一种在鱼类生殖系细胞中特异性表达基因的3’UTR区序列及其应用

摘要

本发明提供一种在牙鲆原始生殖细胞中调节基因表达的3′UTR区序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；该3′UTR区序列用于调控基因在牙鲆原始生殖细胞中进行表达。本发明的3′UTR区序列为牙鲆鱼特有的序列，可以用于鲆鲽鱼、斑马鱼等鱼类生殖系细胞的示踪以及在鱼类生殖系细胞中外源基因特异表达的定位；本发明为牙鲆等鱼类原始生殖细胞的识别、标记、跟踪、分离奠定了基础，同时为开展鱼类的性别分化机制以及生殖系细胞发生发育研究提供了技术方法。

说明书

技术领域

本发明属于鱼类细胞研究技术领域，具体涉及一种在鱼类生殖系细胞中特异性表达基因的3'UTR区序列及其应用。

背景技术

牙鲆，俗称牙片，为鲆鲽鱼类，属于鲽形目、牙鲆科、牙鲆属，是我国重要的海水养殖鱼类，该物种具有性别二态性。为了获得更多的雌性个体，近年来针对牙鲆等鲆鲽鱼类的养殖进行了性别控制育种、雌核发育和多倍体育种等多种育种方法的尝试，但是对鱼类生殖腺的发生和发育研究仍然面临诸多困难。为此，对鱼类原始生殖细胞(PGCs)进行特异性的识别和分离培养，并通过冷冻保存技术对优良种质鱼类的PGCs进行保存，不仅可以为鱼类生殖调控进行深入研究，也可为鱼类优良种质的保存提供新的技术手段和方法。然而，有关于鲆鲽鱼类PGCs特异性的识别和标记的相关研究尚未见到报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种在鱼类生殖系细胞中调节基因表达的3′UTR区序列，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种3′UTR区序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；

上述的3′UTR区序列用于调控基因在牙鲆原始生殖细胞中进行表达；

作为实施例的优选，所述基因为标记基因，例如绿色或红色等荧光蛋白基因；

本发明再一个方面提供一种重组报告载体质粒，其中插入有上述的3′UTR区序列；

本发明另一个方面提供一种研究原始生殖细胞发生和发育的方法，是在原始生殖细胞中转入上述的报告载体质粒体外合成的mRNA。

本发明的3′UTR区序列为牙鲆鱼特有的序列，可以用于鲆鲽鱼、斑马鱼等鱼类生殖系细胞的示踪以及在鱼类生殖系细胞中外源基因特异表达的定位；本发明为牙鲆等鱼类原始生殖细胞的识别、标记、跟踪、分离奠定了基础，同时为开展鱼类的性别分化机制以及生殖系细胞发生发育研究提供了技术方法。

附图说明

图1：3′UTR区序列的核苷酸序列图；

图2：3'UTR RACE第一轮电泳图；

图3：3'UTR RACE第二轮电泳图；

图4：胚胎早期对PGCs的跟踪结果图；

图5：体节期跟踪结果图；

图6：出膜前跟踪结果图；

图7：出膜后跟踪结果图。

具体实施方式

原始生殖细胞(PGCs)是生殖细胞的祖细胞，在生殖腺形成之前便在胚胎的特定位置特化形成，之后迁移到原始生殖腺即性原基前的生殖细胞，在性腺分化过程中分化为卵原细胞和精原细胞，并进一步发育成卵母细胞和精母细胞，随后经过发育最终产生成熟的配子--卵子和精子。

UTR(Untranslated Regions)即非翻译区，是信使RNA(mRNA)分子两端的非编码片段。3'UTR区是从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴(Poly-A)的末端。3'UTR区是miRNA作用时结合的主要位置，引起该基因mRNA的降解，与DNA转录不大相关，主要影响的是mRNA翻译。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：3′UTR区序列的筛选

1、RNA提取

牙鲆精巢或卵巢的总RNA采用Trizol(Invitrogen)法提取，具体步骤如下：取约0.1g牙鲆性腺，加入1mL Trizol，电动匀浆，室温放置5min，使其充分裂解后12,000rpm离心5min。将上清转移到新的干净离心管，加入氯仿0.2mL，温和混匀，室温放置15min。4℃12,000rpm离心15min，吸取上层水相，至另一离心管中。加入0.5ml异丙醇,轻轻混匀，-20℃放置20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底。加入预冷的75％乙醇1mL，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃,8,000rpm离心5min，尽量弃上清。置于超净台中使乙醇挥发。加入DEPC水(无RNA酶)50ul，55℃水浴10min使RNA溶解，取出后置于冰上。加入DNAaseI，37℃水浴2h，去除DNA。利用博迈德的RNA clean清洁纯化试剂盒去除蛋白质(具体步骤见说明书)，最后用30ulDEPC水溶解RNA。取1ul电泳检测质量及完整度，取1ul测吸光度检测样品浓度。剩余RNA样品-80℃保存。

2、SMARTer 3’RACE cDNA文库的建立

SMARTer 3’RACE cDNA文库的合成利用BD SMART^TMRACE>

配制反应体系:RNA 1ug，3’CDS Primer 1ul，Rnase-free H₂O补足5ul。混匀，瞬时离心；70℃，2min；冰上2min,瞬时离心；加入5ul反应体系：5*First-strand>TMReverse>

3、基因3'UTR的获得

利用巢式PCR扩增基因的3’UTR区，PCR所用的引物如下：

Nested Universal Primer A(NUP)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT，(10uM)

3’-GSP-1 GACCTCCCTGTGAACTTGGATGGAAATG

3’-GSP-2 AGCGATGCTGCAGAGATGGAGAAA

扩增反应体系(25ul)如下：

3’RACE模板1ul,

10x Taq酶buffer 2.5ul,

dNTP 2.0ul,

NUP 0.5ul,

基因特异性引物0.5ul,

ddH₂0>

将RACE一轮PCR产物跑检测胶(图2),RACE二轮PCR产物跑回收胶(图2)，将目的条带回收纯化。连接到PMD19-T载体上，送测序；获得了3′UTR区序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

实施例2：针对基因3′UTR区序列构建重组报告载体

1、构建基因3'UTR报告载体

1)针对基因3’UTR区设计一对两端带有限制性内切酶位点的PCR引物，其中5’和3’引物上加入了一个BamHI和SacI的酶切位点，进行PCR。其引物如下：

5’-primer:CGCGGATCCATTGTTCGCTCCACGCA

3’-primer:CGAGCTCCTCCTGCTCACTCTGGAAAC

PCR反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30s，循环35次，72℃后延伸10min PCR获取目的片段，

2)利用胶回收试剂盒(TM16090646)回收扩增的基因3’UTR片段，连接在pMD19-T载体上，利用氨苄抗性筛选带有目的片段的阳性菌。

3)利用限制性内切酶BamHI和SacI分别切开带有牙鲆基因3’UTR的质粒和带有SP6启动的EGFP-nanos3 3’UTR在体质粒，并分别使用胶回收试剂盒(TM1609 0646)回收基因3’UTR和除去nanos3 3’UTR的载体片段；

4)使用T4连接酶将牙鲆基因3’UTR基因片段和载体片段链接起来，构建成由SP6启动的并带有所述基因3'UTRE的荧光报告载体。

实施例3：带有绿色荧光的基因3′-UTR区序列特异性识别斑马鱼原始生殖细胞

1、体外合成带有绿色荧光的基因的3′-UTR mRNA

1)对实例2的第4)步获得的报告载体进行线性化，使用KpnI对载体进行线性化，应用酚氯仿法对线性化的载体进行回收，用10ul DEPC水溶解。

2)体外合成RNA

使用mMESSAGESP6Kit(Ambion)试剂盒体外合成mRNA。2×NTP/CAP 10ul,10×Reaction Buffer 2ul,Linear template DNA 1ug，SP6Enzyme Mix 2ul,加DEPC水补至20ul，混匀瞬离后，37℃反应2h。想反应体系中加入1ul DnaseI，37℃孵育15min，取1ul跑胶检测。加入115ul的DEPC水和15ul的NH₄AC，终止反应。加入150ul氯仿：苯酚(1:1)涡旋震荡后12000rpm离心1min，取上清加入新的1.5mL离心管中,并向原管中加入50ulDEPC水，涡旋震荡后12000rpm离心1min，取上清加入上一步的1.5mL离心管中。加入200ul的氯仿，涡旋震荡后12000rpm离心1min，取上清加入新的1.5mL离心管中，并加入200ul异丙醇，放入-80℃沉淀至少1h。4℃，12000rpm离心15min，吸弃异丙醇后再加入200ul>

2、显微注射验证基因的3'UTR功能

分别取1ul带有绿色荧光的基因的3'UTR mRNA和1ul RFP-P.O nanos3 3'UTR mRNA稀释至400ng/ul，然后两者1:1混匀，吸取2ul混和好的RNA溶液在一细胞时期共注射到斑马鱼胚胎中，对基因3'UTR功能验证，nanos3 3'UTR已有报道能标记斑马鱼PGCs细胞，用来作为阳性对照。注射后放在28℃的恒温箱中孵育，并每隔一段时间对注射的斑马鱼胚胎进行绿色和红色荧光检查，基因3'UTR功能验证。

结果显示，在桑葚胚期就可以检测到绿色荧光见图4a,其中b和c分别是原肠晚期正面和侧面荧光照片，结果显示这一时期已经能清清晰的看到PGCs簇。

在体节期，可清晰的看到基因3'UTR所标记的带有绿色荧光的PGCs簇和nanos3 3'UTR所标记的带有绿红色荧光的PGCs簇完全重合见图5；其中d、e、f为带有绿色荧光基因3'UTR标记PGCs结果，d’、e’、f’为带有红色荧光的nanos3 3'UTR标记PGCs结果。

出膜前以及出膜后的跟踪结果分别见图6和图7，其中g、h、i为带有绿色荧光基因3'UTR标记PGCs结果，g’、h’、i’为带有红色荧光的nanos3 3'UTR标记PGCs结果。

以上结果证明带有绿色荧光的基因3'UTR能和RFP-P.O nanos3 3'UTR实现共定位，其中带有基因3'UTR的质粒表达产物能成功的识别、标记斑马鱼PGCs，实现斑马鱼PGCs活体标记，并且荧光结果显示比nanos3 3'UTR特异性更强。