg agcatcaggc agacccctcc 28560

ttattgcttt aattttgctc atgtaattta tgagtgtctt ctgcttgatt cctctgctgg 28620

ccaggatttt ttcgtagcga tcaagccatg aatgtaacgt aacggaatta tcactgttga 28680

ttctcgctgt cagaggcttg tgtttgtgtc ctgaaaataa ctcaatgttg gcctgtatag 28740

cttcagtgat tgcgattcgc ctgtctctgc ctaatccaaa ctctttaccc gtccttgggt 28800

ccctgtagca gtaatatcca ttgtttctta tataaaggtt agggggtaaa tcccggcgct 28860

catgacttcg ccttcttccc atttctgatc ctcttcaaaa ggccacctgt tactggtcga 28920

tttaagtcaa cctttaccgc tgattcgtgg aacagatact ctcttccatc cttaaccgga 28980

ggtgggaata tcctgcattc ccgaacccat cgacgaactg tttcaaggct tcttggacgt 29040

cgctggcgtg cgttccactc ctgaagtgtc aagtacatcg caaagtctcc gcaattacac 29100

gcaagaaaaa accgccatca ggcggcttgg tgttctttca gttcttcaat tcgaatattg 29160

gttacgtctg catgtgctat ctgcgcccat atcatccagt ggtcgtagca gtcgttgatg 29220

ttctccgctt cgataactct gttgaatggc tctccattcc attctcctgt gactcggaag 29280

tgcatttatc atctccataa aacaaaaccc gccgtagcga gttcagataa aataaatccc 29340

cgcgagtgcg aggattgtta tgtaatattg ggtttaatca tctatatgtt ttgtacagag 29400

agggcaagta tcgtttccac cgtactcgtg ataataattt tgcacggtat cagtcatttc 29460

tcgcacattg cagaatgggg atttgtcttc attagactta taaaccttca tggaatattt 29520

gtatgccgac tctatatcta taccttcatc tacataaaca ccttcgtgat gtctgcatgg 29580

agacaagaca ccggatctgc acaacattga taacgcccaa tctttttgct cagactctaa 29640

ctcattgata ctcatttata aactccttgc aatgtatgtc gtttcagcta aacggtatca 29700

gcaatgttta tgtaaagaaa cagtaagata atactcaacc cgatgtttga gtacggtcat 29760

catctgacac tacagactct ggcatcgctg tgaagacgac gcgaaattca gcattttcac 29820

aagcgttatc ttttacaaaa ccgatctcac tctcctttga tgcgaatgcc agcgtcagac 29880

atcatatgca gatactcacc tgcatcctga acccattgac ctccaacccc gtaatagcga 29940

tgcgtaatga tgtcgatagt tactaacggg tcttgttcga ttaactgccg cagaaactct 30000

tccaggtcac cagtgcagtg cttgataaca ggagtcttcc caggatggcg aacaacaaga 30060

aactggtttc cgtcttcacg gacttcgttg ctttccagtt tagcaatacg cttactccca 30120

tccgagataa caccttcgta atactcacgc tgctcgttga gttttgattt tgctgtttca 30180

agctcaacac gcagtttccc tactgttagc gcaatatcct cgttctcctg gtcgcggcgt 30240

ttgatgtatt gctggtttct ttcccgttca tccagcagtt ccagcacaat cgatggtgtt 30300

accaattcat ggaaaaggtc tgcgtcaaat ccccagtcgt catgcattgc ctgctctgcc 30360

gcttcacgca gtgcctgaga gttaatttcg ctcacttcga acctctctgt ttactgataa 30420

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gttcatctat cggatcgcca cactcacaac aatgagtggc agatatagcc tggtggttca 30540

ggcggcgcat ttttattgct gtgttgcgct gtaattcttc tatttctgat gctgaatcaa 30600

tgatgtctgc catctttcat taatccctga actgttggtt aatacgcttg agggtgaatg 30660

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cttaaagacg ccgtttaaca tgccgattgc caggcttaaa tgagtcggtg tgaatcccat 30780

cagcgttacc gtttcgcggt gcttcttcag tacgctacgg caaatgtcat cgacgttttt 30840

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gtatgaaatt cttcgtctgt ttctactggt attggcacaa acctgattcc aatttgagca 31140

aggctatgtg ccatctcgat actcgttctt aactcaacag aagatgcttt gtgcatacag 31200

cccctcgttt attatttatc tcctcagcca gccgctgtgc tttcagtgga tttcggataa 31260

cagaaaggcc gggaaatacc cagcctcgct ttgtaacgga gtagacgaaa gtgattgcgc 31320

ctacccggat attatcgtga ggatgcgtca tcgccattgc tccccaaata caaaaccaat 31380

ttcagccagt gcctcgtcca ttttttcgat gaactccggc acgatctcgt caaaactcgc 31440

catgtacttt tcatcccgct caatcacgac ataatgcagg ccttcacgct tcatacgcgg 31500

gtcatagttg gcaaagtacc aggcattttt tcgcgtcacc cacatgctgt actgcacctg 31560

ggccatgtaa gctgacttta tggcctcgaa accaccgagc cggaacttca tgaaatcccg 31620

ggaggtaaac gggcatttca gttcaaggcc gttgccgtca ctgcataaac catcgggaga 31680

gcaggcggta cgcatacttt cgtcgcgata gatgatcggg gattcagtaa cattcacgcc 31740

ggaagtgaat tcaaacaggg ttctggcgtc gttctcgtac tgttttcccc aggccagtgc 31800

tttagcgtta acttccggag ccacaccggt gcaaacctca gcaagcaggg tgtggaagta 31860

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tgctctgcgg ctttctgttt caggaatcca agagctttta ctgcttcggc ctgtgtcagt 32100

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tcccatgttt tatccagggc gatcagcaga gtgttaatct cctgcatggt ttcatcgtta 32220

accggagtga tgtcgcgttc cggctgacgt tctgcagtgt atgcagtatt ttcgacaatg 32280

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atcatggctt tatgacgtaa catccgtttg ggatgcgact gccacggccc cgtgatttct 32400

ctgccttcgc gagttttgaa tggttcgcgg cggcattcat ccatccattc ggtaacgcag 32460

atcggatgat tacggtcctt gcggtaaatc cggcatgtac aggattcatt gtcctgctca 32520

aagtccatgc catcaaactg ctggttttca ttgatgatgc gggaccagcc atcaacgccc 32580

accaccggaa cgatgccatt ctgcttatca ggaaaggcgt aaatttcttt cgtccacgga 32640

ttaaggccgt actggttggc aacgatcagt aatgcgatga actgcgcatc gctggcatca 32700

cctttaaatg ccgtctggcg aagagtggtg atcagttcct gtgggtcgac agaatccatg 32760

ccgacacgtt cagccagctt cccagccagc gttgcgagtg cagtactcat tcgttttata 32820

cctctgaatc aatatcaacc tggtggtgag caatggtttc aaccatgtac cggatgtgtt 32880

ctgccatgcg ctcctgaaac tcaacatcgt catcaaacgc acgggtaatg gattttttgc 32940

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ctttttccat gtcgtctgcc agttctgcct ctttctcttc acgggcgagc tgctggtagt 33060

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tcctgaaata gctgtgaaaa tatcgcccgc gaaatgccgg gctgattagg aaaacaggaa 33180

agggggttag tgaatgcttt tgcttgatct cagtttcagt attaatatcc attttttata 33240

agcgtcgacg gcttcacgaa acatcttttc atcgccaata aaagtggcga tagtgaattt 33300

agtctggata gccataagtg tttgatccat tctttgggac tcctggctga ttaagtatgt 33360

cgataaggcg tttccatccg tcacgtaatt tacgggtgat tcgttcaagt aaagattcgg 33420

aagggcagcc agcaacaggc caccctgcaa tggcatattg catggtgtgc tccttattta 33480

tacataacga aaaacgcctc gagtgaagcg ttattggtat gcggtaaaac cgcactcagg 33540

cggccttgat agtcatatca tctgaatcaa atattcctga tgtatcgata tcggtaattc 33600

ttattccttc gctaccatcc attggaggcc atccttcctg accatttcca tcattccagt 33660

cgaactcaca cacaacacca tatgcattta agtcgcttga aattgctata agcagagcat 33720

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cagagtctga ccagaaatta ttaatctggt gaagtttttc ctctgtcatt acgtcatggt 33840

cgatttcaat ttctattgat gctttccagt cgtaatcaat gatgtatttt ttgatgtttg 33900

acatctgttc atatcctcac agataaaaaa tcgccctcac actggagggc aaagaagatt 33960

tccaataatc agaacaagtc ggctcctgtt tagttacgag cgacattgct ccgtgtattc 34020

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ccactatcag gcagctttgt tgttctgttt accaagttct ctggcaatca ttgccgtcgt 34140

tcgtattgcc catttatcga catatttccc atcttccatt acaggaaaca tttcttcagg 34200

cttaaccatg cattccgatt gcagcttgca tccattgcat cgcttgaatt gtccacacca 34260

ttgattttta tcaatagtcg tagtcatacg gatagtcctg gtattgttcc atcacatcct 34320

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tctgtcactg tcaggaaagt ggtaaaactg caactcaatt actgcaatgc cctcgtaatt 48060

aagtgaattt acaatatcgt cctgttcgga gggaagaacg cgggatgttc attcttcatc 48120

acttttaatt gatgtatatg ctctcttttc tgacgttagt ctccgacggc aggcttcaat 48180

gacccaggct gagaaattcc cggacccttt ttgctcaaga gcgatgttaa tttgttcaat 48240

catttggtta ggaaagcgga tgttgcgggt tgttgttctg cgggttctgt tcttcgttga 48300

catgaggttg ccccgtattc agtgtcgctg atttgtattg tctgaagttg tttttacgtt 48360

aagttgatgc agatcaatta atacgatacc tgcgtcataa ttgattattt gacgtggttt 48420

gatggcctcc acgcacgttg tgatatgtag atgataatca ttatcacttt acgggtcctt 48480

tccggtgatc cgacaggtta cg48502

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例5和6中使用的序列

<400> 44

tttttttttt tttttttttt ttttt 25

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例5和6中使用的序列

<400> 45

gcaatatcag caccaacaga aac 23

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例5和6中使用的序列

<400> 46

gtttctgttg gtgctgatat tgctt 25

<210> 47

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例5和6中使用的序列

<400> 47

ccttctgtta cgtt 14

<210> 48

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例5和6中使用的序列

<400> 48

ttcgtaacag aag 13

<210> 49

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例7中使用的序列

<400> 49

cgttctgttt atgtttcttg gacactgatt gacacggttt agtagaac 48

<210> 50

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例7中使用的序列

<400> 50

tttttttttt tttttttttt ttttttttca agaaacataa acagaacg 48

<210> 51

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例7中使用的序列

<400> 51

tttttttttt tt 12

<210> 52

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例7中使用的序列

<400> 52

ggttgtttct gttggtgctg atattgcggc gtctgcttgg gtgtttaacc t 51

<210> 53

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例7中使用的序列

<400> 53

ggttaaacac ccaagcagac gccgcaatat cagcaccaac agaaacaacc tttgaggcga 60

gcggtcaa 68

<210> 54

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例7中使用的序列

<400> 54

ttgaccgctc gcctc 15

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