抗氧化剂在消减动物体内真菌毒素残留中的应用

摘要

本发明属于生物防控技术领域，通过研究发现槲皮素、芦丁或者茶多酚能够激活未染毒的对虾肠道中的谷胱甘肽‑S‑转移酶（UGT）、葡萄糖醛酸转移酶（SULT）或者磺基转移酶（AANAT），从而促进II相酶的生物转化，通过在对虾饲料中添加诱导剂来诱导染毒对虾肠道内源解毒酶的活性来加速对虾体内毒素的代谢，降低或清除毒素的残留，确保对虾食品安全。

说明书

技术领域

本发明涉及生物防控技术领域，更具体地，涉及抗氧化剂在消减动物体内真菌毒素残留中的应用。

背景技术

T-2、AF、DON和OTA是广泛存在于自然界的真菌毒素，易污染农作物，从而影响以农作物作为原料的水产饲料，是水产饲料中强致癌、致畸、毒性的常见真菌毒素，且较低残留水平可带来较大食品安全风险。能够通过对虾、罗非鱼等大宗水产养殖链蓄积，危害水产动物甚至在其中蓄积，进而通过食物链传递给人畜，危害人畜健康，因此，控制与消除水产饲料的真菌毒素迫在眉睫。

真菌毒素进入生物体进行生物转化，生物转化是机体对外源化学物处置的重要环节，是机体维持稳态的主要机制。生物转化酶(代谢酶)在这一过程中起着非常重要的作用，使毒素类等外源物质排出体外或转化成其他物质排出体外，降低毒素对机体的损害。生物转化反应主要有Ⅰ相反应(氧化、还原、水解反应)和Ⅱ相反应(结合反应)。其中Ⅱ相反应是机体应对外源物质、维持内环境稳态的一种自我生理保障机制。外源物质结构不同，其在生物体内的Ⅱ相代谢反应类型也不同。谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase，GSTs)、葡萄糖醛酸转移酶(Uridine diphosphate glucuronyl transferase，UGT)、磺基转移酶(Sulfotransferase，SULT)、芳香胺N-乙酰化转移酶(Arylamine N-Acetyltransferase，NATs)和甲基转移酶(Methyltransferase，MT)是主要的Ⅱ相酶。这些酶能够保护机体免受毒性等物质及一些活性物质的侵害，降低毒素的危害，使其转化成其他物质或排出体外，因此也常称它们为Ⅱ相解毒酶或Ⅱ相抗氧化酶。

酶活性的高低直接影响反应过程，一般情况下高酶活会使代谢底物的生物转化速度增强，加快毒素的代谢速度，从而影响毒素对机体的作用大小。因此，诱导这些关键酶的基因表达或诱导其酶活增加能够有效地减少各种外来物质引发的相关疾病。常见的诱导物质如槲皮素、芦丁、茶多酚和莱菔硫烷等均可诱导Ⅱ相解毒酶，使其活性增强。采用诱导/激活法提升酶含量/活力，进而加速真菌毒素等外源物质的消解，有利于食品原料中真菌毒素控制，减少食品安全事故。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供抗氧化剂在消减动 物体内真菌毒素残留中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

抗氧化剂在提高解毒酶解毒活性中的应用，所述抗氧化剂选自槲皮素、芦丁或者茶多酚；所述解毒酶包括谷胱甘肽-S-转移酶、氨基转移酶、葡萄糖醛酸转移酶和磺基转移酶。

申请人通过研究发现槲皮素、芦丁或者茶多酚能够激活未染毒的对虾肠道中的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、葡萄糖醛酸转移酶(UGT)、磺基转移酶(SULT)或者氨基转移酶(AANAT)，因此，本发明首先保护槲皮素、芦丁或者茶多酚这些抗氧化剂在提高GST、UGT、SULT或者AANAT这些解毒酶的解毒活性中的应用。

另外，研究还发现对于槲皮素、芦丁或者茶多酚对已经感染真菌毒素的动物具有消减其体内真菌毒素的作用，因此，本发明还保护抗氧化剂在消减动物体内真菌毒素残留中的应用，所述抗氧化剂选自槲皮素、芦丁或者茶多酚；所述真菌毒素选自T-2毒素、DON毒素、OTA毒素中的一种、两种或者两种以上。

同时，研究还发现槲皮素、芦丁或者茶多酚能够提高已经感染真菌毒素的动物的生长特性，因此本发明还保护抗氧化剂在提高动物生长特性中的应用，所述抗氧化剂选自槲皮素、芦丁或者茶多酚。

优选地，所述动物为水产动物；具体地，所述水产动物为对虾。

实验数据表明：T-2毒素在对虾肌肉残留量最高峰为18.02±2.41ng/g；采用饲料中添加量为1.6％(质量比)的槲皮素，可使对虾肌肉中的T-2毒素残留量消减60.56±5.77％；优选地，T-2毒素与槲皮素的用量比是每公斤饲料10.8～16.2mg：8.0～16.0g时，槲皮素对T-2毒素有较好的消减作用。

采用饲料中添加量为2.4％(质量比)的芦丁，可使对虾肌肉中的T-2毒素残留量消减84.26±6.34％；优选地，T-2毒素与芦丁的用量比是每公斤饲料10.8～16.2mg：12.0～24.0g时，芦丁对T-2毒素有较好的消减作用。

采用饲料中添加量为0.64％(质量比)的茶多酚，可使对虾肌肉中的T-2毒素残留量消减77.63±5.32％；T-2毒素与茶多酚的用量比是每公斤饲料16.2～24.3mg：3.2～6.4g时，茶多酚对T-2毒素有较好的消减作用。

DON毒素在对虾肌肉残留量最高峰为11.55±1.05ng/g；采用饲料中添加量为3.2％(质量比)的槲皮素，可使对虾肌肉中的DON毒素残留量消减48.90±3.47％；优选地，DON毒素与槲皮素的用量比是每公斤饲料20.3～30.4mg：16.0～32.0g时，槲皮素对DON毒素有较好的消减作用。

采用饲料中添加量为4.8％(质量比)的芦丁，可使对虾肌肉中的DON毒素残留量消减44.76±4.08％；优选地，DON毒素与芦丁的用量比是每公斤饲料20.3～30.4mg：24.0～48.0g时，芦丁对DON毒素有较好的消减作用。

采用饲料中添加量为0.64％(质量比)的茶多酚，可使对虾肌肉中的DON毒素残留量消减40.91±3.86％；优选地，DON毒素与茶多酚的用量比是每公斤饲料20.3～30.4mg：3.2～6.4g时，茶多酚对DON毒素有较好的消减作用。

OTA毒素在对虾肌肉残留量最高峰为11.19±0.96ng/g；采用饲料中添加量为0.4％(质量比)的槲皮素，可使对虾肌肉中的OTA毒素残留量消减37.39±2.58％；优选地，OTA毒素与槲皮素的用量比是每公斤饲料2.0～3.0mg：2.0～4.0g时，槲皮素对OTA毒素有较好的消减作用。

采用饲料中添加量为4.8％(质量比)的芦丁，可使对虾肌肉中的OTA毒素残留量消减39.47±2.54％；优选地，OTA毒素与芦丁的用量比是每公斤饲料4.5～6.8mg：24.0～48.0g时，芦丁对OTA毒素有较好的消减作用。

采用饲料中添加量为0.16％(质量比)的茶多酚，可使对虾肌肉中的OTA毒素残留量消减38.30±3.15％；优选地，OTA毒素与茶多酚的用量比是每公斤饲料3.0～4.5mg：1.6～3.2g时，茶多酚对OTA毒素有较好的消减作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过研究发现槲皮素、芦丁或者茶多酚能够激活未染毒的对虾肠道中的谷胱甘肽-S-转移酶、葡萄糖醛酸转移酶、氨基转移酶或者磺基转移酶，从而促进II相酶的生物转化，通过在对虾饲料中添加诱导剂来诱导染毒对虾肠道内源解毒酶的活性来加速对虾体内毒素的代谢，降低或清除毒素的残留，确保对虾食品安全。

具体实施方式

下面将结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。

本发明所述T-2、OTA和DON三种真菌毒素的检测方法可参考文献Wenshuo Sun,Zheng Hana,,Johan Aerts,et al.A reliable liquid chromatography tandem massspectrometry methodfor simultaneous determination of multiple mycotoxins infresh fi shand dried seafoods[J].Journal of Chromatography,2015,42-48。

实施例1诱导剂对真菌毒素的消减

一、待测真菌毒素染毒对虾

实验用凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei,L.vannamei，6.5±0.5g/尾)来自湛江东海岛养殖基地。运回实验室后置于装有约2/3体积海水的150L塑料箱中24h全天曝氧，每箱虾数35尾左右，温度控制在25℃左右，pH7.47～7.64，每天早上定时清除对虾养殖箱底的排泄物，更换1/3海水。之后分别于北京时间9：30时，15：30时与21：30时喂食对虾，每日饲喂量为对虾体重的5％，一日三次的投喂量分别为一日总量的20％、30％和50％，喂食暂养一周。

分别制备三种真菌毒素微胶囊毒饵料，试验采用剂量递增法染毒，以饲料中T-2、OTA和DON毒素含量分别为4.8、6.0和1.78mg/kg作为起始染毒剂量，每天染毒，4天为一周期，每期递增1.5倍，连续染毒20天，并设置空白对照。并于每天早上排污时收集对虾养殖箱中剩余饲料，烘干并称重。期间记录对虾的死亡情况和体重变化，并计算蓄积系数K值，同时收集每一期染毒对虾不同组织(肌肉、肝胰腺、肠道、虾头和血液)置于-80℃保存备用，用于后续Ⅱ相关键酶活(UGT、SULT、AANAT)和毒素残留的测定，并对每一期对虾肌肉、肝胰腺和肠道组织切片进行显微结构观察。

取适量对虾组织块(肌肉、虾头、肝胰腺和肠道)，称重，量取预冷的无菌生理盐水，生理盐水的体积总量是组织块重量的9倍，冰浴匀浆，转速为10,000r/min，制成10％的匀浆液，将此匀浆液4℃，2500r/min，离心15min，取离心上清液用于酶活的测定。同时测定上清液中蛋白质含量，采用考马斯亮蓝G-250法，以牛血清白蛋白为标准蛋白，测定方法参照Bradford法。

对虾血液和组织(肌肉、虾头、肝胰腺和肠道)的GSTs酶活测定根据南京建成试剂盒说明进行；UGT、SULT和AANAT酶活的测定根据上海颖心实验设备试剂盒说明进行。

二、制备含诱导剂的饲料

制备含诱导剂的饲料，添加诱导剂(槲皮素、芦丁和茶多酚)到对虾饲料中。诱导剂的添加量也按照递增原则，其中槲皮素的初始添加量为饲料量的0.2％(质量分数)，芦丁为0.3％(质量分数)，茶多酚为0.04％(质量分数)，添加到饲料中的量按照2倍量递增，4天为1个周期，连续饲喂20天，并设置空白对照组对虾，进行诱导试验，分别收集每一期试验对虾不同组织(肌肉、肠道)置于-80℃保存备用，用于Ⅱ相关键酶活(UGT、SULT、AANAT)的测定Ⅱ相关键解毒酶活。

(1)采用LC-MS/MS检测递增剂量染毒对虾不同组织器官中毒素残留，结果为：肌肉中真菌毒素残留最高数值分别T-2为51.89ng，OTA为32.21ng，DON为11.55±1.03ng。

(2)三种毒素对对虾肠道三种解毒酶的抑制效应

跟未染毒对虾相比，T-2毒素、OTA、DON主要抑制对虾肠道中UGT/SULT/AANAT，最大抑制幅度分别为51％/81％/87％；58％/68％/76％；71％/27％/42％。

(3)诱导剂对虾肠道三种解毒酶的激活效应

诱导剂槲皮素、芦丁、茶多酚对未染毒对虾肠道中UGT/SULT/AANAT的激活最大幅度(相对于对照组)分别为2.5倍/3.1倍/3.7倍；2.6倍/4.3倍/3.8倍；2.7倍/4.6倍/3.7倍。

(4)基于对虾肠道三种解毒酶的诱导剂激活与四种毒素抑制作用的拮抗效应

在此基础上，诱导剂(饲喂含诱导剂的饲料)对不同毒素染毒对虾肠道中的解毒酶诱导幅度有所提升，设未加诱导剂的染毒组为对照组。具体结果如下：

a.诱导剂槲皮素(饲喂第16d)激活染毒T-2毒素、OTA、DON的对虾肠道中UGTSULTAANAT解毒酶的最大幅度分别达4.6倍/7.6倍/7.7倍；3.7倍/5.2倍/9.0倍(短期4天即达到最大)；2.9倍/4.9倍/4.1倍。

b.诱导剂芦丁(饲喂第16d)激活染毒T-2毒素、OTA、DON的对虾肠道中UGTSULTAANAT解毒酶的最大幅度分别达3.4倍/5.1倍/4.9倍；2.4倍/4.2倍/3.2倍；4.6倍/6.9倍/6.7倍。

c.诱导剂茶多酚(饲喂第20d)激活染毒T-2毒素、OTA、DON的对虾肠道中UGTSULTAANAT解毒酶的最大幅度分别达3.0倍/4.8倍/4.6倍；3.3倍/4.9倍/4.8倍；4.6倍/6.9倍/6.7倍。

(5)诱导剂激活与三种毒素抑制的拮抗效应下对虾肌肉中三种毒素残留下降幅度对于染毒的对虾，后期喂养不同组别的饲料，分别是含诱导剂的毒饵料和不含诱导剂的毒饵料(设定对照组)，最后结果显示染毒对虾的肌肉中毒素残留下降幅度分别为：

a.诱导剂槲皮素与三种毒素拮抗并激活肠道三种解毒酶后，肌肉中T-2毒素、OTA、DON残留量消解率最高达60％、66％(短期有效)、49％。

b.诱导剂芦丁与三种毒素拮抗并激活肠道三种解毒酶后，肌肉中T-2毒素、OTA、DON残留量消解率最高达84％、87％、45％(仅长期有效)。

c.诱导剂茶多酚与三种毒素拮抗并激活肠道三种解毒酶后，肌肉中T-2毒素、OTA、DON残留量消解率最高达78％、40％(仅长期有效)、49％。

实施例2诱导剂对对虾生长特性的影响

三种真菌毒素递增剂量染毒试验过程中，每天早上收集对虾剩余饲料，烘干。并于暴露的每一期结束后测定对虾体重并计算摄食率(FR)、增重率(WG)、特定生长率(SGR)，计算公式如下：

摄食率(FR，％W·d^-1)＝100×F/d/[((W₀+W_i)/2]

增重率(WG，％)＝[W_i-W₀]/W₀

特定生长率(SGR，％)＝100×[lnW_i-lnW₀]/d

式中F-总食物摄取量，干重，g；d-天数，天；W-试验对虾体重，湿重，g；W₀-试验对虾初始体重，湿重，g；W_i-试验开始第i天对虾的体重，湿重，g。

存活率考察：在20天递增染毒试验中，对照组对虾的存活率始终在90％以上，而T-2毒素染毒组对虾在第5～8天时存活率为84.76％，低于90％，之后一直呈现下降趋势，试验结束时存活率仅为49.52％，死亡数量过半；DON染毒组对虾试验结束时存活率为47.62％，低于最初数量的一半。OTA染毒组在染毒最后阶段的存活率为58.10％，即死亡率未超过初始数量的一半。

增重率和特定生长率考察：T-2毒素染毒组对虾的增重率和特定生长率随着试验的进行明显低于对照组。试验过程中T-2毒素染毒组对虾达到最低特定生长率为0.64％。DON染毒组对虾的增重率变化速率越来越慢，与对照组相差越来越大。DON染毒组对虾的特定增长率后期几乎无变化，整个试验过程的特定生长率一直低于对照组。OTA染毒组对虾的增重率一直在升高，但增重速率没有持续升高，对虾生长较缓慢。对虾的特定生长率在0.50～0.90％之间变化，低于对照组的对虾。

摄食率考察：对照组对虾的摄食率一直维持在4％以上，而T-2毒素染毒组对虾的摄食率一直在下降。DON染毒组对虾的摄食率一直下降至2.75％左右，这与对虾的增重率变缓的趋势一致，且随着染毒量的积累，即染毒时间的增加，试验组与对照组的摄食率相差越来越大。对虾每天的饲喂量为其体重的5％，而OTA染毒对虾组的摄食率在3.50％范围内波动，摄食率降低。

诱导剂对对虾生长特性指标结果见表1，相较于对照组，槲皮素、芦丁和茶多酚组对虾存活率、增重率、特定生长率和摄食率均有一定程度的下降，槲皮素组下降幅度最小，接近于正常对照组。

诱导剂和毒素共同作用组能够提高养殖对虾的存活率，试验初期，诱导剂和毒素共同作用组对虾相对存活率变化不大，在1.00左右，随着试验的进行，二者共同作用组存活率逐渐高于对照，在染毒结束时，槲皮素-AFB₁和茶多酚-AFB₁组对虾相较于AFB₁染毒组存活率均为1.77。

上面结果表明诱导剂和毒素共同作用对对虾的增重率影响不大，除了茶多酚-T-2组对虾在试验第五周期时相对增重率降低，为0.95，其他共同作用组对虾的增重处于稳定状态。

在染毒初期时，诱导剂作用于染毒对虾，T-2毒素染毒组对虾相对特定增长率最低，在0.58～0.66范围，诱导剂和DON以及OTA毒素共同作用组对虾的相对特定生长率在0.90～1.14范围内变动，随着试验的进行，三种诱导剂和T-2毒素共同作用组对虾的相对特定生长率逐渐升高，而其他毒素和诱导剂联合组对虾的相对特定增长率保持稳定。

对于摄食率，诱导剂和毒素共同作用组，三种诱导剂对OTA毒素染毒对虾的摄食率影响最大，提高了毒素作用组对虾的摄食率，其他组变化不大。

表1递增剂量法染毒真菌毒素对对虾生长指标的影响