禾本科种子当代基因型快速鉴定方法

摘要

本发明涉及禾本科种子当代基因型快速鉴定方法，包括种子处理、种子基因组DNA提取与鉴定及目的基因的扩增与检测等步骤。本方法能在种子时期即快速获得单粒种子基因组DNA，操作简单且安全。采用本方法不仅在种子时期即可鉴定种子的基因型，获得所需基因型种子用于后续研究，减少苗期田间种植工作量，提高育种效率，而且不损害含胚种子的后续生长发育，可长久保存，亦可用于组培。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及遗传育种领域，具体地说，涉及一种禾本科种子当代基因型快速鉴定方法。

背景技术

分子标记辅助选择(Marker-assisted Selection，缩写为MAS)是将分子标记应用于作物改良过程中进行选择的一种辅助手段(Ribaut J M，Hoisington D(1988)Marker-assisted selection:new tools and strategies[J].Trends in Plant Sci.3:236-239)。其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离关系的分子标记对受选个体进行目标区域以及全基因组筛选，从而减少连锁冗余，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的(Lee M(1995)DNA markers in plant breeding programs[J].Adv Agron.55:265-344)。与表型性状和同工酶标记进行个体选择相比，分子标记辅助选择具有以下特点：(1)直接反映DNA的序列差异，不受环境对基因表达的影响，结果可靠性强；(2)标记位点丰富，遍布于整个基因组，可选择性更多；(3)许多标记是共显性标记，不受杂交方式的影响；(4)不受植物的生长发育阶段及环境条件的影响，加快了育种进程；(5)标记形式多样，有RFLP标记、RAPD标记、AFLP标记、SSR标记、SCAR标记、STS标记等。分子标记由于其具有传统育种的表型标记所不具备的优点，所以在植物新品种的选育中得到了广泛应用(李海渤(2002)分子标记辅助选择技术及其在作物育种上的应用.河北职业技术师范学院学报.4:16)。

进行分子标记辅助选择的前提是先制备植物基因组DNA，传统的提取单株植物基因组DNA的方法一般都是先将植物种子在温室或田间培养至幼苗，然后采集植物幼苗的叶片进行DNA提取，这种方法存在很多问题，如操作程序复杂、耗时长、取样麻烦、工作量大，这样就大大的加大了筛选成本。目前，利用种子籽粒提取植物基因组DNA的研究虽有报道，但大部分是破坏性的方法，籽粒被完全破坏，无法继续用于后续种植、诱导等。若能在不破坏种子籽粒活力的情况下提取种子DNA，就能在种子当代利用MAS进行快速、高效的鉴定和筛选，最后将大量的不含目的基因的后代籽粒剔除，而将含目的基因的后代直接用于种植、诱导等后续选育工作，这样将大大提高工作效率，减少人力、物力的浪费。

发明内容

本发明的目的是提供一种禾本科单粒种子胚乳DNA的提取方法。

本发明的另一目的是提供禾本科种子当代基因型快速鉴定方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的禾本科单粒种子胚乳DNA的提取方法，包括以下步骤：

1)切取胚乳：单粒种子去壳后，在种子1/3-1/2处横向切取胚乳，将胚乳置于离心管(2mL Eppendorf管)中；将取样后的含胚种子置于另一离心管中，对应编号，室温下干燥保存；

2)浸泡：向含有胚乳的离心管中加入0.5-1mL蒸馏水，室温浸泡2-5d(优选3d)；

3)打碎：将浸泡后的胚乳吸干蒸馏水，加入2×CTAB液0.8-1mL，然后用搅碎机打碎；

4)水浴：将打碎后的胚乳置于60-68℃水浴中30-60min，期间颠倒混匀数次；

5)离心：将水浴后的提取液离心上清转移至另一离心管中；

6)沉淀：向上清中加入0.8-1倍上清体积的异丙醇，颠倒混匀，然后于-20--80℃放置10-30min；然后离心收集沉淀；

7)洗涤：沉淀用75％乙醇洗涤后离心，收集沉淀；

8)溶解：待DNA干燥后，加入蒸馏水溶解；-20℃冰冻保存或直接用于后续实验；

9)鉴定DNA质量。

步骤5)是将水浴后的提取液以12000rpm离心15min，取上清。

步骤6)是向0.8mL上清中加入0.8倍上清体积的异丙醇，颠倒混匀，然后于-20℃放置10min以上；然后于4℃，12000rpm离心10min，收集沉淀。

步骤7)是向沉淀中加入0.5mL的75％乙醇，颠倒数次；然后于4℃，8000rpm离心5min，收集沉淀。

步骤8)用100μL蒸馏水溶解DNA。

本发明进一步提供一种禾本科种子当代基因型快速鉴定方法，以上述方法提取的禾本科单粒种子胚乳DNA为模板，根据目的基因设计特异性引物，进行PCR扩增，分析扩增产物，从而进行基因分型。

在本发明的一个具体实施方式中，以水稻隐性核雄性不育系1907及其回交材料为例，该隐性核雄性不育系(M1907)是由于细胞色素P450基因CYP704B2缺失2bp，导致其功能丧失，从而导致隐性核雄性不育系。根据目的基因--细胞色素P450基因CYP704B2，设计PCR引物，序列如下(SEQ ID NO:1-2)：

1907-F:5′-GCAAGGTCGGGTTTGGGGTTG-3′

1907-R:5′-AAGGTCGGGTTTGGGGTTG-3′

PCR反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性30sec，70℃退火延伸55sec，30次循环；72℃延伸10min，20℃保温10min，反应结束后4℃保存。

将扩增产物加样至10％的变性PAGE胶上，在55mA条件下电泳100-120min，根据电泳结果分析PCR扩增产物。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(一)采用本方法能在种子时期即快速获得单粒种子基因组DNA，操作简单且安全。

(二)本方法提取单粒种子基因组DNA所用材料为1/3-1/2的单粒种子胚乳，不需要将种子种植后取新鲜的叶片为材料再提取DNA，节省人力、物力、时间。

(三)采用本方法提取单粒种子基因组DNA，胚乳经过浸泡2-5d后就可以用快速样品制备机打碎，不需要用液氮及人工研磨，安全、简单、方便。

(四)采用本方法不仅在种子时期即可鉴定种子的基因型，且不损害种子的后续生长发育，可长久保存，亦可用于组培(诱导愈伤、进行遗传转化、直接出苗等)。

附图说明

图1为本发明实施例3中胚乳基因组DNA电泳结果。其中，M：DL15000DNA Ladder；1-21：单粒胚乳提取的DNA。

图2为本发明实施例4中1907-BC2F2基因型鉴定结果。其中，-：ZH11叶片DNA；+：M1907叶片DNA；1-20：处理3d的1907-BC2F2单粒胚乳DNA。

图3为本发明实施例4中不同处理时间的1907-BC2F2种子样品基因型鉴定结果。其中,1-6：处理1d的1907-BC2F2单粒胚乳DNA；7-12：处理2d的1907-BC2F2单粒胚乳DNA；13-24：处理3d的1907-BC2F2单粒胚乳DNA。

图4为本发明实施例5中检测DNA样品的PCR法灵敏度实验结果。其中，DNA1、DNA2、DNA3：处理3d的1907-BC2F2不同单粒胚乳DNA；1-9：模板按0倍、10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍的梯度稀释。

图5为本发明实施例6中筛选所得阳性样品对应的含胚种子组织培养结果，筛选所得含胚种子在诱导培养基上诱导20d。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中所用的水稻种子来自于单粒种子隐性核雄性不育系1907的BC2F2代种子，该隐性核雄性不育系(M1907)是由于细胞色素P450基因CYP704B2缺失2bp，导致其功能丧失，从而导致隐性核雄性不育系。旨在从BC2F2群体中筛选获得纯合的突变种子。

实施例1种子处理

具体方法如下：

1、去壳：将单粒种子去除颖壳；

2、切取胚乳：单粒种子去壳后，用小刀在种子1/3-1/2处横向切取胚乳，将胚乳置于2mL离心管中，含完整胚部分置于另一离心管中，对应编号，室温下干燥保存；

3、浸泡：加0.5-1mL蒸馏水至步骤2)胚乳中，室温浸泡3d。

对比例1种子处理

具体方法如下：

1、去壳：将单粒种子去除颖壳；

2、切取胚乳：单粒种子去壳后，用小刀在种子1/3-1/2处横向切取胚乳，将胚乳置于2mL离心管中，含完整胚部分置于另一离心管中，对应编号，室温下干燥保存；

3、浸泡：室温保存。

对比例2种子处理

具体方法如下：

1、去壳：将单粒种子去除颖壳；

2、切取胚乳：单粒种子去壳后，用小刀在种子1/3-1/2处横向切取胚乳，将胚乳置于2mL离心管中，含完整胚部分置于另一离心管中，对应编号，室温下干燥保存；

3、浸泡：加0.5-1mL蒸馏水至步骤2)胚乳中，室温浸泡1d。

对比例3种子处理

具体方法如下：

1、去壳：将单粒种子去除颖壳；

2、切取胚乳：单粒种子去壳后，用小刀在种子1/3-1/2处横向切取胚乳，将胚乳置于2mL离心管中，含完整胚部分置于另一离心管中，对应编号，室温下干燥保存；

3、浸泡：加0.5-1mL蒸馏水至步骤2)胚乳中，室温浸泡2d。

实施例2种子胚乳DNA提取

具体方法如下：

1、打碎：将不同处理后的胚乳吸干蒸馏水，加入2×CTAB液1mL，加一粒直径为5-6mm小钢珠，然后在快速样品制备机(MP公司FastPrep-24)上打碎，每次启动30sec，共打碎2-4次；

2、水浴：将打碎后的胚乳置于水浴锅中进行水浴，65℃，30-60min，期间颠倒混匀数次；

3、离心：将水浴后的提取液离心，12000rpm，15min，取0.8mL上清至新的离心管中；

4、沉淀：向上清中加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀，低温(-20℃)保存10min；4℃，12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀；

5、洗涤：向沉淀中加入0.5mL的75％乙醇，颠倒数次；4℃，8000rpm离心5min，弃上清，留沉淀；

6、溶解：待DNA干燥后，加入100μL的水溶解DNA，-20℃冰冻保存或直接用于后续实验。

处理3d(实施例1)后的样品打样时样品很容易打碎，且按上面的步骤提取DNA后，能看到明显的丝状DNA。但不经浸泡处理(对比例1)及浸泡处理1d(对比例2)的胚乳仅磨破一点种皮或呈颗粒状，处理2d(对比例3)后的样品比处理1d(对比例2)后的样品容易打碎，但仍呈小颗粒状，且提取DNA后，处理0-2d的样品均未看到明显的丝状DNA。

实施例3基因组DNA质量鉴定

吸取提取的单粒胚乳DNA溶液5μL和上样缓冲液(中科瑞泰)1μL进行混合，然后吸取混合后的样品和Maker(中科瑞泰)各5μL点到1％琼脂糖凝胶制成的点样孔中，350mA下电泳25min。结果见图1，处理3d的DNA条带清晰可见，杂质少，说明应用本发明方法提取的单粒胚乳DNA质量好、浓度高、纯度高。处理0-2d的DNA没有明显条带。测量处理3d的DNA浓度为110-130ng/μL，其OD260/OD280值介于1.9-2.0之间，表明按本发明提取DNA样品中含有少许RNA样品，这与未消化RNA有关，但并不影响PCR扩增效果。

实施例4基因型鉴定

分别以ZH11叶片提取的DNA(阴性对照)、M1907叶片提取的DNA(阳性对照)和不同处理的1907-BC2F2胚乳提取的单粒胚乳DNA(样品)为模板(0d处理未提取到DNA，因此未进行PCR)，1907-F和1907-R为引物进行PCR扩增，ZH11叶片、M1907叶片提取的DNA扩增产物大小分别为133bp和131bp。引物序列如下：

1907-F:5′-GCAAGGTCGGGTTTGGGGTTG-3′

1907-R:5′-AAGGTCGGGTTTGGGGTTG-3′。

PCR扩增反应体系：总体积20μL

PCR反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性30sec，70℃退火延伸55sec，30次循环；72℃延伸10min，20℃保温10min，反应结束后4℃保存。

取2μL扩增产物加样至10％的变性PAGE胶上，在55mA条件下电泳100-120min。

结果见图2和图3，在处理3d的1907-BC2F2群体中可分别检测到野生型条带(133bp)，杂合条带(133bp和131bp)以及突变体纯合条带(131bp)，处理1-2d的DNA没有扩增出条带。结果表明，采用本发明方法提取的单粒种子胚乳DNA作为模板进行的PCR扩增，扩增产物的目的条带清晰，没有杂带和杂质，即应用本发明提取的胚乳DNA浓度高、质量高、纯度好，完全符合分子生物学的要求，可以用于分子标记辅助选择及其他分子生物学实验。

实施例5PCR法的灵敏度实验

随机选取3个处理3d的1907-BC2F2胚乳提取的单粒胚乳DNA(DNA1、DNA2、DNA3)为模板，将模板进行10倍的梯度稀释，然后按实施例3的方法进行PCR扩增，测其最低检测限。

取5μL扩增产物加样至1％的琼脂糖凝胶上，在150mA条件下电泳11-15min。

结果见图4，按本方法提取的3个DNA样品经梯度稀释后分别进行PCR，产物电泳扩增条带亮度逐渐减弱，稀释10⁴的样品仍可以扩增出较亮条带，但稀释10⁵的样品亮度偏弱，不适于进行电泳检测。因此，以该DNA作为模板的PCR反应的灵敏度可达0.1ng/μL，即可检测出约2ng的水稻DNA，检测灵敏度高。

实施例6含胚种子的后续用途

将筛选阳性的种子对应挑选含胚部分种子，进行诱导愈伤，诱导20d后，愈伤多且质量好(图5)。说明采用本方法不仅在种子时期即可鉴定种子的基因型，且不损害种子的后续生长发育，可长久保存，亦可用于组培(诱导愈伤、进行遗传转化、直接出苗等)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。