一种菩萨根瘤菌及其制取β‑1，3葡聚糖发酵液的方法

摘要

本发明属于微生物发酵，特别是指一种菩萨根瘤菌以及利用其制取β‑1，3葡聚糖发酵液的方法。包括将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的培养液中、进行通气搅拌发酵、当培养液粘度不再增长或发酵周期≤48小时发酵结束等工艺步骤，本发明解决了现有技术存在的存在工艺繁琐、发酵周期长、产品粘度低等问题，具有收率高、产品粘度高且水溶性好、发酵周期短且成本低等优点。

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵，特别是指一种菩萨根瘤菌及其制取β-1，3葡聚糖发酵液的方法。

背景技术

β-1，3葡聚糖是一类具有以β-1，3葡聚糖连接的具有多种生物活性的葡萄糖聚合物。应用实验中的功效表现为：保湿、抗炎、抗衰老、去皱、去头屑、退黄、加快修复、增加皮肤弹性、辅助抗菌、增强机体免疫力、辅助降血糖、降血脂、改善胃肠功能等。广泛应用在医药、食品、化妆品、动物饲料添加剂等多个领域。

葡聚糖以β-1，3葡聚糖最具生理活性，β-1，3葡聚糖广泛存在于各种真菌与植物(如香菇、灵芝和燕麦)中，是它们发挥保健作用的主要功效物质。

在二十世纪四十年代，Pillemer博士首次发现并报道酵母细胞壁有一种物质具有提高免疫力的作用。之后经过图伦大学Diluzio博士进一步研究发现，酵母细胞壁中提高免疫力物质是一种多糖——β-1，3葡聚糖，并从面包酵母中分离出这种物质。

β-葡聚糖活性结构是由葡萄糖单位组成的多聚糖，它们大多数是通过β-1，3结合，这是葡萄糖链连接方式。它能够活化巨噬细胞与嗜中性白血球等，因此能提高白细胞素、细胞分裂素和特殊抗体含量，全面刺激机体免疫系统。那么机体就有更多准备去抵抗微生物引起的疾病。β-1，3葡聚糖能使受伤机体淋巴细胞产生细胞因子(IL-1)的能力迅速恢复正常，有效调节机体免疫机能。大量实验表明，β-1，3葡聚糖可促进体内IgM抗体产生，以提高体液免疫能力。这种葡聚糖活化细胞会激发宿主非专一性防御机制，故应用在肿瘤、感染病与治疗创伤方面深受瞩目。经特殊步骤萃取且不含内毒素β-1，3葡聚糖在美国FDA已认定是安全的物质，可添加于一般食品，许多报导显示老鼠口服酵母β-1，3葡聚糖，可增加强腹膜细胞抗菌吞噬作用。此外，葡聚糖尚有清除游离基、抗辐射、溶解胆固醇，预防高脂血症作用及抵抗滤过性病毒、真菌、细菌等引起的感染，故可广泛用于医药、食品、化妆品等行业，目前酵母葡聚糖已实现产业化，具有广阔的应用前景。

传统的β-1，3葡聚糖制取方法为从酵母细胞壁分离制得，产品不易溶解于水，传统工艺中存在工艺复杂，控制繁琐的缺点，工艺控制不稳定。

申请人检索到的专利文献包括:

专利号为201010146371.2的文献中公开了一种土壤杆菌ZX09，用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β-葡聚糖及其制备方法及在降低血糖上的应用。土壤杆菌ZX09在山东东营的盐土中分离得到。以蔗糖或乳糖为碳源能很好地生长，可以利用的碳源为D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖或D-木糖，不能利用碳源为麦芽糖。发酵周期为48-72小时，发酵48小时后的发酵液最高粘度可达到20000mPa·s(NDJ-1RotationalViscometer，Rotor为3，RPM为6，上海天平仪器厂)。该现有技术存在的问题一是菌种不能利用麦芽糖；二是发酵周期长(48-72小时)；三是发酵结束后发酵液的粘度较低(最高粘度可达到20000mPa·s)；四是未对发酵收率进行说明。

专利号为201210281755.4的文献中公开了一种放射形土壤杆菌突变株，该菌种经500L发酵罐中培养90-100小时，即得β-1,3葡聚糖含量4％以上的发酵液。上述现有技术存在的问题一是发酵周期长(90-100小时)；二是未对发酵液的水溶性及粘度进行量化说明；三是仅公开了以蔗糖或葡萄糖作为碳源。

专利号为201510123040.X中公开了一种利用热凝胶发酵液直接生产β-1,3葡寡糖的方法，其中公开了如下技术方案：先利用土壤杆菌ATCC 31749通风发酵获得热凝胶发酵液，对热凝胶发酵液进行热碱灭活处理后，作为培养哈茨木霉的培养基组分之一，添加氮源和微量元素辅料后，哈茨木霉经通风培养获得富含β-1,3葡聚糖内切酶的哈茨木霉发酵液；该哈茨木霉发酵液再与未经热碱灭活处理的新鲜热凝胶发酵液混合并进行催化水解反应，不对酶液和反应底物进行分离提取，直接得到β-1,3葡寡糖粗制品。该现有技术存在的问题一是生产工艺繁琐，不易控制；二是工艺过程时间长；三是未对β-1,3葡寡糖的技术参数及发酵收率进行说明。

专利号为01806862.6的文献中公开了来自丝状真菌的β葡聚糖，上述方法中包括发酵非病原腐生丝状真菌测悬浮液和从悬浮液中提取β葡聚糖。该现有技术存在的主要问题一是生产工艺繁琐，不易控制；二是发酵周期长，至少约50小时，优选为96小时；三是未对β葡聚糖的粘度指标进行说明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种具有较好β-1,3葡聚糖生产能力的菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954。

本发明的目的之二是提供一种利用菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954制取β-1,3葡聚糖发酵液的方法。发酵培养液中使用玉米淀粉水解液、麦芽糖为碳源；发酵过程采用温度分段控制的发酵工艺，更有利于菌种的生长代谢，该方法收率明显优于现有技术，且所得到的β-1,3葡聚糖水溶性好。

本发明的整体技术构思是：

一种菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954。

本发明中的菌种菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954申请人已于2016年9月12日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单位简称CGMCC。

由于本发明中的菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954按照保藏单位的鉴定结果目前仅有拉丁文名称，尚无中文名称，菌种的中文名称一般是由首位使用该菌种的人员翻译，该菌种的中文命名原则如下：

Rhizobium pusense(pu.sen9se.N.L.neut.adj.pusense belonging to Pusa，India，the geographical origin of the type strain)。

该菌种的中文名称是按照菌株分离的地理位置命名的，意思是来自pusa的菌，因此申请人将其中文名称翻译成菩萨根瘤菌。

该菌种的形态特征及生理生化特征如下：

本发明中的菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954系申请人于河北省衡水市衡水湖土壤中分离得到，显微镜观察细胞呈杆状，革兰氏染色为阴性。菌株菌落为圆形、隆起，边缘光滑整齐，菌体主要集中于菌落中央，呈白色；在菌体四周有白色偏透明的粘性胞外产物出现，随着培养时间的增长，胞外产物的量不断增多，并以菌落中央为圆心向四周扩散，可利用包括玉米淀粉水解液、麦芽糖等碳源。发酵48小时后的发酵液粘度可达到30000mPa·s。

利用菩萨根瘤菌制取β-1，3葡聚糖发酵液的方法，该方法包括如下工艺步骤：

A、将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的培养液中；

B、进行通气搅拌发酵；

C、当培养液粘度不再增长或发酵周期≤48小时发酵结束。

本发明的具体技术构思还有：

为更有利于菌种的生长，本发明中培养菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954的培养基中优选的碳源及氮源是，所述的步骤A的培养液中的碳源选自葡萄糖、麦芽糖、玉米淀粉水解液、玉米浆粉中的一种或其结合；氮源选自豆粉、豆油、蛋白胨、酵母膏、硫酸铵中的一种或其结合。

为便于控制发酵周期，为菌体提供有利的生长环境，优选的技术实现方式是，所述的步骤A中按种子液：培养液的体积百分比为12％-18％的接种量将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954接入发酵罐中的培养液中。为提供良好的生长环境保证菌体正常生长，优选的技术方案是，所述的步骤A中接种是当灭菌后培养液温度降至30-32℃时进行。

所述的玉米淀粉水解液优选采用如下方法制作：将玉米淀粉用自来水配成质量百分比浓度为30％的混合液，升温至90-95℃，维持40分钟。

为便于发酵过程中的菌体生长以及终产物的获得，本发明的步骤A中的发酵所用的培养液优选采用如下方式，所述的步骤A中培养液由如下质量百分含量的组份组成：

玉米淀粉水解液4.0％-4.5％；麦芽糖2.0％-2.5％；豆粉0.3％-0.5％；硫酸镁0.1％-0.15％；豆油0.05％-0.15％；余量为无菌水；pH＝8.0-8.5。

步骤A中的培养液优选采用如下方式配置，所述的步骤A中培养液配制过程如下：将培养液中各组分按比例投入发酵罐中，加自来水至规定计料体积，搅拌30-40分钟使之溶解，用氢氧化钠溶液调培养液pH＝8.0-8.5，搅拌30-40分钟混合均匀。

为提高收率、满足菌体的生长并有利于终产物的生成，本发明的通气发酵过程中优选的发酵条件是，步骤B包括如下工艺步骤:

10-30小时：温度30℃-32℃，压力0.03-0.05MPa，pH＝7.0-7.3，通风量0.4-0.5vvm；

31小时-放罐：温度26℃-29℃，压力0.03-0.05MPa，pH＝7.0-7.3，通风量0.4-0.5vvm。

为使培养液中的营养丰富，更有利于菌种的生长代谢。优选的技术方案是，所述的步骤B中进行通气搅拌发酵过程中补入双氧水及微量元素；具体条件如下：

12-15小时：补入微量元素；

23-26小时：补入双氧水；

微量元素优选采用如下实施方式，所述的微量元素采用如下方式配制成微量元素溶液：柠檬酸100g，氢氧化钙5g，氢氧化镁7g，硫酸锰0.083g，硫酸锌0.066g，五水硫酸铜0.025g，七水硫酸钴0.028g，硫酸镁8.6g，硫酸亚铁1.8g，硼酸0.006g，加蒸馏水定容至1000ml后灭菌；微量元素溶液的加入量为每1000L培养液加入微量元素溶液1L。

双氧水优选采用如下实施方式，所述的双氧水的质量百分比浓度为2-3％，加入量为培养液体积的0.05％。

为便于工业化生产，同时满足生产中工业化生产的经济性，优选的实施方式是，步骤A是将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954经过扩大培养后，按照种子液：发酵规定计料体积培养液的体积百分比为12％-18％的接种量接种于培养液中。

所述的扩大培养过程包括：

(1)将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954接种于摇瓶种子培养基表面制成摇瓶种子；

(2)将摇瓶种子经扩大培养后制成种子液；

(3)将制成的种子液按种子液：发酵规定计料体积培养液的体积百分比为12％-18％的接种量接入发酵罐中的培养液，进行发酵。

所述的扩大培养过程步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取2环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为30-32℃，摇床转速为200-220转/分钟，培养周期为10-14小时；

摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组分组成：

葡萄糖2.5％-2.8％；麦芽糖1.5％-2.0％；蛋白胨1.0％-1.5％；玉米浆粉1.0％-1.5％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3。

所述的扩大培养过程步骤(2)中的扩大培养依次包括一级种子的制备、二级种子的制备，其中一级种子培养液由下列质量百分含量的组分组成：

葡萄糖2.5％-2.8％；麦芽糖1.5％-2.0％；酵母膏0.4％-0.6％；硫酸铵0.2％-0.3％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；

接种量为摇瓶种子：一级种子培养液的体积比＝0.8％-1.0％，将摇床种子接入灭菌后的一级种子培养液经过培养制成一级种子，一级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃-32℃，通风量0.9vvm-1.0vvm，培养周期10-14小时。

所述的二级种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：

葡萄糖2.5％-2.8％；麦芽糖1.5％-2.0％；豆粉0.8％-1.0％；硫酸铵0.2％-0.3％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；

接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝12％-18％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃-32℃，通风量0.9vvm-1.0vvm，培养周期8h-10h。

所述的步骤C中培养液的粘度测定方法如下：选用上海天平仪器厂的NDJ-1RotationalViscometer，步骤为取培养液500ml置于烧杯内，用Rotor为3，RPM为6测定，读出表盘示数乘以系数即得粘度值。

为验证本发明的技术效果，申请人进行了如下实验：

一、根据β-1,3葡聚糖具有水溶性，溶液只要很低的浓度就可产生很高粘度的性能，在目前未见国标的情况下，参照《食品安全国家标准食品添加剂黄原胶》(GB1886.41-2015)中附录A中A.3条款粘度的检测方法，评价β-1,3葡聚糖产品粘度值，具体方法如下：

1、粉末产品的制备：发酵结束将最终的发酵液加入2倍体积的95％乙醇后，6000g重力离心15min获得固体沉淀，60℃干燥至恒重，研磨成粉末备用。

2、评价结果

粘度值大于1500cp。

二、收率的检测

收率的检测目前尚无国标，行业中测定一般采用如下方法：

1、所用仪器

恒温箱、分析天平(0.001g)。

2、检测方法

将发酵液倒入一定体积的小烧杯中，用玻璃棒搅拌使其无气泡，用玻璃棒把表面抹平，把杯子外的发酵液清洗干净。发酵液用90％-95％的乙醇提取、沉降、过滤布挤干，将其撕碎后全部彻底移入到培养皿中，然后放入105℃烘箱中烘至恒重(约4小时)，拿出称重。

固含量＝称样克数/体积×100％。

3、检测结果

采用本发明的方法的发酵收率为5.0g-5.5g/L。

本发明所具备的实质性特点和显著的技术进步在于：

1、本发明公开了一种菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954，该菌种具有较好的β-1,3葡聚糖生产能力，且可以利用包括葡萄糖、麦芽糖、玉米淀粉水解液、玉米浆粉在内的碳源，便于工业化生产且成本低廉。

2、采用本发明的方法制备β-1,3葡聚糖，发酵收率及粘度高，发酵收率达到5.0g-5.5g/L，粘度可达1550-1630cp。

3、发酵过程中采用阶段控温与过程中补入微量元素、双氧水的发酵工艺条件，使发酵控制稳定，促进菌种的生长和代谢。

4、本发明能够通过发酵制得β-1,3葡聚糖，生产成本低、周期短，不受季节和地域的限制，易于操纵，供给稳定等，具有较强的市场竞争力和广阔的应用前景。

5、采用本发明的方法制取的β-1,3葡聚糖，具有水溶性，少量β-1,3葡聚糖即能配成高粘度溶液，可作为增稠剂、悬浮剂等应用于工业、农业、食品等行业中。

本发明中的菌种菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954申请人已于2016年9月12日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单位简称CGMCC。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。

实施例1

一种菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954。

利用土壤杆菌制取β-1，3葡聚糖发酵液的方法，该方法包括如下工艺步骤：

A、将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的培养液中；

B、进行通气搅拌发酵；

C、当培养液粘度不再增长或发酵周期≤48小时发酵结束。

所述的步骤A中按种子液：培养液的体积百分比为12％-18％的接种量将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954接入发酵罐中的培养液中。所述的步骤A中接种是当灭菌后培养液温度降至30-32℃时进行。

所述的玉米淀粉水解液采用如下方法制作：将玉米淀粉用自来水配成质量百分比浓度为30％的混合液，升温至90-95℃，维持40分钟。

所述的步骤A中培养液由如下质量百分含量的组份组成：

玉米淀粉水解液4.0％；麦芽糖2.0％；豆粉0.3％；硫酸镁0.1％；豆油0.05％；余量为无菌水；pH＝8.0-8.5。

所述的步骤A中培养液配制过程如下：将培养液中各组分按比例投入发酵罐中，加自来水至规定计料体积，搅拌30-40分钟使之溶解，用氢氧化钠溶液调培养液pH＝8.0-8.5，搅拌30-40分钟混合均匀。

步骤B包括如下工艺步骤:

10-30小时：温度30℃，压力0.03MPa，pH＝7.0-7.3，通风量0.4vvm；

31小时-放罐：温度26℃，压力0.03MPa，pH＝7.0-7.3，通风量0.4vvm。

所述的步骤B中进行通气搅拌发酵过程中补入双氧水及微量元素；具体条件如下：

15小时：补入微量元素；

26小时：补入双氧水；

所述的微量元素采用如下方式配制成微量元素溶液：柠檬酸100g，氢氧化钙5g，氢氧化镁7g，硫酸锰0.083g，硫酸锌0.066g，五水硫酸铜0.025g，七水硫酸钴0.028g，硫酸镁8.6g，硫酸亚铁1.8g，硼酸0.006g，加蒸馏水定容至1000ml后灭菌；微量元素溶液的加入量为每1000L培养液加入微量元素溶液1L。

所述的双氧水的质量百分比浓度为2％，加入量为培养液体积的0.05％。

步骤A是将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954经过扩大培养后，按照种子液：发酵规定计料体积培养液的体积百分比为12％-18％的接种量接种于培养液中。

所述的扩大培养过程包括：

(1)将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954接种于摇瓶种子培养基表面制成摇瓶种子；

(2)将摇瓶种子经扩大培养后制成种子液；

(3)将制成的种子液按种子液：发酵规定计料体积培养液的体积百分比为12％的接种量接入发酵罐中的培养液，进行发酵。

所述的扩大培养过程步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取2环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为30℃，摇床转速为200转/分钟，培养周期为14小时；

摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组分组成：

葡萄糖2.5％；麦芽糖1.5％；蛋白胨1.0％；玉米浆粉1.0％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3。

所述的扩大培养过程步骤(2)中的扩大培养依次包括一级种子的制备、二级种子的制备，其中一级种子培养液由下列质量百分含量的组分组成：

葡萄糖2.5％；麦芽糖1.5％；酵母膏0.4％；硫酸铵0.2％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；

接种量为摇瓶种子：一级种子培养液的体积比＝0.8％，将摇床种子接入灭菌后的一级种子培养液经过培养制成一级种子，一级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃，通风量0.9vvm，培养周期14小时。

所述的二级种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：

葡萄糖2.5％；麦芽糖1.5％；豆粉0.8％；硫酸铵0.2％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；

接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝12％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃，通风量0.9vvm，培养周期10小时。

所述的步骤C中培养液的粘度测定方法如下：选用上海天平仪器厂的NDJ-1RotationalViscometer，步骤为取培养液500ml置于烧杯内，用Rotor为3，RPM为6测定，读出表盘示数乘以系数即得粘度值。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：

所述的步骤A中按种子液：培养液的体积百分比为18％的接种量将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954接入发酵罐中的培养液中。

所述的步骤A中培养液由如下质量百分含量的组份组成：

玉米淀粉水解液4.5％；麦芽糖2.5％；豆粉0.5％；硫酸镁0.15％；豆油0.15％；余量为无菌水；pH＝8.0-8.5。

所述的步骤A中培养液配制过程如下：将培养液中各组分按比例投入发酵罐中，加自来水至规定计料体积，搅拌40分钟使之溶解，用氢氧化钠溶液调培养液pH＝8.0-8.5，搅拌40分钟混合均匀。

步骤B包括如下工艺步骤:

10-30小时：温度32℃，压力0.05MPa，pH＝7.0-7.3，通风量0.5vvm；

31小时-放罐：温度29℃，压力0.05MPa，pH＝7.0-7.3，通风量0.5vvm。

所述的步骤B中进行通气搅拌发酵过程中补入双氧水及微量元素；具体条件如下：

12小时：补入微量元素；

23小时：补入双氧水；

将步骤A是将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954经过扩大培养后，按照种子液：发酵规定计料体积培养液的体积百分比为18％的接种量接种于培养液中。

所述的扩大培养过程步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取2环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为32℃，摇床转速为220转/分钟，培养周期为10小时；

摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组分组成：

葡萄糖2.8％；麦芽糖2.0％；蛋白胨1.5％；玉米浆粉1.5％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3。

所述的扩大培养过程步骤(2)中的扩大培养依次包括一级种子的制备、二级种子的制备，其中一级种子培养液由下列质量百分含量的组分组成：

葡萄糖2.8％；麦芽糖2.0％；酵母膏0.6％；硫酸铵0.3％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；

接种量为摇瓶种子：一级种子培养液的体积比＝1.0％，将摇床种子接入灭菌后的一级种子培养液经过培养制成一级种子，一级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度32℃，通风量1.0vvm，培养周期10小时。

所述的二级种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：

葡萄糖2.8％；麦芽糖2.0％；豆粉1.0％；硫酸铵0.3％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；

接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝18％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度32℃，通风量1.0vvm，培养周期8小时。

其余内容与实施例1相同。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：

所述的步骤A中按种子液：培养液的体积百分比为15％的接种量将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954接入发酵罐中的培养液中。

所述的步骤A中培养液由如下质量百分含量的组份组成：

玉米淀粉水解液4.2％；麦芽糖2.3％；豆粉0.4％；硫酸镁0.13％；豆油0.1％；余量为无菌水；pH＝8.0-8.5。

所述的步骤A中培养液配制过程如下：将培养液中各组分按比例投入发酵罐中，加自来水至规定计料体积，搅拌35分钟使之溶解，用氢氧化钠溶液调培养液pH＝8.0-8.5，搅拌35分钟混合均匀。

步骤B包括如下工艺步骤:

10-30小时：温度31℃，压力0.04MPa，pH＝7.0-7.3，通风量0.45vvm；

31小时-放罐：温度28℃，压力0.04MPa，pH＝7.0-7.3，通风量0.45vvm。

所述的步骤B中进行通气搅拌发酵过程中补入双氧水及微量元素；具体条件如下：

14小时：补入微量元素；

24小时：补入双氧水；

步骤A是将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954经过扩大培养后，按照种子液：发酵规定计料体积培养液的体积百分比为15％的接种量接种于培养液中。

所述的扩大培养过程步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取2环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为31℃，摇床转速为210转/分钟，培养周期为12小时；

摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组分组成：

葡萄糖2.6％；麦芽糖1.7％；蛋白胨1.3％；玉米浆粉1.3％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3。

所述的扩大培养过程步骤(2)中的扩大培养依次包括一级种子的制备、二级种子的制备，其中一级种子培养液由下列质量百分含量的组分组成：

葡萄糖2.6％；麦芽糖1.7％；酵母膏0.5％；硫酸铵0.25％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；

接种量为摇瓶种子：一级种子培养液的体积比＝0.8％-1.0％，将摇床种子接入灭菌后的一级种子培养液经过培养制成一级种子，一级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度31℃，通风量0.95vvm，培养周期12h。

所述的二级种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：

葡萄糖2.7％；麦芽糖1.7％；豆粉0.9％；硫酸铵0.25％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；

接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝15％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度31℃，通风量0.95vvm，培养周期9h。

其余内容与实施例1相同。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：

所述的步骤A中按种子液：培养液的体积百分比为13％的接种量将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954接入发酵罐中的培养液中。

所述的步骤A中培养液由如下质量百分含量的组份组成：

玉米淀粉水解液4.1％；麦芽糖2.1％；豆粉0.35％；硫酸镁0.11％；豆油0.08％；余量为无菌水；pH＝8.0-8.5。

所述的步骤A中培养液配制过程如下：将培养液中各组分按比例投入发酵罐中，加自来水至规定计料体积，搅拌32分钟使之溶解，用氢氧化钠溶液调培养液pH＝8.0-8.5，搅拌32分钟混合均匀。

步骤B包括如下工艺步骤:

10-30小时：温度31℃，压力0.035MPa，pH＝7.0-7.3，通风量0.42vvm；

31小时-放罐：温度27℃，压力0.035MPa，pH＝7.0-7.3，通风量0.42vvm。

所述的步骤B中进行通气搅拌发酵过程中补入双氧水及微量元素；具体条件如下：

13小时：补入微量元素；

24小时：补入双氧水；

步骤A是将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954经过扩大培养后，按照种子液：发酵规定计料体积培养液的体积百分比为13％的接种量接种于培养液中。

所述的扩大培养过程步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取2环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为31℃，摇床转速为210转/分钟，培养周期为11小时；

摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组分组成：

葡萄糖2.6％；麦芽糖1.6％；蛋白胨1.1％；玉米浆粉1.2％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3。

所述的扩大培养过程步骤(2)中的扩大培养依次包括一级种子的制备、二级种子的制备，其中一级种子培养液由下列质量百分含量的组分组成：

葡萄糖2.6％；麦芽糖1.6％；酵母膏0.45％；硫酸铵0.22％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；

接种量为摇瓶种子：一级种子培养液的体积比＝0.8％-1.0％，将摇床种子接入灭菌后的一级种子培养液经过培养制成一级种子，一级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度31℃，通风量0.95vvm，培养周期12小时。

所述的二级种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：

葡萄糖2.6％；麦芽糖1.6％；豆粉0.85％；硫酸铵0.22％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；

接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝13％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度31℃，通风量0.95vvm，培养周期8.5h。

其余内容与实施例1相同。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于：

所述的步骤A中按种子液：培养液的体积百分比为17％的接种量将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954接入发酵罐中的培养液中。

所述的步骤A中培养液由如下质量百分含量的组份组成：

玉米淀粉水解液4.4％；麦芽糖2.4％；豆粉0.45％；硫酸镁0.14％；豆油0.13％；余量为无菌水；pH＝8.0-8.5。

所述的步骤A中培养液配制过程如下：将培养液中各组分按比例投入发酵罐中，加自来水至规定计料体积，搅拌38分钟使之溶解，用氢氧化钠溶液调培养液pH＝8.0-8.5，搅拌38分钟混合均匀。

步骤B包括如下工艺步骤:

10-30小时：温度31℃，压力0.045MPa，pH＝7.0-7.3，通风量0.45vvm；

31小时-放罐：温度28℃，压力0.045MPa，pH＝7.0-7.3，通风量0.45vvm。

所述的步骤B中进行通气搅拌发酵过程中补入双氧水及微量元素；具体条件如下：

12-15小时：补入微量元素；

23-26小时：补入双氧水；

步骤A是将菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)CGMCC No.12954经过扩大培养后，按照种子液：发酵规定计料体积培养液的体积百分比为17％的接种量接种于培养液中。

所述的扩大培养过程步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取2环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为32℃，摇床转速为215转/分钟，培养周期为13小时；

摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组分组成：

葡萄糖2.7％；麦芽糖1.8％；蛋白胨1.4％；玉米浆粉1.4％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3。

所述的扩大培养过程步骤(2)中的扩大培养依次包括一级种子的制备、二级种子的制备，其中一级种子培养液由下列质量百分含量的组分组成：

葡萄糖2.7％；麦芽糖1.8％；酵母膏0.55％；硫酸铵0.28％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；

接种量为摇瓶种子：一级种子培养液的体积比＝1.0％，将摇床种子接入灭菌后的一级种子培养液经过培养制成一级种子，一级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃，通风量1.0vvm、培养周期13h。

所述的二级种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：

葡萄糖2.7％；麦芽糖1.8％；豆粉0.95％；硫酸铵0.28％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；

接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝17％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃，通风量0.95vvm，培养周期9.5h。

其余内容与实施例1相同。

申请人对实施例1-5中的发酵收率及所制备的产品粘度进行了检测，相关结果如下：

发酵收率(g/L)发酵制备的产品粘度(cp)实施例15.01550实施例25.21600实施例35.41580实施例45.51650实施例55.281630