脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法

摘要

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法，其中，脂肪间充质干细胞冻存液，包括如下重量份数的组分：RPMI‑1640培养基80‑88份；FBS为2‑5份；环丁砜1‑2份；5 wt%乙醇1.5‑2.5份；10 wt%乙二醇0.8‑1.2份；10 wt%1,2‑丙二醇0.8‑1.2份；吐温80为0.3‑0.7份，甘油0.5‑1.5份，50U/mL青霉素0.01‑0.05份；海藻糖0.5‑1份；聚乙烯吡咯烷酮0.5‑0.8份；琼脂粉0.2‑0.6份。本发明对脂肪间充质干细胞具有不含毒性且冻存效果好的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞冻存技术领域，更具体地说，它涉及一种脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法。

背景技术

干细胞是一类原始且未特化的多潜能细胞，具有自我复制的能力。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。脂肪间充质干细胞是干细胞中的一种重要类型，研究发现其具有免疫调节的作用。

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。温度的变化主要取决于降温或升温方法所引起的热传导的边界条件，也受细胞复融过程中潜热效应的影响。为了将冻融过程中细胞的损伤降至最低，必须进一步优化化学和温度操作过程。但需要在降温前加入一种或两种低温保护剂，在溶解后又将其去除。在整个冷冻保存过程中，干细胞会受到降温速度、储存温度深浅、冷冻保护剂组合等因素的影响。因此，需要对各影响因素进行综合考虑。

申请公布号为CN104472474A、申请公布日为2015年04月01日的中国专利公开了一种人脂肪间充质干细胞冻存液，所述人脂肪间充质干细胞冻存液由人血浆和二甲基亚砜组成，人血浆与二甲基亚砜的体积比为9:1。

一种造血干细胞冻存的方法及保护剂，在无菌条件下，将造血干细胞悬液或骨髓液与干细胞保护剂混合冷冻保存，所述的干细胞保护剂成分包括：二甲基亚砜，1640无菌培养基和血液保存液Ⅰ，三者体积比例为9-10∶5∶5-6，所述的干细胞保护剂体积占到造血干细胞悬液或骨髓液与干细胞保护剂的混合物的19-21％。

现有技术采用的二甲基亚砜具有较强的穿透细胞的能力，降低细胞冰点，从而减少冰晶的形成和对造血干细胞的损伤，但二甲基亚砜具有毒性，与蛋白质疏水基团发生作用，会导致蛋白质变性，从而使冻存的人脂肪间充质干细胞受到损坏，甚至对人脂肪间充质干细胞的存活率造成不利，造成冻存效果不佳。因此，一种不含有二甲基亚砜并形成较好的干细胞冻存效果的冻存液具有一定的商业价值。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的一在于提供一种干细胞冻存液，其解决了二甲基亚砜在干细胞冻存时，其毒性会损坏干细胞，从而降低细胞存活率的问题，具有不含有二甲基亚砜且冻存效果好的优点。

为实现上述目的一，本发明提供了如下技术方案：

一种脂肪间充质干细胞冻存液，包括如下重量份数的组分：

RPMI-1640培养基80-88份；

FBS为2-5份；

环丁砜1-2份；

乙醇1.5-2.5份；

乙二醇0.8-1.2份；

1,2-丙二醇0.8-1.2份；

吐温80为0.3-0.7份，

甘油0.5-1.5份，

青霉素0.01-0.05份；

海藻糖0.5-1份；

聚乙烯吡咯烷酮0.5-0.8份；

琼脂粉0.2-0.6份；

所述乙醇的质量分数为5wt％；所述乙二醇的质量分数为10wt％；所述1,2-丙二醇的质量分数为10wt％；所述FBS的浓度为所述青霉素的浓度为50U/mL。

本申请中采用的RPMI-1640培养基和FBS，含有多种脂肪间充质干细胞自身无法合成的氨基酸，为其提供其生存所需的氨基酸及其他营养成分，在冻存前为脂肪间充质干细胞提供营养物质，并且可提供脂肪间充质干细胞复苏时所需的养分。环丁砜为极性溶剂，具有优异的热稳定性，在脂肪间充质干细胞冻存时的低温条件下仍可保持良好的稳定性，使本申请中的脂肪间充质干细胞冻存液体系保持稳定，但环丁砜具有腐蚀性。吐温80和甘油较为温和且均具有良好的稳定性，且经研究表明，通过两者与琼脂粉相互配合，形成粘稠状的保护层，包覆在环丁砜外部，从而减少环丁砜与脂肪间充质干细胞之间的接触，从而降低环丁砜对其的腐蚀性，减少对脂肪间充质干细胞的损伤，在冻存过程中对其保护并提高其冻存存活率。同时，保护层以及被其包覆的环丁砜在乙醇、乙二醇、1，2-丙二醇形成的混合体系中均匀分散，从而对脂肪间充质干细胞提供全面的保护。

乙醇具有杀菌作用的同时，还具有使脂肪间充质干细胞脱水的作用，脱除其中部分水分，减少冻存过程中干细胞内部形成的冰晶对细胞造成损伤。乙二醇、甘油可渗透至干细胞内部，降低干细胞内部与申请中的脂肪间充质干细胞冻存液之间的浓度差，控制细胞内水分向细胞外渗透的程度，从而避免干细胞过分脱水而皱缩。

聚乙烯吡咯烷酮是一种水溶性高分子化合物，具有优异的生理惰性和生理相容性，为脂肪间充质干细胞提供较易生存的液态环境并且不参与细胞的新陈代谢，且具有良好的胶体保护作用。海藻糖在高寒条件下具有保护干细胞蛋白不变性失活的作用。且经研究表明，聚乙烯吡咯烷酮、吐温80、甘油、琼脂粉与海藻糖相互配合使用，使本申请中的冻存液的液态体系保持稳定，并在该体系形成膜状物质，通过该膜状物质承载和包覆脂肪间充质干细胞，可防止其在冻存过程中沉淀至容器底部堆积成团，使脂肪间充质干细胞分散且受到周围冻存液的浸润，并在冻存过程中受到保护，减少其损伤，从而提高脂肪间充质干细胞的冻存存活率。

青霉素是一种高效的抗生素，添加浓度为50U/mL的青霉素与5wt％乙醇，10wt％乙二醇和10wt％1，2-丙二醇共同配合使用，既可以提高本申请中脂肪间充质干细胞冻存液的抵抗细菌性感染的功能，使置入的脂肪间充质干细胞的周围环境不易被细菌感染，延长无菌的效力，使被冻存时的脂肪间充质干细胞的外界无杂菌感染。

乙醇，乙二醇和1，2-丙二醇为无毒无害的醇类溶剂，具有优异的溶解作用，可使环丁砜、甘油、吐温80、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、RPMI-1640培养基和FBS等组分充分溶解于其中。

进一步优选为：包括如下重量份数的组分：

RPMI-1640培养基86份；

FBS为2.5份；

环丁砜1.6份；

乙醇2.3份；

乙二醇1.1份；

1,2-丙二醇1.1份；

吐温80为0.5份，

甘油1.3份，

青霉素0.03份；

海藻糖0.6份；

聚乙烯吡咯烷酮0.7份；

琼脂粉0.5份；

所述乙醇的质量分数为5wt％；所述乙二醇的质量分数为10wt％；所述1,2-丙二醇的质量分数为10wt％；所述青霉素的浓度为50U/mL。

在本申请中，经研究发现，以该重量份数制备获得的脂肪间充质干细胞冻存液的冻存效果最佳。

进一步优选为：还包括非渗透性冷冻保护剂，所述非渗透性冷冻保护剂的重量份数为1-1.5份，所述非渗透性冷冻保护剂选取羟乙基淀粉、葡聚糖中的至少一种。

羟乙基淀粉和葡聚糖均为大分子物质，无法渗透进入脂肪间充质干细胞内部，可优先与本申请中脂肪间充质干细胞冻存液中的水分子反应，从而降低其中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成，在脂肪间充质干细胞外部保护，减少冰晶对其细胞膜产生损伤。经研究发现，羟乙基淀粉可与甘油相互配合作用而增加粘稠度；葡聚糖与吐温80产生配合作用而使粘稠度增加。

进一步优选为：还包括润滑剂，所述润滑剂的重量份数为0.3-0.5份，所述润滑剂选取PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000中的至少一种。

PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000在本申请中的脂肪间充质干细胞冻存液中具有较好的润滑作用，与甘油、吐温80、羟乙基淀粉相互配合作用，增加整体的流动性，防止凝结成一团。PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000可调节粘度，防止形成的保护层过于粘稠，在冻存时，可使被包覆的环丁砜发挥良好的稳定性，还可减少对脂肪间充质干细胞的损伤，从而提高其冻存的存活率。

本发明的目的二在于提供一种干细胞冻存方法。

为实现上述目的二，本发明提供了如下技术方案：

一种采用权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞冻存方法，包括如下步骤：

S1，将环丁砜，5wt％乙醇，10wt％乙二醇，10wt％1,2-丙二醇，吐温80，甘油和琼脂粉充分混合，形成辅助剂；

S2，向S1中获得的辅助剂中加入RPMI-1640培养基，FBS，青霉素，海藻糖，聚乙烯吡咯烷酮，充分混合，形成冻存液混合物；

S3，取临床上人体腹部皮下脂肪组织，经PBS浸泡，清洗，离心，沉淀，获得脂肪间充质干细胞；

S4，将S3中获得的脂肪间充质干细胞进行接种和培养，取对数生长期的脂肪间充质干细胞，清洗后置入S2中获得的冻存液混合物中，在冰浴中，充分温和混合1.5-2h后，形成脂肪间充质干细胞混合物；

S5，将S4中获得的脂肪间充质干细胞混合物以1～2℃/min的速率进行降温，至温度降至-20～-25℃，获得第一阶段低温脂肪间充质干细胞混合物；

S6，将S5中获得的第一阶段低温脂肪间充质干细胞混合物放置于-80℃的冰箱内过夜，获得第二阶段低温脂肪间充质干细胞混合物；

S7，将S6中获得的第二阶段低温脂肪间充质干细胞混合物置于液氮中进行冷冻保存。

本申请中，先将环丁砜，5wt％乙醇，10wt％乙二醇，10wt％1,2-丙二醇，吐温80，甘油、琼脂粉充分混合，形成辅助剂，使环丁砜被充分溶解，且吐温80，甘油和琼脂粉形成的粘稠状的保护层将其包覆，在脂肪间充质干细胞与环丁砜之间形成阻隔，降低环丁砜对脂肪间充质干细胞的腐蚀。

再将RPMI-1640培养基，FBS，青霉素，海藻糖，聚乙烯吡咯烷酮进行充分混合，形成第二辅助剂，使聚乙烯吡咯烷酮、吐温80、甘油、琼脂粉与海藻糖相互配合使用，形成膜状物质以承载和包覆脂肪间充质干细胞，防止脂肪间充质干细胞在冻存过程中沉淀至容器底部堆积成团，使其较为分散且受到周围冻存液的浸润，并在冻存过程中受到保护，减少其损伤，从而提高脂肪间充质干细胞的冻存存活率。

且本申请依次经过冰浴、第一阶段低温、第二阶段低温和液氮的模式，使脂肪间充质干细胞所受到的外界环境的温度逐步降低，从而使其内部的水分逐渐透出并减少内部冰晶形成，从而减少其受损的可能性。

进一步优选为：所述S1的辅助剂中加入非渗透性冷冻保护剂并充分混合。

非渗透性冷冻保护剂无法渗透进入脂肪间充质干细胞内部，可优先与辅助剂中的水分子反应，从而降低其中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成，在脂肪间充质干细胞外部保护，减少冰晶对其细胞膜产生损伤。

进一步优选为：所述S1的辅助剂中加入润滑剂并充分混合。

在辅助剂中加入润滑剂进行润滑，与甘油、吐温80、羟乙基淀粉相互配合作用，增加辅助剂的流动性，防止膜状物质成团。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、吐温80、甘油、琼脂粉相互配合，形成粘稠状的保护层，包覆在环丁砜外部，从而减少环丁砜与脂肪间充质干细胞之间的接触，从而降低环丁砜对其的腐蚀性，减少对脂肪间充质干细胞的损伤，在冻存过程中对其保护并提高其冻存存活率。

2、聚乙烯吡咯烷酮、吐温80、甘油、琼脂粉与海藻糖相互配合使用，使本申请中的冻存液的液态体系保持稳定，并在该体系形成膜状物质，通过该膜状物质承载和包覆脂肪间充质干细胞，可防止其在冻存过程中沉淀至容器底部堆积成团，使脂肪间充质干细胞分散且受到周围冻存液的浸润，并在冻存过程中受到保护，减少其损伤，从而提高脂肪间充质干细胞的冻存存活率。

具体实施方式

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

实施例1：脂肪间充质干细胞冻存方法，包括如下步骤：

S1，将1.4份环丁砜，1.5份5wt％乙醇，1份10wt％乙二醇，0.85份10wt％1,2-丙二醇，0.4份吐温80，0.9份甘油和0.6份琼脂粉充分混合，形成辅助剂；

S2，向S1中获得的辅助剂中加入80份RPMI-1640培养基，5份FBS，0.05份青霉素，0.8份海藻糖，0.5份聚乙烯吡咯烷酮，充分混合，形成冻存液混合物；

S3，取临床上人体腹部皮下脂肪组织，经PBS浸泡，清洗，离心，沉淀，获得脂肪间充质干细胞；

S4，将S3中获得的脂肪间充质干细胞进行接种和培养，取对数生长期的脂肪间充质干细胞，清洗后置入S2中获得的冻存液混合物中，在冰浴中，充分温和混合1.5-2h后，形成脂肪间充质干细胞混合物；

S5，将S4中获得的脂肪间充质干细胞混合物以1～2℃/min的速率进行降温，至温度降至-20～-25℃，获得第一阶段低温脂肪间充质干细胞混合物；

S6，将S5中获得的第一阶段低温脂肪间充质干细胞混合物放置于-80℃的冰箱内过夜，获得第二阶段低温脂肪间充质干细胞混合物；

S7，将S6中获得的第二阶段低温脂肪间充质干细胞混合物置于液氮中进行冷冻保存。

实施例2：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例1的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中各组分的重量份数如表1所示。

实施例3：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例2的区别在于，在S1中添加了0.5份羟乙基淀粉、0.5份葡聚糖，充分混合。

实施例4：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例3的区别在于，在S1中添加了0.1份PEG-4000、0.1份PEG-6000、0.1份PEG-8000，充分混合。

实施例5-10：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例4的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中各组分的重量份数如表1所示。

对比例1：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中不含环丁砜、吐温80、甘油、琼脂粉，且冻存过程中，先将含有脂肪间充质干细胞的脂肪间充质干细胞冻存液以10℃/min的速率降温至-90℃，最后迅速转移至液氮-196℃的环境储藏。

对比例2：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中不含环丁砜、吐温80、甘油、琼脂粉。

对比例3：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中不含甘油和琼脂粉。

对比例4：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中不含吐温80和琼脂粉。

对比例5：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中不含甘油和吐温80。

对比例6：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中环丁砜的重量份数为0.2份。

对比例7：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中含有0.1份吐温80和0.2份甘油，但不含有琼脂粉。

对比例8：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中含有0.1份吐温80和0.1份琼脂粉，但不含有甘油。

对比例9：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中含有0.3份甘油和0.05份琼脂粉，但不含有吐温80。

对比例10：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中不含聚乙烯吡咯烷酮、吐温80、甘油、琼脂粉与海藻糖。

对比例11：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中不含聚乙烯吡咯烷酮。

对比例12：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中含有的聚乙烯吡咯烷酮的重量份数为0.2份。

对比例13：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中不含海藻糖。

对比例14：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中含有的海藻糖的重量份数为0.15份。

对比例15：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中的聚乙烯吡咯烷酮的重量份数为0.2份，海藻糖的重量份数为0.15份。

对比例16：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中不含有非渗透性冷冻保护剂。

对比例17：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中含有的非渗透性冷冻保护剂的重量份数为0.5份。

对比例18：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中不含有润滑剂。

对比例19：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中含有的润滑剂的重量份数为0.1份。

对比例20：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，脂肪间充质干细胞冻存液中含有的非渗透性冷冻保护剂和润滑剂的重量份数分别为0.5份和0.1份。

对比例21：脂肪间充质干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，将二甲基亚砜代替环丁砜，重量份数仍为1份。

对比例22：干细胞冻存方法，与实施例5的区别在于，采用脐血干细胞，提取过程为：按1：5(V：V)加入60g/L羟乙基淀粉到脐血袋中，以500r/min倒置离心5min，垂挂挤出红细胞，混匀，正置，以1200r/min离心13min，以分浆夹去除血浆部分，留少许血浆在袋子里以免损耗干细胞。去红细胞和血浆后的体积为36～48mL，加入含100mL/L AB型血清的RPMI1640培养液，调整细胞密度至(2～4)×10¹⁰/L。

表1实施例1-10脂肪间充质干细胞冻存液中各组分及相应重量份数

本申请的实施例和对比例中的脂肪间充质干细胞冻存液和干细胞冻存液的配制、脂肪间充质干细胞和干细胞的冻存操作均在无菌操作间中进行，且冻存液均为现配现用。

其中，-80℃冰箱购自日本三洋公司；无菌操作间购自为苏州苏净集团；冻存袋购自美国百特公司，规格为200mL/袋；羟乙基淀粉购自德国费森尤斯卡比有限公司；RPMI-1640培养基、FBS、青霉素、琼脂、海藻糖、吐温80、甘油、购自南京奥多福尼生物科技有限公司；环丁砜、羟乙基淀粉、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、乙醇、乙二醇、1,2-丙二醇购自上海试剂二厂。

试验方法：将同一批次提取获得的脂肪间充质干细胞平均分成31组，每组100例样品，依次分别采用实施例1-10以及对比例1-21的方法配制获得的脂肪间充质干细胞冻存液在低温储存袋中进行相应的冻存试验；将按照对比例22的提取方法获得的脐血干细胞样品采用对比例22相应的冻存方法在低温储存袋中进行冻存试验，冻存试验时间为4个月。试验期结束后，将相应的经冻存后的样品在37℃恒温水浴中复苏，观察每组的冻存袋中样品的沉淀情况，记录；迅速采用台盼蓝拒染率法测每组样品相应的存活率，记录数据并进行平均处理和比较分析。

试验结果：实施例1-10以及对比例1-22获得的样品的台盼蓝拒染率和样品沉淀情况分别如表2和表3所示。

表2实施例1-10获得样品的台盼蓝拒染率和样品沉淀情况

表3对比例1-22获得样品的台盼蓝拒染率和样品沉淀情况

由表2和表3可知，经实施例1-10配制获得的脂肪间充质干细胞冻存液对脂肪间充质干细胞进行冻存，复苏后的脂肪间充质干细胞的台盼蓝拒染率较高，说明冻存期间死亡的脂肪间充质干细胞较少，说明环丁砜、吐温80、甘油、琼脂形成的粘稠状的保护层对提高脂肪间充质干细胞存活率起到了作用。且在储存袋底部未发现样品的沉淀，说明聚乙烯吡咯烷酮、吐温80、甘油、琼脂与海藻糖形成的膜状物质对防止脂肪间充质干细胞在冻存过程中沉淀至容器底部堆积成团起到了作用。而经比例1和对比例2配制获得的脂肪间充质干细胞冻存液对脂肪间充质干细胞进行冻存，复苏后的脂肪间充质干细胞的台盼蓝拒染率非常低，表明脂肪间充质干细胞的死亡率很高，说明不含环丁砜、吐温80、甘油、琼脂，以及采用的冻存方法均会对脂肪间充质干细胞的存活率造成极大的影响。经对比例3-9配制获得的脂肪间充质干细胞冻存液对脂肪间充质干细胞进行冻存，复苏后的脂肪间充质干细胞的台盼蓝拒染率很低，说明采用与实施例5相同的冻存方法，但环丁砜、吐温80、甘油、琼脂的重量份数不在要求的范围内，也会对脂肪间充质干细胞的存活率造成很大的影响。经对比例10-20配制获得的脂肪间充质干细胞冻存液对脂肪间充质干细胞进行冻存，复苏后的脂肪间充质干细胞的台盼蓝拒染率有所提高，但比实施例1-10中的脂肪间充质干细胞的台盼蓝拒染率仍低很多，说明聚乙烯吡咯烷酮、吐温80、甘油、琼脂、海藻糖的重量份数不在所要求的范围内，会对脂肪间充质干细胞的存活率造成较大的影响，也在一定程度上影响了脂肪间充质干细胞在储存袋中沉淀情况。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。