一种化合物或其盐、奥特阿罗刺盘孢菌的发酵产物、医药组合物或保健食品及用途

摘要

本发明提供一种式(I)化合物或其盐，其中，R

说明书

技术领域

本发明系关于一种新颖的化合物，且特别关于一种具免疫调节功效的新颖化合物。又，本发明系关于一种奥特阿罗刺盘孢菌(Colletotrichum aotearoa)的发酵产物，其含有上述新颖化合物。

背景技术

内生菌(endophyte)是一类生长于植物组织内，不具有明显生活周期，也不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。内生菌植物微生态系统是自然界组成的一重要部分。在过去20年，约有一半的药物来源于天然产物或天然的先导化合物(lead compound)，因此从天然物中筛选生物活性成分是发展新药的有效途径之一。

在越来越多有关内生菌的研究报导中发现，内生菌种类及数量庞大，分布的宿主植物也涵盖广泛，其代谢途径及二次代谢产物也会因宿主植物或微生物所处环境的不同，而有丰富的多样性，这也成为天然药物研究丰富的潜在资源。

目前有关内生菌药用活性物质的报导包括了，在1993年由Stierle等人首次从太平洋紫杉(Taxus brevifolia)韧皮部分离出内生菌(Taxomyces andreanae)，其二次代谢产物含有紫杉醇和紫杉烷类化合物，而紫杉醇(taxol)也已广泛被报导对于卵巢癌、乳癌等一些癌症有其疗效；在抗生素方面，Li等人从三尖杉、南方红豆杉和香榧中分离到一些内生真菌能产生一种或多种植物病原真菌的抑制剂；在抗降血糖方面，Zhang和Salituro从非洲刚果热带植物分离得到的内生菌(Pseudomassaria sp.)所产的二次代谢产物中分离出一种似胰岛素的小分子化合物，在大鼠模型口服实验中，能明显降低血糖浓度。

发炎为人体正常防御反应，以对抗外来病原菌的保护机制。当急性发炎 反应产生，会活化巨噬细胞，嗜中性细胞与内皮细胞，并释放大量发炎介质而发生局部和全身性作用，而受到内毒素刺激的巨嗜细胞(macrophage)，可产生IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ、NO、CP-10及PGE2等细胞激素与化学激素(chemokines)，并具有吞噬能力(phagocytosis)，而这些激素在发炎中扮演极重要角色。其中包括IL-1β、IL-6、TNF-α为促发发炎细胞激素(pro-inflammatory cytokine)，而PGE2及白三烯(leukotriene)为脂质媒介物与发炎造成的发烧和血压降低有关。

而NO是由一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)产生，而NOS具有三类异构酶存在人体中，分别表现在神经、内皮、巨噬三种细胞中，其中iNOS(inducible NOS)为存在多种细胞中并可被诱导大量表现的酶，当巨嗜细胞被活化时可引发大量iNOS的表现，因而产生大量NO，达到对外来病原的伤害，当这些激素适量表现时，可促进免疫反应，减低感染的扩大。反之，过量或持续生成可能会造成组织伤害，因此抗发炎药物逐渐引起重视。

故，目前亟需一种获自天然产物的免疫调节组合物。

发明内容

本发明提供一种式(I)化合物或其盐，

其中，R¹为一糖基或氢，

R²为一取代或未经取代的C₁-C₁₀烷基，而R³与R⁴系独立地择自由下列所组成的群组：氢、卤素与一取代或未经取代的C₁-C₁₀烷基。

本发明也提供一种免疫调节医药组合物或保健食品，包括：前述的式(I)化合物或其盐；以及一药学上可接受的载体或盐类，其中该免疫调节医药组合物或保健食品具有一免疫调节的功效。

本发明还提供一种前述的式(I)化合物或其盐用于制备免疫调节药物或 保健食品的用途。

本发明另提供一种奥特阿罗刺盘孢菌(Colletotrichum aotearoa)的发酵产物，其中该奥特阿罗刺盘孢菌的发酵产物的形成方法，包括：将该奥特阿罗刺盘孢菌以一培养基进行一发酵培养，以形成一发酵液，其中于该培养基成分包括，包括：玉米淀粉；玉米浸液(corn steep liquor)；酵母萃取物；以及海盐。

本发明更提供另一种免疫调节医药组合物或保健食品，包括：前述的奥特阿罗刺盘孢菌的发酵产物；以及一药学上可接受的载体或盐类，其中该免疫调节医药组合物或保健食品具有一免疫调节的功效。

本发明还提供一种前述的奥特阿罗刺盘孢菌的发酵产物用于制备免疫调节药物或保健食品的用途。

又，本发明也提供一种新颖的奥特阿罗刺盘孢菌，其于在2015年6月12日寄存于德国微生物及细胞保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ,Inhoffenstraβe 7B 38124 Braunschweig Germany)，寄存编号为DSM 32067。

为了让本发明的上述和其他目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图示，作详细说明如下：

附图说明

图1显示本发明一实施例的化合物1的HMBCs(H→C),COSY(粗体线)与NOESY的二维关联性。

具体实施方式

在本发明的第一实施方式中，本发明提供一种新颖的化合物或其盐。

上述的新颖化合物具有如式(I)所示的分子式：

于式(I)中，R¹可包括一糖基或氢，但不限于此，又R²可包括，但不限于一取代或未经取代的C¹-C¹⁰烷基，而R³与R⁴则可独立地包括氢、卤素、一取代或未经取代的C₁-C₁₀烷基，但不限于此。

在一实施例中，于上述式(I)的化合物中，R¹可为一糖基。上述糖基的例子可包括，鼠李糖基(rhamnosyl)、异鼠李糖基(quinovosyl)、海藻糖基(fucosyl)等，但不限于此。在一特定实施例中，于上述式(I)的化合物中，R¹可为鼠李糖基，且上述鼠李糖基可为α鼠李糖基。

又，在一实施例中，于上述式(I)的化合物中，R²可为取代或未经取代的C₁-C₁₀烷基。上述取代或未经取代的C₁-C₁₀烷基可为，例如，甲基、乙基、丙基、丁基或戊烷基等，但不限于此。在一特定实施例中，R²为一未经取代的戊基。

此外，前述R³与R⁴所可独立地包括卤素的例子包括，氟、氯、溴或碘。在一实施例中，于上述式(I)的化合物中，R³与R⁴可独立地为取代或未经取代的C₁-C₁₀烷基。而上述取代或未经取代的C₁-C₁₀烷基的例子，可包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基或戊基等。在一特定实施例中，于上述式(I)的化合物中，R³与R⁴皆为甲基。

再者，上述式(I)的化合物的例子也可包括，一以式(II)表示的化合物，但不限于此：

其中R¹为α鼠李糖基。

本发明的新颖化合物，可具有一免疫调节的功效。上述免疫调节的功效可包括，但不限于抗发炎等。在一实施例中，本发明的新颖化合物具有抗发炎的功效。

又，本发明的新颖化合物具有抑制免疫细胞产生NO的功效，且不具有 细胞毒性。

在本发明的一第二实施方式中，本发明也提供一种免疫调节医药组合物或保健食品，其可包括任何前述本发明新颖的式(I)化合物与一药学上可接受的载体或盐类，但不限于此。

上述本发明的免疫调节医药组合物或保健食品具有一免疫调节的功效，而上述免疫调节的功效可包括抗发炎等，但不限于此。在一实施例中，本发明的上述免疫调节医药组合物或保健食品具有抗发炎的功效。

此外，本发明的上述免疫调节医药组合物或保健食品具有抑制免疫细胞产生NO的功效，且不具有细胞毒性。

在本发明一第三实施方式中，本发明还提供一种任何前述本发明新颖的式(I)化合物或其盐用于制备具免疫调节的功效的药物或保健食品。上述免疫调节的功效可包括抗发炎等，但不限于此。

在本发明一第四实施方式中，本发明更提供一种奥特阿罗刺盘孢菌(Colletotrichum aotearoa)的发酵产物，其中形成上述奥特阿罗刺盘孢菌的发酵产物的方法，可包括，但不限于，将奥特阿罗刺盘孢菌以一培养基进行一发酵培养，以形成一发酵液，以获得所述奥特阿罗刺盘孢菌的发酵产物。

又，在一实施例中，前述培养奥特阿罗刺盘孢菌的培养基的成分，可包括玉米淀粉、玉米浸液(corn steep liquor)、酵母萃取物与海盐，但不限于此。而于此实施例中，在前述培养基中，玉米淀粉的含量可为约27g/L-33g/L，玉米浸液的含量可为约9g/L-11g/L，酵母萃取物的含量可为约4.5g/L-5.5g/L，而海盐含量可为约1.8g/L-2.2g/L，但不限于此。

此外，对奥特阿罗刺盘孢菌所进行的发酵培养的温度可为约22-28℃，但不限于此。在一实施例中，对奥特阿罗刺盘孢菌所进行的发酵培养的温度可为约25℃。

另外，对奥特阿罗刺盘孢菌所进行的发酵培养的时间可为约12-16天，但不限于此。在一实施例中，对奥特阿罗刺盘孢菌所进行的发酵培养的时间可为约14天。

又，在另一实施例中，前述形成上述奥特阿罗刺盘孢菌的发酵产物的方法，在形成上述发酵液之后，还可更包括下列步骤，但不限于此。

首先将前述发酵液以一丁醇进行萃取，以获得一丁醇萃取液。

接着，将所获得的丁醇萃取液以一乙酸乙酯水溶液进行萃取，以获得一乙酸乙酯层与一水层。

然后，保留乙酸乙酯层，以获得所需的发酵产物。

前述所有奥特阿罗刺盘孢菌的发酵产物的实施例中所采用的奥特阿罗刺盘孢菌的例子可包括，在2015年6月12日寄存于德国微生物及细胞保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ,Inhoffenstraβe 7B 38124 Braunschweig Germany)的奥特阿罗刺盘孢菌(Colletotrichum aotearoa)，寄存编号为DSM 32067等，但不限于此。在一实施例中，前述奥特阿罗刺盘孢菌为在2015年6月12日寄存于德国微生物及细胞保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ,Inhoffenstraβe 7B 38124 Braunschweig Germany)的奥特阿罗刺盘孢菌(Colletotrichum aotearoa)，其寄存编号为DSM 32067。

上述本发明的奥特阿罗刺盘孢菌的发酵产物，可具有一免疫调节的功效。上述免疫调节的功效可包括，但不限于抗发炎等。在一实施例中，本发明的奥特阿罗刺盘孢菌的发酵产物具有抗发炎的功效。

又，本发明的奥特阿罗刺盘孢菌的发酵产物具有抑制免疫细胞产生NO及/或IL-6的功效，且不具有细胞毒性。

在本发明一第五实施方式中，本发明提供另一种免疫调节医药组合物或保健食品，其可包括任何前述本发明奥特阿罗刺盘孢菌的发酵产物与一药学上可接受的载体或盐类，但不限于此。

上述本发明的免疫调节医药组合物或保健食品具有一免疫调节的功效，而上述免疫调节的功效可包括抗发炎等，但不限于此。在一实施例中，本发明的上述免疫调节医药组合物或保健食品具有抗发炎的功效。

此外，本发明的上述免疫调节医药组合物或保健食品具有抑制免疫细胞产生NO及/或IL-6的功效，且不具有细胞毒性。

在本发明一第六实施方式中，本发明还提供一种任何前述本发明奥特阿罗刺盘孢菌的发酵产物用于制备具免疫调节的功效的药物或保健食品。上述免疫调节的功效可包括抗发炎等，但不限于此。

此外，在本发明一第七实施方式中，本发明还提供一种新颖的奥特阿罗刺盘孢菌(Colletotrichum aotearoa)，其于在2015年6月12日寄存于德国微 生物及细胞保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ,Inhoffenstraβe 7B 38124 Braunschweig Germany)，寄存编号为DSM 32067。

再者，于前述所有本发明的医药组合物中，所述药学上可接受的载体可包括，但不限于溶剂、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌与抗真菌试剂与一等渗透压与吸收延迟(absorption delaying)试剂等与药学投予相容者。对于不同的给药方式，可利用一般方法将医药组合物配制成剂型(dosage form)。

又，于前述所有本发明的医药组合物中，所上述药学上可接受的盐类可包括，但不限于盐类包括无机阳离子，例如，碱金属盐类，如钠、钾或胺盐，碱土金族盐类，如镁、钙盐，含二价或四价阳离子的盐类，如锌、铝或锆盐。此外，也可是为有机盐类，如二环己胺盐类、甲基-D-葡糖胺，胺基酸盐类，如精胺酸、离胺酸、组织胺酸、麸胺酸酰胺。

本发明所制备出药物给药可以口服、非口服、经由吸入喷雾(inhalation spray)或藉由植入贮存器(implanted reservoir)的方式。非口服可包括皮下(subcutaneous)、皮内(intracutaneous)、静脉内(intravenous)、肌肉内(intramuscular)、关节内(intraarticular)、动脉(intraarterial)、滑囊(腔)内(intrasynovial)、胸骨内(intrasternal)、蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位内(intralesional)注射以及灌注技术。

口服成分的形式可包括，但不限定于，药锭、胶囊、乳剂(emulsions)、水性悬浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)与溶液。

本发明的医药组合物可投予至植物或动物等。上述可包括鱼类、禽类、哺乳动物等，但不限于此。哺乳动物的例子可包括，但不限于，猫、狗、牛、马、猪、人类等。在一实施例中，医药组合物可投予至人类。

实施例

A.材料与方法

1.NO与IL-6产生的测定

从台湾财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)获得小鼠巨噬细胞株 (macrophage cell line)(RAW 264.7)(BCRC 60001)。将细胞在37℃，以添加10％胎牛血清(Gibco)、4.5g/L葡萄糖、4mM麸酰胺酸(glutamine)、盘尼西林(100units/mL)与链霉素(streptomycin)(100μg/mL)的DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)，于5％CO₂培养箱中的潮湿大气中进行培养。

将细胞在1μg/mL脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)(Sigma-Aldrich)存在下，以10、25、50μM的天然产物处理20小时。

经由Griess试剂分析(T.M.Dawson,V.L.Dawson,The Neuroscientist,1995,1,7-18)在培养基上清液中的NO浓度测定为亚硝酸盐(nitrite)，一NO的主要稳定产物，而使用MTT分析来测定细胞存活率(cell viabilities)(D.A.Scudiero,R.H.Shoemaker,K.D.Paull,A.Monks,S.Tierney,T.H.Nofziger,M.J.Currens,D.Seniff,M.R.Boyd,Cancer Res.,1988,48,4827-4833)。以小鼠IL-6ELISA Ready-SET-Go ELISA kit(eBiosciencee)，根据制造商建议，在细胞培养基上清液中测定IL-6产生的程度，并以微量盘式分析仪(microplate reader)(μ-Quant,Bio-Tek Instruments Inc.)来定量。

2.微生物材料发酵

金石榴(Bredia oldhamii Hook.f.)的叶子为在2009年于台湾，屏东县，牡丹乡牡丹池山，且由台湾高雄医学大学陈益升教授所鉴定。存证标本(Voucher specimen)(no.Chen 5695)寄存于高雄医学大学，药学院，药学系的标本室。

真菌菌株分离自金石榴叶。以rDNA-内转录间隔(internal transcribed spacer,ITS)区的序列进行分析，通过使用BLAST(nucleotide sequence comparison program)来搜寻NCBI的GenBank资料库，发现此菌株与奥特阿罗刺盘孢菌No.KC297063.1的ITS序列片段具有100％的相似度，因此将此菌鉴定为奥特阿罗刺盘孢菌(Colletotrichum aotearoa)。将此菌株于2015年6月12日寄存于德国微生物及细胞保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ,Inhoffenstraβe 7B 38124Braunschweig Germany)，寄存编号为DSM 32067。

将在9-cm Petri培养盘中的麦芽抽出物洋菜(malt extract agar,MEA)上的奥特阿罗刺盘孢菌菌株的两周大菌落裁剪放入培养瓶中与100ml蒸馏水混合30秒以制备用于液态发酵(liquid fermentation)的真菌接种物(inoculum)。将 10mL的真菌接种物添加至包含150mL液体培养基(成分：玉米淀粉，30g；玉米浸液(corn steep liquor)，10g；酵母萃取物，5g；海盐，2g，于1公升蒸馏水中，pH 6)的各个500-mL培养瓶中，并在以100转/分钟的速率的回旋式震荡器(rotary shaker)上，以25℃，无光照培养两周。获得共14.0L的真菌发酵液，且之后将其过滤以移除真菌菌丝(fungal mycelium)。

3.萃取与纯化

将奥特阿罗刺盘孢菌的液态发酵物(14.0L)以丁醇(Butanol,BuOH)进行萃取，以获得一丁醇萃取物(16.4g)。将此丁醇萃取物以乙酸乙酯-水(AcOEt-H₂O)(1:1；2L×3)分划，以产生一乙酸乙酯溶解片段(AcOEt-soluble>2O-soluble>

将活性乙酸乙酯溶解片段(4.5g)以CH₂Cl₂-MeOH(100:1)为主要洗提液(eluent)，进行硅胶管柱层析(column>2O–丙酮(acetone)(2:1)为洗提液，进行RP-18硅胶管柱层析，而产生14个片段(片段14-1至片段14-14)。再来，将片段14-10(132mg)以CH₂Cl₂–AcOEt(1:3)为洗提液，进行硅胶管柱层析，再产生4个片段(片段14-10-1至片段14-10-4)。然后，将片段14-10-3进一步以CH₂Cl₂–AcOEt(1:3)为洗提液来进行硅胶管柱层析，以产生化合物1。

4.化合物鉴定

(1)一般实验步骤

将熔点(Melting points)以一Yanaco微熔点仪器(micromelting point apparatus)测量且未进行修正。

使用一Jasco P-1020数位旋光仪(digital polarimeter)于CHCl₃中，来测量旋光性(optical>

经由Jasco UV-240光谱仪(spectrophotometer)于MeOH中，获得紫外光(UV)光谱。以一Perkin-Elmer 2000FT-IR光谱仪(spectrometer)来记录红外光(IR)光谱(neat或KBr)。以分别于600MHz(¹H)与150MHz(¹³C)操作的一Varian>

硅胶(70-230与230-400网目(mesh)；Merck)与球型(Spherical)C₁₈反相(reversed-phase)硅胶(RP-18；颗粒尺寸20-40μm；Silicycle)被用于管柱层析(column chromatography,CC)，而硅胶60F254(Merck)与RP-18F254S(Merck)被用于TLC与预备的(preparative)TLC。于本实施例中使用中压液相层析(medium-pressure liquid chromatography)。

化合物1被获得为具有[α]25D＝-134.4(c＝0.23,MeOH)的一光学活性(optically active)带白色粉末。使用ESI-MS与HR-ESI-MS来建立化合物1的分子式为C₂₂H₃₄O₇，其暗示六个不饱和度(degrees>-1)与一芳香环(aromatic>-1)的存在。UV吸收(λ_max>

¹H-NMR光谱(表1)显示一正戊基(n-pentyl>3(13)),1.38(br.s,CH₂CH₂(11,12)),1.46(m,H–C(10b)),1.59(m,H–C(10a)),1.64(m,CH₂(9))；δ(C)14.4(C(13)),23.7(C(12)),33.1(C(11)),26.4(C(10)),37.2(C(9))]、两个甲基附于苯环(benzene>3(15))；δ(C)11.6(C(14)),10.6(C(15))]、一个非等价亚甲基质子(non-equivalent>2(8)；δ(C)66.5(C(8)))，且也携带一个α-鼠李糖基(α-rhamnosyl)部分(moiety)[δ(H)1.32(d,J＝6.6,CH₃(6')),3.49(t,J＝9.6,H–C(4')),3.83(dd,J＝9.6,3.3,H–C(3')),4.01(dd,J＝9.6,6.6,H–C(5')),4.16(dd,J＝3.3,1.8,H–C(2')),4.80(d,>

¹H-、¹³C-NMR(表1)与DEPT光谱显示讯号，其针对四个一级碳(primary>1H-、>13C-NMR与DEPT光谱，其指出化合物1的结构具有一经完全取代的苯环。

表1、化合物1的¹H-与³C-NMR(DEPT)资料以CD₃OD、δ以ppm,J以Hz

COSY光谱(图1)显示关于化合物1的正戊基与α-鼠李糖基部分的关联性。而HMBC光谱(图1)显示从CH₂(3)至C(2)、C(4)、C(9)、C(3a)、C(7a)及从CH₂(8)至C(2),C(7)、C(3a)、C(7a)的关键关联性，以从CH₂(3)至C(9)与从H–C(2)至C(10)来建立化合物1的骨架，以确认正戊基部分附于C(2)，且从H–C(1')至C(7)来确认鼠李糖基部分是以α-方向O-连结(linkage)连接至C(7)。因此，化合物1为一异色满苷(isochroman>

根据NOESY试验的基础，来提出化合物1的相对组态(relative configuration)。从Hβ–C(8)和Hβ–C(3)与Hβ–C(2)的准-1-3-二轴交互作用(quasi-1,3-diaxial interactions))的观察，推测于C(2)的正戊基的α-方向。

根据上方光谱证据的基础，化合物1的结构被阐明为rel-(2S)-4,6-二甲基-2-戊基-7-O-α-鼠李糖基异色满-5-醇(rel-(2S)-4,6-dimethyl-2-pentyl-7-O-α-rhamnosylisochroman-5-ol)，命名为colletobredin A，其结构式如下方所示。

B.实验结果

经分离的化合物1的抗发炎活性，经由检验其对于在小鼠巨噬细胞株 (RAW 264.7)中的脂多醣-诱导的诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)依赖-NO之产生的抑制功效(表2)。

化合物1显示具有74.7μM的IC₅₀值的NO抑制活性。此外，于本实施例的RT-PCR分析指出LPS处理增加iNOS>

表2、化合物1对于经由RAW 264.7鼠源巨噬细胞(murine macrophage)对脂多醣的反应的NO产生的抑制作用

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

生物材料保藏信息

保藏生物材料的分类命名：奥特阿罗刺盘孢菌(Colletotrichum aotearoa)

保藏单位名称：德国微生物及细胞保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)

保藏单位地址：德国布伦瑞克市因霍芬街7B，邮编：38124(Inhoffenstraβe 7B 38124 Braunschweig Germany)

保藏日期：2015/6/12

保藏编号：DSM 32067。